Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Bu araştırma hibe NIH K01HL133520 (PS) ve K12HD055882 (PS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Joanna Floros ozon pozlama deneyleri ile yardım için teşekkür ederiz.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Penn State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirilmesi
<ol><li>Düzgün bir erkek C57BL/6 fare (8 – 9 haftalık) kullanarak Machholz ve ark.10içinde açıklanan tek el fare kısıtlama tekniği dizginlemek.</li>
	<li>Steril plastik pipet 10 μL ultra saf su ile doldurun.</li>
	<li>Plastik pipet ucu vajina içine tanıtmak.</li>
...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MikroRNA profil oluşturma hastalık tanı ve mekanik araştırma için avantajlı bir tekniktir. Bu makale, ozon için farklı estrous döngüsü aşamaları içinde maruz dişi farelerin akciğerlerde inflamatuar genler düzenleyen tahmin edilmektedir miRNAs ifade değerlendirmek için bir protokol tanımlı. Yöntemleri gibi görsel algılama yöntemi, estrous döngüsü belirlenmesi için açıklanan16olmuştur. Ancak, bu tek seferlik ölçümler güveniyor ve bu nedenle güvenilir değildir. ...

mikroRNA (miRNAs) çoğu kısa (19-25 nukleotid), doğal olarak meydana gelen, kodlamayan RNA molekülleri. MiRNAs dizisi evrimsel türlerin fizyolojik fonksiyonları1düzenlenmesinde miRNAs önemini telkin, karşıdan karşıya korunmuş. mikroRNA ifade profil oluşturma işlemleri, bağışıklık yanıtı, hücre farklılaşması, gelişimsel süreçleri ve Apoptozis2de dahil olmak üzere çeşitli Yönetmelikte önemli miRNAs belirlemek için yardımcı olmak için kanıtlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, miRNAs potansiyel kullanımları hastalığı teşhis ve tedavi için kabul edilmiştir. Özellikle miRNA bilgi mRNA profil oluşturma ve diğer genom ölçekli veri3ile birleştirildiğinde gen düzenlemesi mekanizmaları eğitim araştırmacılar için miRNA ifade ölçme sistemleri düzey modelleri düzenleyici işlemlerin aydınlatmak olabilir. Öte yandan, miRNAs mRNA'ların örnek türleri bir dizi daha kararlı olmak da gösterilmiş ve aynı zamanda protein4' ten büyük hassasiyetle ölçülebilir. Akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli moleküler tanı uygulamaları için biyolojik olarak miRNAs gelişiminde büyük ilgi yol açmıştır.
Akciğer miRNAs gelişimsel süreçleri ve homeostasis bakımında önemli rol oynarlar. Ayrıca, onların anormal ifade gelişme ve ilerleme çeşitli göğüs hastalıkları5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hava kirliliği tarafından indüklenen inflamatuar akciğer hastalığı büyük önem ve hormonlar ve estrous döngüsü akciğer doğuştan gelen bağışıklık ve miRNA ifade yanıt çevre sorunları olarak düzenleyen gösteren dişilerde yoksul prognoz göstermiştir 6. bu protokol için biz edinilmiş bağışıklığın yokluğunda oluşur dişi farelerde akciğer iltihabı şeklinde ikna etmek için hava kirliliği önemli bir bileşenidir, ozon pozlama kullanın. Ozon kullanılarak, hava yolu epitel hücre hasarı ve nötrofil artış ve proksimal airways7inflamatuar aracılar ile ilişkili hava yolu hyperresponsiveness gelişimi inducing. Şu anda değil karakterize ve ozon günese maruz kalan farelerde estrous döngüsü boyunca miRNAs analiz için iyi tarif protokolleri vardır.
Aşağıda, estrous döngüsü aşamaları ve ozon için maruz dişi farelerin akciğer dokusunda miRNA ifade tanımlamak için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca miRNA bulma ve hedef tanımlama, İşlemsel Biyoloji üzerine vurgu ile etkili Biyoinformatik yaklaşımlar ele. Biz limma, gen ifade deneyler8verileri analiz etmek için tümleşik bir çözüm sağlar bir R/Bioconductor yazılım kullanarak Mikroarray veri analiz. Analizini PCR dizi verileri limma diziler/örnekler az sayıda ifade karşılaştırmak için kullanırken t-test dayalı prosedürleri güç açısından avantaj vardır. MiRNA ifade sonucu biyolojik bağlamında anlamak için o zaman fonksiyonel analiz yazılımını kullanmıştır. Transkripsiyon değişiklikleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için ve olası sonuçları tahmin etmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı miRNA-ifade veri kümeleri ve bilgi edebiyat9birleştirir. Bu sadece miRNAs kümeleri için üst üste yapılan istatistiksel zenginleştirme arayın yazılım ile karşılaştırıldığında bir avantajdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

