Name: how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

وتلقى هذا المشروع تمويلاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) في إطار الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار البرنامج (منحة اتفاق n ° 685778). هذا العمل كان يدعمها مجلس بحوث العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الأحيائية (BBSRC، منح أرقام BB/M011186/1، BB/J014516/1). شكرا DB بسرك الدكتوراه التدريب الشراكة نيوكاسل-ليفربول-دورهام لسنهم وجامعة دورهام قسم العلوم للمساهمة نحو تمويل هذا العمل. ونحن نشكر إيان إدواردز لمساعدته، وإدارة "دورهام جامعة قسم من كيمياء الطيف الكتلي" التحليل الآلي العاشر البروتين. نحن ممتنون ل Ævarsson أرنثور لعمله مع الفيروس العاشر المشروع، والشكر أيضا إلى هاتي كلير ونانوتيمبير GmbH للإقراض ومساعدة مع نظام NT.48 بروميثيوس لهذا المشروع. أخيرا، شكرا لكم لفرانسيس جاوثروب والبذور [توزر] لدعمها كجزء من الجائزة إيكس بسرك.

1-إعداد نماذج البروتين
<ol><li>وضع الشاشات الاستقرار ك 500 ميليلتر مختبرين في كتل 96-جيدا وختم للتخزين. نقل 10 ميليلتر لكل شرط من شاشة الاستقرار في المقابل جيدا من صفيحة 96-جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات توفير الوقت (الشكل 4أ).</li>
	<li>إعداد مل 1 ملغ حوالي 1 مل-1 البروتين حل في نظام المخزن مؤقت ملائم. وبينما يختلف تكوين مخزن مؤقت للمناسبة مع كل عينة البروتين، المخزن مؤقت أول جيدة لمحاولة فوسفات الصوديوم 10 ملم مع 100 ملم كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 7.2. ملاحظة: تختلف تركيزات البروتين مقبول حالة بحالة، ولكن تركيز يتراوح من 0.5-5 ملغ مل-1 تنتج عادة منحنيات أناليزابل. المخازن المؤقتة لتمييع ينصح للاستخدام مع الشاشات الاستقرار لتجنب إخفاء آثار كل شرط. المخزن المؤقت نموذجية التراكيب هي حوالي 10 ملم المخزن المؤقت مع حوالي 100 مم كلوريد الصوديوم.</li>
	<li>إذا كان أداء تجربة حساب السياحة الفرعي، إضافة صبغة "اللون البرتقالي سيبرو" للعينة البروتين إلى نهائي تركز 20 x. مزيج أما انعكاس أو فورتيكسينج قصيرة.</li>
	<li>نقل 10 ميليلتر من الحل البروتين في كل بئر من لوحة 96-جيدا إعدادها في "الخطوة 1، 1" (الشكل 4ب).</li>
	<li>ختم والطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 2 دقيقة في 600 x ز لضمان عنصر البروتين عينة والشاشة هي مختلطة (الشكل 4ج).</li>
	<li>إعادة ختم الشاشة الاستقرار كتلة عميق جيدا وتخزين الشاشة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. تخزين الشاشة الملح في الظلام، كما أن بعض المكونات حساس.</li>
	<li>إذا كان أداء تجربة نانودسف، انتقل إلى الخطوة 2. إذا كان أداء تجربة حساب السياحة الفرعي، انتقل إلى الخطوة 4.</li>
</ol>2-إعداد نانودسف التجربة
<ol><li>تأكد من أن المعدات نظيفة، مع إيلاء اهتمام خاص لأي الغبار قرب رف عينة. إذا كان النظام يحتوي على مرآة باكسكاتيرينج، تنظيفه باستخدام الإيثانول وأنسجة خالية من الوبر.</li>
	<li>فتح درج عينة عن طريق الضغط على زر فتح درج . (الشكل 5ألف).</li>
	<li>تحميل الشعيرات الدموية مع حوالي 10 ميليلتر من كل بئر من لوحة 96-جيدا قبل لمس نهاية واحدة شعري في الحل، ثم وضعها في المناظرة الشعرية أصحاب رف عينة (الشكل 5ب). يجب الحرص على عدم تلويث الوسط من الشعيرات الدموية مع بصمات الأصابع، إلخ.، وهذا يمكن أن تتداخل مع قراءات الأسفار طوال التجربة.</li>
	<li>شل الشعيرات الدموية مع قطاع الختم المغناطيسي (الشكل 5ج).</li>
</ol>3-برمجة نانودسف التجربة
<ol><li>إطلاق مسح أولى للكشف عن موقف وكثافة كل شعري بالضغط على زر بدء التفحص الاكتشاف في علامة التبويب المسح الضوئي اكتشاف زيادة أو إنقاص قوة الإثارة الحادث من طاقة أولية بنسبة 10% حتى ذروة كل مسح الشعرية بين وحدات 4,000-12,000 (الشكل 5د).</li>
	<li>للتأكد من العينة يتم طيها وتركز بما فيه الكفاية، ينصح لمسح أولى تذوب بتدرج درجة الحرارة شديدة انحدار. في علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي ، تجربة البرنامج تذوب المسح الضوئي بواسطة تعيين الخيار المنحدر درجة الحرارة إلى 7.0 درجة مئوية دقيقة-1، تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية و نهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية، ثم الشروع في نانودسف بالضغط بدء انصهار زر. إذا كان الناتج عن ذوبان منحنيات لا تظهر نقطة انعطاف قابلة للكشف، والنظر في تركيز العينة كذلك أو التحقق إذا كان يتم طي البروتين بشكل صحيح.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.1-2.4 لإعداد العينات لإجراء تجربة كاملة.</li>
	<li>في علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي ، تجربة البرنامج تذوب المسح الضوئي بواسطة تعيين الخيار المنحدر درجة الحرارة إلى 1.0 درجة مئوية دقيقة-1، تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية و نهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية، ثم الشروع في نانودسف عن طريق الضغط على زر بدء ذوبان .</li>
</ol>4-القيام بتجربة حساب السياحة الفرعي
<ol><li>فتح درج العينة بالضغط بثبات المسافة البادئة في الجانب الأيمن من الدرج. ضع علبة 96-جيدا في النظام RT-PCR مع A1 جيدا إلى الخلف اليسار (الشكل 4د).</li>
	<li>انقر فوق الزر تجربة جديدة للبدء في إعداد تجربة حساب السياحة الفرعي.</li>
	<li>في علامة التبويب خصائص التجربة ، انقر فوق الخيار منحنى تذوب عندما سئل ما هو نوع من التجربة هل تريد إعداد؟ والخيار الآخر عندما سئل الكواشف التي تريد استخدامها للكشف عن تسلسل الهدف؟
</li>
	<li>في إعداد لوحة/تحديد الأهداف وعينات علامة التبويب، قم بإدخال اسم هدف ثم تعيين مراسل روكس و تقضي أي.</li>
	<li>في لوحة الإعداد/تعيين الأهداف وعينات ، قم بتعيين كل من لوحة 96-جيدا جيدا باسم الهدف الذي تم إدخاله في الخطوة السابقة. في علامة التبويب نفس، تعيين تحديد الصبغة لاستخدامها بمثابة إشارة سلبية أي.</li>
	<li>في علامة التبويب أسلوب تشغيل ، حذف الخطوات حتى يكون هناك ما مجموعة ثلاثة. تعيين الخطوة الأولى إلى 25.0 درجة مئوية، منحنى معدل 100%، في الساعة 00:05؛ والخطوة الثانية إلى 95.0 درجة مئوية، منحنى معدل 1%، الساعة 01:00؛ والخطوة الثالثة إلى 95.0 درجة مئوية، منحنى معدل 100%، الوقت 00:05. اختيار لجمع البيانات باستخدام القائمة المنسدلة تجميع البيانات أو عن طريق الضغط على أيقونة جمع البيانات (الشكل 6).</li>
	<li>تعيين حجم رد فعل للبئر الواحد إلى 20 ميليلتر.</li>
	<li>اضغط على زر بدء تشغيل لبدء التجربة حساب السياحة الفرعي.</li>
</ol>5-بيانات التحليل
<ol><li>اختر طول موجي لرسم منحنى تذوب مع. للتجارب نانودسف، ونسبة كثافة fluorescence 330 نيوتن متر و 350 نانومتر (المقابلة التربتوفان في البيئات القطبية ونونبولار، على التوالي)13 يستخدم عادة. لمعظم الثمرة، انبعاث صبغ الحد الأقصى مناسبة لرسم منحنى تذوب (الحد الأقصى الانبعاثات سيبرو البرتقالي هو 569 نيوتن متر)12.</li>
	<li>حساب القيمm T لكل شرط بتحديد نقاط الانعطاف لكل منحنى تذوب. معظم أنظمة نانودسف تلقائياً بحساب قيمm T بالتمايز العددية من منحنيات تذوب بعد الحصول على البيانات. إذا كان البرنامج المستخدم لا تلقائياً بحساب قيمm T، البرمجيات الحرة، والبديل يحركها واجهة المستخدم الرسومية مثل نامي11 يمكن أتمتة تحليل البيانات وتجهيز المصب، إعطاء الخيار لإنتاج heatmap يلخص Tm قيم للكامل التجربة 96-جيدا (الإشارة المصاحبة توفر الموارد والتوجيه لمعالجة البيانات مع نامي).</li>
	<li>مقارنة قيمm T لجميع الشروط التي شملتها الدراسة الاستقصائية. تحتوي شاشات الاستقرار على بئرين في كل شاشة (A1 و A2) التي تحتوي على الماء فقط. أخذ قيم الماء فقط كمعيار يسمح حساب قيمm ΔT، معالجة أخطاء منهجية، والسماح بمقارنة سهلة لتحقيق الاستقرار في الآثار. أعلى قيمm T تشير إلى ظروف استقرار حرارياً الذي يوصي باستخدام المتلقين للمعلومات. غالباً ما تظهر ظروف واعدة الاعتماد على تركيز في تحقيق الاستقرار بها.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+intracellular+processing+of+fusion+proteins+by+TEV+protease.">Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease.</a> Protein Expression and Purification. 19 (2), 312-318 (2000).</li><li>Cordingley, M. G., Register, R. B., Callahan, P. L., Garsky, V. M., Colonno, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+small+peptides+in+vitro+by+human+rhinovirus+14+3C+protease+expressed+in+Escherichia+coli.">Cleavage of small peptides in vitro by human rhinovirus 14 3C protease expressed in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 63 (12), 5037-5045 (1989).</li><li>Hjorleifsdottir, S., Aevarsson, A., Hreggvidsson, G. O., Fridjonsson, O. H., Kristjansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+genome+of+the+Rhodothermus+RM378+thermophilic+bacteriophage.">Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage.</a> Extremophiles. 18 (2), 261-270 (2014).</li><li>Alva, V., Nam, S. Z., S&#246;ding, J., Lupas, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MPI+bioinformatics+Toolkit+as+an+integrative+platform+for+advanced+protein+sequence+and+structure+analysis.">The MPI bioinformatics Toolkit as an integrative platform for advanced protein sequence and structure analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, 410-415 (2016).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> Methods in molecular biology. 1607, 17-50 (2017).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IUCr+Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+Thermofluor.">IUCr Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 69 (2), 209-214 (2013).</li><li>Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+purification+and+characterization+using+Thermofluor+screens.">Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens.</a> Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).</li><li>Kozak, S., Lercher, L., Karanth, M. N., Meijers, R., Carlomagno, T., Boivin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays.">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular NMR. 64 (4), 281-289 (2016).</li><li>Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Razgulyaev, O. I., Uversky, V. N., Gripas', A. F., Gilmanshin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+"molten+globule"+intermediate+state+in+protein+folding+by+a+hydrophobic+fluorescent+probe.">Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe.</a> Biopolymers. 31 (1), 119-128 (1991).</li><li>Gr&#248;ftehauge, M. K., Hajizadeh, N. R., Swann, M. J., Pohl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-ligand+interactions+investigated+by+thermal+shift+assays+(TSA)+and+dual+polarization+interferometry+(DPI).">Protein-ligand interactions investigated by thermal shift assays (TSA) and dual polarization interferometry (DPI).</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 71, 36-44 (2015).</li><li>Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYPRO+Orange+and+SYPRO+Red+Protein+Gel+Stains:+One-Step+Fluorescent+Staining+of+Denaturing+Gels+for+Detection+of+Nanogram+Levels+of+Protein.">SYPRO Orange and SYPRO Red Protein Gel Stains: One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detection of Nanogram Levels of Protein.</a> Analytical biochemistry. 239, 223-237 (1996).</li><li>Burstein, E. A., Vedenkina, N. S., Ivkova, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+the+location+of+tryptophan+residues+in+protein+molecules.">Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules.</a> Photochemistry and Photobiology. 18 (4), 263-279 (1973).</li><li>Haffke, M., Rummel, G., Boivineau, J., M&#252;nch, A., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoDSF:+label-free+thermal+unfolding+assay+of+G-protein-coupled+receptors+for+compound+screening+and+buffer+composition+optimization.">nanoDSF: label-free thermal unfolding assay of G-protein-coupled receptors for compound screening and buffer composition optimization.