MikroRNA (miRNA) profil oluşturma biyoloji ve tıp çeşitli araştırma alanlarında çalışan araştırmacıların ilgi haline gelmiştir. Mevcut çalışmalar tanı ve akciğer hastalıkları Bakımı miRNAs kullanarak gelecekteki bir umut verici göster. Burada, biz miRNA inflamatuar bir ozon kaynaklı hava yolu iltihabı fare modeli akciğer dokusundan genlerinde düzenleyen tahmin miRNAs bir grup göreli bolluk ölçmek için profil oluşturma için bir iletişim kuralı tanımlar. Çünkü seks hormon düzeyleri dolaşan akciğer doğuştan gelen bağışıklık dişilerde Yönetmeliği etkileyebilir gösterilmiştir, bu yöntemin amacı protokolü dikkate alındığında estrous döngüsü dişi farelerde profil oluşturma bir enflamatuar miRNA tarif etmektir Her hayvan ozon pozlama zaman aşaması. Biz de limma, bir R/Bioconductor yazılım kullanarak miRNA bulma ve hedef tanımlama yöntemleri uygulanabilir Biyoinformatik yaklaşımlar adresi ve biyolojik bağlam ve yolları anlamaya fonksiyonel analiz yazılımı ile ilişkili fark miRNA ifade.

Smear içinde gözlenen farklı hücre tipleri fare estrous döngüsü aşamasını (Şekil 1) tanımlamak için kullanılır. Bunlar hücre morfolojisi tarafından tanımlanır. Proestrus sırasında neredeyse sadece kümeleri yuvarlak şekilli, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücresi (Şekil 1A) hücrelerdir. Fare estrus aşamasında olduğunda, cornified skuamöz epitel hücreleri, yoğun paketlenmiş kümelerinde (...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler

Burada biz akciğer ifade değerlendirmek için bir yöntem tarif tahmin edilmektedir miRNAs inflamatuar genler düzenleyen fare kullanarak ozon için maruz veya hava estrous döngüsünün farklı aşamalarında filtre.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Bu yöntem akciğer içinde inflamatuar genleri düzenleyen tahmin mikroRNA'ların ekspresyonunu değerlendirmek için nasıl akciğer-bağışıklık alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu teknik akciğer mikroRNA ekspresyonu dolaşan hormonların katkılarını belirlemek için basit bir yol sunuyor. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirmek için, sekiz ila dokuz haftalık bir dişi fareyi elle dizginleyin ve vajinaya ultra saf su yla dolu 10 mikrolitrelik plastik pipetin ucunu tanıtın.Bir numuneyi toplamak için 4-5 kez hafifçe yıkayın ve vajinal sıvının son floşkısmını cam bir kaydıranın üzerine yatırın. Sonra 20X büyütme bir ışık mikroskop altında lekesiz vajinal floş gözlemleyin. Ozon ve filtrelenmiş hava maruziyeti için, tel örgü kapaklı 1,2 litrelik cam kaplardan birine en fazla dört fare yerleştirin.Bir cam kabı ozon odasına, bir tanesini de filtrelenmiş hava maruziyet odasına koyun. Daha sonra ozon konsantrasyonu milyonda iki parçaya ayarlayın ve üç saat sonra kabı nı çıkartın. Maruz kaldıktan dört saat sonra, ilk deneysel farenin maruz kalan deri yüzeyini %70 etanol ile dezenfekte edin ve kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.Sıvı nitrojen bir 1.5 mililitreR-free RNase-free mikro santrifüj tüp batırmak için forceps kullanın ve sıvı azot hasat akciğer hızlı dondurma. Sonra tüm akciğer mascerate için paslanmaz çelik doku pulverizer kullanın ve iki 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler arasında pulverize doku bölünmüş. Aynı şekilde tüm hayvanların akciğerleri hasat ve pulverizing sonra, her örnek için guanidinium tiyosiyanat 500 mikrolitre ekleyin ve sırayla 18, 21 ve 23 gauge iğneler ile her doku homojenize.Son homojenizasyondan sonra, 15 saniye boyunca girdap lamadan önce her numuneye 500 mikrolitre etanol ekleyin. Karışımları santrifüj için tek tek toplama tüplerinde tek tek spin sütunlarına yükleyin ve akışları atın. DNase 1 tedavisi için, başka bir santrifüj için her kolona 400 mikrolitre RNA yıkama tamponu ekleyin ve RNase içermeyen tüplerde numune başına 5 mikrolitre DNase 1 ve 75 mikrolitre DNA sindirim tamponunu karıştırın.Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçka için doğrudan sütun matrisler karışımı ekleyin, iki 400 mikrolitre RNA ön yıkama çözeltisi santrifüj ile yıkar takip. RNA'yı eleştirmek için, son bir santrifüj için her sütun matrisine doğrudan 35 mikrolitre DNase RNase içermeyen su ekleyin ve her numunenin toplam RNA konsantrasyonunu ve saflığını bir spektrofotometrede ölçün. Sonra RNA'yı eksi 80 derecede saklayın.Küçük RNase retrotransktasyon için, örnek başına ters transkripsiyon reaksiyon karışımı bir tüp prewash çözeltisi 10 mikrolitre toplam RNA 200 nanogram ekleyin. Karıştırdıktan sonra, örnekleri kısaca santrifüj edin ve kuluçkaya yatıncaya kadar buza yerleştirin. Daha sonra, tüpleri 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından 95 santigrat derecede beş dakikalık kuluçka.İkinci kuluçka sonunda, 20 mikrolitre ters transkripsiyon reaksiyonu başına 200 mikrolitre RNase içermeyen su ile CDNA seyreltin ve önceden yüklenmiş bir fare inflamatuar yanıt ve otoimmünite mikroRNA PCR dizi her kuyuya her reaksiyon karışımı örnek 10 mikrolitre ekleyin. Proestrus evresi yuvarlak şekilli ve iyi biçimli çekirdekli epitel hücrelerinin varlığı ile tanımlanabilir. Fare estrus aşamasında yken, yaymada yoğun olarak paketlenmiş nükleatlı, mısırlaşmış ve skuamöz epitel hücreleri kümeleri gözlenir.Metestrus sırasında cornified epitel hücreleri ve polimorfonükleer lökositler görülür. Diestrus olarak, lökositler genellikle daha yaygındır. Dört fare akciğerinden çıkarılan RNA, gösterildiği gibi, mikrolitre başına 1198 ile 2178 nanogram arasında değişen nükleik asit konsantrasyonları ve 2,01 ile 2,02 arasında ortalama A260 ile A280 oranı ve 2,139 ile 2,223 arasında ortalama A260 ile A230 oranı gösterir.Bu tabloda ozon ve filtrelenmiş hava maruzfareler arasında mikroRNA ekspresyonunda iki kat değişiklikler gösterilmiştir. 14 mikroRNA için microRNA hedef filtresi ve çekirdek analizinden sonra, anlamlı ifade günlüğü oranı ve P değerleri elde etmek için bu veriler microRNA hedef filtresi ile eşlenebilir. Çekirdek analiz ayrıca kanonik yollar, hastalıklar ve fonksiyon, düzenleyiciler ve ağlar hakkında bilgi sağlar.Ayrıca, fonksiyonel analiz yazılımı ilgi ve diğer moleküllerin mikroRNA'lar arasındaki ilişkiyi gösteren bir ağ analizi üretmek için kullanılabilir. Bu yordamı denerken, bir denemeyi gerçekleştirmeden önce estrus döngüsünü günlük olarak en az üç ardışık döngü için denetlemek önemlidir. Bu prosedürü takiben, estrus döngüsü boyunca akciğer inflamatuar gen ekspresyonu ile ilgili ek soruları cevaplamak için başka yöntemler de yapılabilir.Bu teknik geliştikten sonra, akciğer bağışıklığı alanında diğer araştırmacılar ın diğer modelleri kullanarak seks hormonu düzenleme mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Akciğer ve Fareler immün Doku Örneklerinde Hasat ile kombinasyon Sağ Ventrikül Sistolik Basınç Ölçümleri

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...