</a> Application Note NT-PR-008. , (2016).</li><li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoPlex:+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparsematrix+screening+of+chemical+space.">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparsematrix screening of chemical space.</a> Nature Methods. 12 (9), 859-865 (2015).</li><li>Laskowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDBsum:+summaries+and+analyses+of+PDB+structures.">PDBsum: summaries and analyses of PDB structures.</a> Nucleic Acids Research. 29 (1), 221-222 (2001).</li><li>Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S., Singh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li><li>Good, N. E., Izawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers.">Hydrogen ion buffers.</a> Methods in enzymology. 24, 53-68 (1972).</li><li>Ferguson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Analytical biochemistry. 104 (2), 300-310 (1980).</li><li>Welch, W. J., Brown, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+and+chemical+chaperones+on+protein+folding.">Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding.</a> Cell stress &amp; chaperones. 1 (2), 109-115 (1996).</li><li>Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+chaperones+regulate+molecular+chaperones+in+vitro+and+in+cells+under+combined+salt+and+heat+stresses.">Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses.</a> The Journal of biological chemistry. 276 (43), 39586-39591 (2001).</li><li>Yancey, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+osmolytes+as+compatible,+metabolic+and+counteracting+cytoprotectants+in+high+osmolarity+and+other+stresses.">Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (15), 2819-2830 (2005).</li><li>Garman, E. F., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocooling+and+radiation+damage+in+macromolecular+crystallography.">Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 32-47 (2006).</li><li>de Marco, A., Vigh, L., Diamant, S., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+folding+of+aggregation-prone+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+osmolytes,+plasmid-+or+benzyl+alcohol-+overexpressed+molecular+chaperones.">Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol- overexpressed molecular chaperones.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 329 (2005).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+data+bank.">The protein data bank.</a> Nucleic acids research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Bougouffa, S., Radovanovic, A., Essack, M., Bajic, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEOP:+A+database+on+osmoprotectants+and+associated+pathways.">DEOP: A database on osmoprotectants and associated pathways.</a> Database. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Fluorescent+Thermal+Stability+Assay+for+Membrane+Proteins.">Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Kung, C. E., Reed, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+molecular+rotors:+a+new+class+of+probes+for+tubulin+structure+and+assembly.">Fluorescent molecular rotors: a new class of probes for tubulin structure and assembly.</a> Biochemistry. 28 (16), 6678 (1989).</li><li>Iio, T., Itakura, M., Takahashi, S., Sawada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9-(Dicyanovinyl)julolidine+binding+to+bovine+brain+calmodulin.">9-(Dicyanovinyl)julolidine binding to bovine brain calmodulin.</a> Journal of biochemistry. 109 (4), 499-502 (1991).</li><li>Veros, C. T., Oldham, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lysozyme-ligand+binding+in+the+solution+and+gas+phases+by+electrospray+ionisation+mass+spectrometry.">Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (21), 3505-3510 (2007).</li><li>Kean, J., Cleverley, R. M., O'Ryan, L., Ford, R. C., Prince, S. M., Derrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+CorA+Mg2++transport+channel+from+Methanococcus+jannaschii+using+a+Thermofluor-based+stability+assay.">Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay.</a> Molecular membrane biology. 25 (8), 653-661 (2008).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallographica Section F. 68 (5), 596-600 (2012).</li><li>Morgan, H. P., Zhong, W., McNae, I. W., Michels, P. A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+pyruvate+kinases+display+evolutionarily+divergent+allosteric+strategies.">Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies.</a> Royal Society open science. 1 (140120), (2014).</li><li>Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aldehyde+dehydrogenase+1A3+complexed+with+NAD++and+retinoic+acid.">Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid.</a> Scientific reports. 6 (35710), (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وتشمل الجوانب الحاسمة ضمن البروتوكول خطوة الطرد المركزي وختم الصحيح من لوحة 96-جيدا لإجراء التجارب على حساب السياحة الفرعي (الخطوة 1، 5). الطرد المركزي يضمن الشرط عينة والشاشة البروتين تتلامس ومزيج. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم استخدام صفيحة الغلق لتجربة حساب السياحة الفرعي، هناك خطر كبير من المذيبات التبخر طوال هذه التجربة، ويسبب زيادة في تركيز العينة وزيادة فرصة لتجميع البروتينات سابق لأوانه.
الثمرة ونانودسف قابلة لمجموعة واسعة من عينات البروتين؛ يمكن أن تنتج الغالبية العظمى من العينات منحنيات تذوب التفسير مع صبغة مراسل المستندة إلى هيدروفوبيسيتي أو عن طريق نانودسف خالية من الصبغة. إذا كانت مصادر الأسفار القياسية ليست مناسبة للبروتين، تعديل أبسط للبروتوكول التي يمكن استكشافها هو خيار fluorophore. عدة الأصباغ البديلة يمكن أن تكون مناسبة لإجراء التجارب على حساب السياحة الفرعي. تشمل الأمثلة N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)، مركب فلوريسسيس بعد التفاعل مع ثيول27، و 4-(ديسيانوفينيل) جولوليديني (دكفج)، مجمع يختلف بالأسفار، على أساس تصلب بيئتها، وزيادة في الأسفار كعينة بروتين تتكشف28،29 (صبغ هذه الأخيرة غالباً ما يتطلب تركيزات عالية من العينة).
تتوفر طرق بديلة لتحليل منحنى تذوب إذا تم لا يحسب تلقائياً بالبرمجيات الصك. إذا كانت بيانات متجانسة وخطوة تمسخ واحدة فقط الظاهر في المنحنيات تذوب، يمكن تركيبها مجموعة بيانات مقتطعة إلى بولتزمان سينية بالمعادلة التالية:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg">
حيث F هي شدة الأسفار عند درجة حرارة T، ودقيقة وماكس كثافات الأسفار قبل وبعد الانتقال تمسخ، على التوالي، تيم هي درجة حرارة الوسط الانتقالية تمسخ وجيم هو المنحدر في تيم. بينما يعمل هذا الأسلوب جيدا لعمليات تمسخ خطوتين بسيطة، غير مناسب للمنحنيات المعقدة تذوب مع التحولات متعددة.
واحدة من المزايا الرئيسية لحساب السياحة الفرعي هو إمكانية الوصول إليها؛ يمكن إجراء تجارب السياحة في أي نظام RT-PCR مع المرشحات في الأطوال الموجية المناسبة لصبغ fluorescence المستخدمة. هذا بالإضافة إلى التكلفة المنخفضة للمواد الاستهلاكية، وسهولة التشغيل وكمية منخفضة نسبيا من البروتين اللازم، جعل حساب السياحة الفرعي تقنية قيمة لمجموعة واسعة من جداول المشروع، سواء في الصناعة والأوساط الأكاديمية.
كذلك تشير إلى ظروف مواتية المخزن المؤقت، تحتوي على شاشات بعض الآبار التي قد تعطي أدلة على وجود المعادن الهيكلية داخل بروتين عينة. هي الآبار التي قد تكون ذات أهمية خاصة في الشاشة الملح G6 ومجموعة ال 7، والتي تحتوي على يدتا 5 ملم و 5 ملم عطا، على التوالي. زعزعة استقرار حراري كبير في هذه الآبار قد يكون مؤشرا من أيونات المعادن الهامة في البروتين التي يتم عزلها قبل تشيلانتس. يمكن أن توفر المركبات داخل الشاشة أوسموليتي كما يحتمل أن تكون القرائن الدالة البروتين. العديد من المركبات في الشاشة تنتمي إلى فئات من جزيء التي ركائز مشتركة للإنزيمات. على سبيل المثال، استقرار عامة يوفرها السكريات (موجودة في الآبار A11-B10) ل lysozyme يمكن أن يعزى إلى على التشابه الهيكلي لركائز ثابتة للانزيم، N-أسيتيلجلوكوساميني ليغومرات30.
حساب السياحة الفرعي ونانودسف البروتوكولات المذكورة أعلاه يمكن تكييفها لدراسة تفاعلات البروتين-يجند أيضا. يمكن زيادة يغاندس التي تربط على وجه التحديد لبروتين استقرارها الحراري عن طريق إدخال التفاعلات الجديدة داخل المجمع. تحولاً إيجابيا تعتمد على الجرعة في البروتين Tm علامة واعدة التفاعل الناجح البروتين-يجند. السرعة والإنتاجية وانخفاض تكلفة فحص مكتبات مجمع مع الثمرة جعلت طريقة شعبية جداً في اكتشاف المخدرات في مرحلة مبكرة.
تحسين شروط المخزن المؤقت البروتينات المستهدفة ومجمعات يجند بها يمكن أن تكون ضرورية لنجاح المشروع، كما تدل على ذلك العديد من الأمثلة على الأدب31،32،،من3334. مع مقايسة نموذجية أخذ تحت ح 2، بما في ذلك وقت الإعداد، تمثل الثمرة ونانودسف مقترنة بشاشات الاستقرار تقنية سريعة وغير مكلفة للمخزن المؤقت لتحسين الأداء.

العديد من الإنزيمات المفيدة زراعتها تأتي من مصادر الفيروسية، مثل التبغ أحفر حوزتي الفيروس (TEV)1 واكتب رهينوفيروس البشرية مبطلات ج 3 (HRV ج 3)2. المشروع (الشكل 1) فيروس Horizon2020-X3. ويهدف هذا البرنامج (أ) توسيع نطاق خصائص الأسر الإنزيم المعروف و (ب) لتوصيف الإنزيمات رواية دالة غير معروفة حتى الآن (إنزيم X). تصميم بنية بلورية يلعب دوراً محوريا في توصيف البروتين المستهدف، خاصة في تلك الحالات حيث قد تطورت تسلسل البروتين بعد اعتراف4. البروتين الاستقرار عامل رئيسي في عملية بلورة؛ يجب أن تكون عينات متجانسة كونفورماتيونالي والصوت هيكلياً على مدى فترة من الزمن بشكل عالي الجودة، ديفراكتينج بلورات. وعلاوة على ذلك، من الضروري لفحوصات نشاط البروتينات الموجودة في تلك المطابقة النشط، الذي يمكن أن تيسره أيضا مناخا جزيئية.
على الرغم من التطور في التكنولوجيا المتاحة لانقسامها، تبلور البروتينات تظل عملية تجريبية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة5. أولى التجارب الفيزيائية الحيوية لتحسين ثبات البروتين في الحل تعطي وضوح نقطة انطلاق أفضل لبلورة البروتينات وتستهلك عادة سوى كمية صغيرة نسبيا من البروتين العينة6،7، 8،9. عدد كبير من البروتينات المستهدفة دراستها في هذا المشروع يقتضي أيضا فحوصات الاستقرار للتحجيم، والفائق. هو واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لتوصيف الفيزيائية قبل بلورة البروتينات المقايسة التحول الحراري (يعرف أيضا باسم إدارة أمن النقل أو التفاضلي فلوريميتري، مهرجان دبي للتسوق)10،11.
وتستخدم الثمرة صبغة فلورسنت الحساسة بيئياً لتعقب تمسخ الحرارية لعينات البروتين. العديد من الأصباغ المستخدمة بشكل شائع بنشاط fluorescence متغيرة تبعاً للأقطاب بيئتهم، وكثيراً ما عرض على إخراج فلورية عالية في بيئات مسعور لكن تمر تبريد سريع في البيئات القطبية12. البروتينات عموما يسبب زيادات واضحة في الأسفار صبغ كما أصبح عرضه النوى مسعور أثناء تمسخ، غالباً ما يتبعه انخفاض في الأسفار صبغ في درجات حرارة عالية جداً كما تبدأ البروتينات للتجميع (الشكل 2).
بينما صبغة حساسة hydrophobicity غالباً خياراً جيدا لصبغة السياحة ذات استخدام العام، يمكن أن يكون غير مناسب للبروتينات مع مناطق مسعور كبيرة، ويتعرض المذيبات، التي كثيرا ما تعرض fluorescence خلفية عالية ضاراً. توجد Fluorophores مع أنماط بديلة للعمل (انظر المناقشة)، ولكن بدلاً من ذلك قد يكون من المستصوب لتعقب تمسخ من خلال الأسفار البروتين المضمنة مع نانودسف.
بقايا التربتوفان التي يتم دفنها في مناطق nonpolar بروتين فلوريس بأقصى انبعاثات 330 نيوتن متر. كما تتكشف عينة بروتين وهذه المخلفات تصبح عرضه للمذيبات قطبية، يخضع الانبعاثات منها الحد الأقصى تحول باثوتشروميك إلى 350 نانومتر13. نانودسف يستغل هذا التحول في الانبعاثات الحد الأقصى للتحقيق تتكشف من عينة البروتين دون الحاجة إلى فلوروفوريس الخارجية14.
تذوب منحنيات تبين الخطوات تمسخ واحدة يمكن تحليلها باحتواء البيانات إلى نموذج سيجمويدال بولتزمان. درجة الحرارة عند نقطة انعطاف للعملية الانتقالية الجارية (Tm) يستخدم كمقياس كمي للبروتين الثبات الحراري ونقطة مرجعية لمقارنة فافورابيليتي الظروف المختلفة.
منحنيات تذوب من البروتين نفسه في ظروف مختلفة في بعض الأحيان يتمتع بدرجة من عدم التجانس التي يمكن أن تجعل من مناسب سيجمويدال بولتزمان غير مجد. لتمييز القيمm T من البيانات التي ينحرف عن الطبولوجيا منحنى الكلاسيكية، يمكن استخدام الطرق العددية مثل تلك المستخدمة في نامي، مفتوح مصدر بيانات حساب السياحة الفرعي تحليل برنامج11. يمكن أيضا استخدام أطر دينامي حراري بديلة لتحليل منحنيات أكثر تعقيداً مع خطوات تمسخ متعددة، مثل منهجية بروتيوبليكس15.
شاشات الاستقرار كانت مصممة للاستخدام في تجارب السياحة ونانودسف لسرعة تحديد الظروف المواتية لبروتين المستهدف (الشكل 3، التراكيب الشاشة متوفرة في المعلومات التكميلية). يمكن استخدام المعلومات التي تم جمعها مع الشاشات في مراحل عديدة من خط أنابيب بلورية، بما في ذلك: نموذج التخزين؛ تنقية، التقليل من فقدان المحصول عن طريق البروتين التي تتكشف أثناء عملية التنقية؛ الاعتداء التصميم، وتعزيز وظائف البروتين في فحوصات النشاط مع استقرار حرارياً المخازن المؤقتة، وأخيراً تبلور، توجيه المحاكمات تبلور مصممة بطريقة رشيدة.
اختيار أساس نظام المخزن مؤقت مناسبة لبروتين عينة أمر حيوي؛ يمكن أن تؤدي قيم الأس الهيدروجيني غير متوافق للتعطيل أو تمسخ البروتين. غير أنه يمكن وجود جزيئات المخزن المؤقت المشترك تبلور حلها في عدد كبير من هياكل الكريستال الأشعة السينية (الجدول 1) كما يدل على تأثير استقرار منفصل لتنظيم الأس الهيدروجيني البسيطة، وبدلاً من ذلك ينبع من المادة الكيميائية ميزات للجزيء المخزن المؤقت.
تصاغ باستخدام العديد من حسن للمخازن المؤقتة17،18،19 جنبا إلى جنب مع النظم الأخرى العازلة عادة متوافقة بيولوجيا، صمم الشاشة الرقم الهيدروجيني ديكونفولوتي أثر الكيميائية للجزيء المخزن المؤقت في الاستقرار البروتين من درجة الحموضة الفعلية للحل الناتج عن ذلك. بتوفير ثلاث قيم الأس الهيدروجيني لكل نظام المخزن المؤقت وإدراج الرقم الهيدروجيني قيمة التكرار بين النظم المختلفة، يمكن تحديد الشاشة الرقم الهيدروجيني قيم pH ملائمة ونظم العازلة مواتية لبروتين هدف.
يحتوي على الشاشة الملح عموما أملاح المختبرات، فضلا عن تشاوتروبيس، تشيلانتس، والمعادن الثقيلة ووكلاء الحد. الشاشة يمكن أن تعطي مؤشرا عاماً للتقارب من عينة البروتين إلى البيئات عالية القوة الأيونية، ولكن كل مجموعة فرعية من المركبات يمكن أيضا تقديم معلومات عن الهيكل المحتمل للبروتين. على سبيل المثال، يمكن أن تشيلانت زعزعة الاستقرار إلى حد كبير بروتين تدل المعادن الهيكلية الهامة داخل العينة. إذا كانت العينة بشدة أيضا استقرت قبل الموجبة معدنية ضمن الشاشة، هذا يمكن أن توفر نقطة بداية مبشرة بالخير للمزيد من التجارب الهيكلية.
أوسموليتيس هي مركبات قابلة للذوبان التي تؤثر على خصائص ناضح من بيئتهم. في طبيعتها، وأنها يمكن أن تستخدم ك "مرافقين الكيميائية"، فرض طي البروتينات اضطرابه وتحقيق الاستقرار لهم، لا سيما في الإجهاد الظروف20،،من2122. هذه الخصائص تجعلها إضافات جذابة في البروتين البلوري؛ يمكن استخدامها المنتجة أثناء الحصاد كريستال، تركيب وتخزين عمليات23. إمكانية استخدام أوسموليتيس يمتد أيضا إلى تنقية البروتينات. يمكن أن تكون نسبة كبيرة من البروتينات المؤتلف المعرب عنها في كولاي غير قابلة للذوبان وصعوبة استرداد في الدولة الأصلية التي تستخدم أساليب تنقية القياسية. يمكن استخدام أوسموليتيس لتحقيق الاستقرار وإنقاذ البروتينات من كسور غير قابلة للذوبان، وتنقية زيادة غلة24.
الشاشة أوسموليتي تم تصميمها باستخدام مركبات ثابتة موجودة في "مصرف بيانات البروتين" إدخالات25 و26 Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated مسارات (DEOP) قاعدة البيانات وتكراري الأمثل باستخدام البروتينات القياسية. الشاشة بنيت حوالي ثمانية أقسام فرعية من أوسموليتي: والغليسيرول والفوسفاتية السكريات والبوليولات، غير المنظفات سولفوبيتينيس (ندسبس)، بيتينيس، ونظائرها، وديبيبتيديس، والأحماض الأمينية ومشتقاتها ومجموعة متنوعة نهائي. كل أوسموليتي حاضرة في تركيزات متعددة على أساس القابلية للذوبان ويتراوح التركيز الفعال للمقارنة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:71px;">Melford Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L38100</td>
			<td style="width:435px;">Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham pH Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-101</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham Salt Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-102</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">The Durham Osmolyte Screen</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S6651</td>
			<td style="width:435px;">Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well PCR Plate</td>
			<td style="width:71px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">1403-7700</td>
			<td style="width:435px;">Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td style="width:71px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4362143</td>
			<td style="width:435px;">96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:216px;">Prometheus NT.48</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (&#916;G and &#916;&#916;G), and aggregation results (Tagg) using built-in software.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PR-C002</td>
			<td style="width:435px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. &#34;High sensitivity&#34; variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (&#60;200 &#181;g ml-1).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project

تم إنشاء مشروع Horizon2020 الفيروس العاشر في عام 2015 لاستكشاف فيروسفيري للحيوية القصوى المحددة واكتشاف البروتينات الفيروسية الرواية. تقييم القيمة التقنية الحيوية المحتملة لهذه البروتينات، وتحليل البروتين هياكلها ووظائفها تحدي الرئيسي في هذا البرنامج. استقرار عينة البروتين ضروري لتقديم نتائج التحليل ذات مغزى وزيادة كريستاليزابيليتي الأهداف. يتم تأسيس المقايسة التحول الحراري (TSA)، تقنية تستند إلى الأسفار، كوسيلة شعبية لتحسين الظروف للاستقرار البروتين في الفائق. في الثمرة، هي fluorophores العاملين الأصباغ الخارجية وحساسة بيئياً. بديل، هو تقنية مماثلة نانو فرق المسح فلوريميتري (نانودسف)، الذي يعتمد على البروتين الأسفار الأصلية. نحن الحاضرين هنا على شاشة أوسموليتي رواية، شاشة 96-شرط العضوية المضافات مصممة لتوجيه المحاكمات تبلور من خلال التجارب الأولية في حساب السياحة الفرعي. جنبا إلى جنب مع درجة الحموضة التي وضعت سابقا وشاشات الملح، توفر المجموعة من ثلاث شاشات تحليلاً شاملا للاستقرار البروتين في طائفة واسعة من نظم العازلة والمواد المضافة. الأداة المساعدة للشاشات يتجلى في تحليل حساب السياحة الفرعي ونانودسف lysozyme و "العاشر البروتين"، بروتين المستهدف من المشروع الفيروس العاشر.

وكان جزيئي lysozyme مع الشاشات الاستقرار وكان جزيئي X البروتين، بروتين المستهدف في المشروع الفيروس العاشر، مع الشاشة أوسموليتي. كل البروتينات عموما أنتجت تذوب المنحنيات مع التحولات تمسخ محددة بوضوح في تجارب السياحة ونانودسف (انظر المصاحبة للأرقام للمنحنيات الممثلة). وفي بعض الحالات حيث فسرت العينات التي لا تنتج منحنيات التفسير مع فترة انتقالية محددة تمسخ ولم كالتشويه والتحريف ولم تدرج في مقارناتم تي.
يبين الشكل 7 نتائج العينة من الشاشة الملح، تجسد خصائص الاستقرار حرارياً كلوريد الأمونيوم نحو ليسوزيمي. تبعيات تركيز مثل تلك المبينة أعلاه غالباً ما يدل على الظروف المبشرة بالخير، ولكن فإنه يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة النتائج لزيادة تركيز أيون مع أملاح مختلفة عدة لمعرفة إذا كان الاستقرار الحراري عموما ناشئاً عن الزيادة في القوة الأيونية المخزن المؤقت أو في حالة وجود أيونات معينة يمنح الاستقرار إضافية.
وتكشف مقارنة قيمm T lysozyme مع شاشة الأس الهيدروجيني (الشكل 8) قطعتين من المعلومات. أولاً، هناك اتجاه عام لزيادة الاستقرار مع انخفاض قيم الأس الهيدروجيني. ثانيا، يمكن أن تكون قيمm مجموعة تي الحصول عليها باستخدام أنظمة مختلفة المخزن المؤقت مع قيم الأس الهيدروجيني متطابقة هامة.
البيانات في الشكل 8 يشير إلى أن الاتفاق المبرم بين إدارة أمن المواصلات ونانودسف في هذه التجربة جيد عموما، ولكن نانودسف يظهر ميلا تحديد قيمm T أعلى قليلاً وأكبر قليلاً تيم تحولات من حساب السياحة الفرعي. ومع ذلك، إظهار بعض الآبار مع قيم الأس الهيدروجيني أعلاه 8.5 التفاوت الكبير بين قيمm T التي تم الحصول عليها من إدارة أمن المواصلات ونانودسف. الاختلافات المحتملة يمكن أن يعزى إلى إليه تمسخ البروتين في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة؛ على سبيل المثال، يمكن أن تعطي صبغة حساسة hydrophobicity تي منخفضة نسبيام القراءة إذا كانت مناطق مسعور من البروتين تصبح عرضه للمذيبات أسرع كثيرا من البيئة التربتوفان بقايا التغييرات في قطبية.
ويبين الشكل 9 heatmap تيم القيم التي تم الحصول عليها باستخدام شاشة أوسموليتي ليسوزيمي. الشروط معم ر أعلى الزيادات مقارنة بمراقبة الآبار (آبار A1 و A2، التي تحتوي على المياه) ملونة زرقاء داكنة. تشمل خاصة استقرار الأوضاع المحددة في الشكل 9 والغليسيرول 1 م د-السوربيتول وهيبوتوريني 100 مم و 10 مم الغليسين علاء (الآبار A4 A6، A9، E7 و F8، على التوالي).
يبين الشكل 10 heatmap تيم القيم التي تم الحصول عليها مع "حساب السياحة الفرعي عاشرا البروتين" وتجارب نانودسف مع الشاشة أوسموليتي تكشف عن أن أغلبية أوسموليتيس اختبار إعطاء أي زيادة طفيفة في تيم (في حدود 1 درجة مئوية) أو يكون لها تأثير ضار على استقرار "العاشر البروتين". على وجه الخصوص، وحمض ديبيكولينيك بتركيز 10 ملم (D1 جيدا) يبدو أن تؤذي العينة في درجة حرارة الغرفة. نتائج حساب السياحة الفرعي ونانودسف بسرعة تحديد حمض ديبيكولينيك كمادة مضافة غير متوافقة ل X البروتين التي يجب تجنبها عند العمل مع البروتين. على الرغم من ذلك، تركيزات عالية من د-السوربيتول وارابينوز (الآبار A9 و B9، سواء في م 1) فضلا عن الجلسرين وتماو (الآبار A4-A6 و E1، على التوالي) اعتبرت استقرار حرارياً.
ل lysozyme، تم اختبار تركيبات من الظروف التي تدر أعلى قيمm T من كل شاشة الاستقرار للتحقيق لتأثير تآزري مجتمعة. يبين الشكل 11 زيادة عامة في القيمm T أكثر مكونات نظام المخزن المؤقت يتم إضافة (درجة الحموضة والملح وأوسموليتي). في حالة العلم، وسلفات الأمونيوم ود-السوربيتول، زيادة تيم كبيرا كما 10 ° C يمكن ملاحظتها عندما تكون كافة المكونات موجودة بالمقارنة مع مس وحدها. ويبين الشكل 11 أن له تأثير ملحوظ في تآزر يمكن أن يحدث عندما المكونات الفردية للمخزن المؤقت هي الأمثل وجنبا إلى جنب مع الشاشات الاستقرار.
على صعيد أكثر عمومية، يوضح الشكل 11 أيضا حجم القيمm ΔT التي يمكن ملاحظتها في حساب السياحة الفرعي ونانودسف التجارب. يختلف حجم ΔTم قابلة للتحقيق استناداً إلى حد كبير إلى نظام البروتين، ولكن أي قيمةم ΔT حولها وما فوقها 5 درجة مئوية في كثير من الأحيان يدل على أثر تحقيق الاستقرار مفيد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig1.jpg"> الشكل 1 : التنقيب البيولوجي. جمع العينات من بيئة متطرفة في "المشروع" الفيروس العاشر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig2.jpg"> الشكل 2: التخطيطي TSA- المثال المشروح منحنى تذوب النموذجية التي تم الحصول عليها من تجربة حساب السياحة الفرعي. هذا المنحنى من سمات تتكشف الكلاسيكية "دولتين" البروتين، حيث ينتقل السكان عينة من مطوية التشويه والتحريف دون وسيطة قابلة للاكتشاف مطوية جزئيا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig3.jpg"> الشكل 3 : الاستقرار شاشات سير العمل. سير العمل القياسية لاستخدام شاشات الاستقرار الأمثل العازلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig4.jpg"> الشكل 4 : سير العمل على مستوى حساب السياحة الفرعي التجربة مع الشاشات الاستقرار. من اليسار إلى اليمين: (أ) مختبرين بيبيتينج من الشاشات الاستقرار في لوحة 96-جيدا. (ب) بيبيتينج عينة البروتين بصبغة الفلورسنت في اللوحة. (ج) إغلاق اللوحة قبل الطرد المركزي. (د) وضع اللوحة في نظام RT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig5.jpg"> الشكل 5: سير العمل لتجربة نانودسف القياسية. (أ) فتح شعري تحميل حامل. (ب) تحميل الشعيرات الدموية في الرف. (ج) شل حركة الشعيرات الدموية مع قطاع الختم المغناطيسي. (د) تجربة البرمجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig6.jpg"> الرقم 6 : واجهة المستخدم الخاصة نظام RT-PCR. وقد تم برمجة تجربة حساب السياحة الفرعي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig7.jpg"> الشكل 7 : ملح الشاشة عينة البيانات. (أ) نسبة شدة الأسفار في 350 نانومتر مقابل 330 نيوتن متر لتجربة خالية من التسمية نانودسف مع ليسوزيمي. وتتوافق مع عينات الآبار C7-C12 الشاشة الملح (1.5 م-كلوريد الأمونيوم M 0.2). تيم القيم المحسوبة لكل شرط يتم فرضه على الأرض. (ب) ملخص لقيمm T المحسوبة من البيانات المعروضة في الشكل 7ألف. (ج) الأسفار الكثافات في 590 نانومتر لتجربة حساب السياحة الفرعي باستخدام ليسوزيمي بصبغة حساسة hydrophobicity مراسل. مثل الرقم 7A، تتوافق مع العينات الآبار C7-C12 الشاشة الملح. يتم فرضه القيمm T المحسوبة على الرسم البياني. (د) موجز لقيمm T المحسوبة من البيانات الموجودة في الشكل 7ج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig8.jpg"> الشكل 8: الرقم الهيدروجيني الشاشة عينة البيانات. موجز لتحولاتم تي حصل مع lysozyme وشاشة الأس الهيدروجيني. كل نقطة تمثل شرط مستقل؛ النقاط في نفس قيمة pH نظم العازلة مختلفة على نفس درجة الحموضة. تيم تحولات تحسب بالنسبة إلى تحكم Tم 68.0 درجة مئوية لإجراء التجارب على حساب السياحة الفرعي و 71.9 درجة مئوية للتجارب نانودسف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig9.jpg"> الرقم 9 : أوسموليتي الشاشة عينة البيانات (lysozyme)- ملخص قيمm T التي تم الحصول عليها من تجربة خالية من التسمية نانودسف مع ليسوزيمي وكل من الشاشة أوسموليتي جيدا. تتم مقارنة القيمm T (في درجة مئوية) إلى الآبار A1 و A2 التي تحتوي على المياه كعنصر تحكم. Heatmap تم إنشاؤها استناداً إلى قيمm ΔT المقارنة (الأزرق يدل زيادةم تي والأحمر انخفاضام تي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig10.jpg"> الشكل 10: أوسموليتي شاشة بيانات العينة (البروتين X)- (أ) ملخص لقيمm T التي تم الحصول عليها من تجربة نانودسف خالية من التسمية مع البروتين X والشاشة أوسموليتي. تتم مقارنة القيمm T إلى الآبار A1 و A2 التي تحتوي على المياه كعنصر تحكم. Heatmap تم إنشاؤها استناداً إلى قيمm ΔT المقارنة (الأزرق يدل زيادةم تي والأحمر انخفاضام تي). (ب) منحنيات نانودسف التي تم الحصول عليها من A9 جيدا (1 م د-السوربيتول، شرط تحقيق استقرار) ودال-1 (حمض ديبيكولينيك 10 ملم، شرط المزعزعة للاستقرار). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig10large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig11.jpg"> الرقم 11 : المخزن المؤقت التأثير الأمثل في تيم. تي تسام قيم lysozyme جنبا إلى جنب مع ظروف كل الشاشة التي توفرها أكبر زيادة في تيم. واختيرت pH حامض الخليك pH 4.2 و 100 مم، 100 مم 5.6، كنظم المخزن المؤقت، جنبا إلى جنب مع سلفات الأمونيوم 1.5 متر كالملح. وكانت التركيزات أوسموليتي مماثلة لتلك الموجودة في الشاشة أوسموليتي: 10 مم علاء-الغليسين، 1 م د-السوربيتول، 50 مم L-يسين وهيبوتوريني 100 مم. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري لستة replicates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig11large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>جزيء</td>
			<td>رمز PDB</td>
			<td>التردد كريستاليسيشن المشارك</td>
		</tr>
<tr>
<td>الفوسفات</td>
			<td>PO4</td>
			<td>5132</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلات</td>
			<td>قانون</td>
			<td>4521</td>
		</tr>
<tr>
<td>حمض-(N-Morpholino) 2-اثانيسولفونيك (MES)</td>
			<td>زاره التربية والعلم</td>
			<td>1334</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس)</td>
			<td>TRS</td>
			<td>1155</td>
		</tr>
<tr>
<td>فورمات</td>
			<td>معاهدة المواد الانشطارية</td>
			<td>1072</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: موجز للمخزن المؤقت جزيء تبلور المشارك التردد في إدخالات مصرف بيانات البروتين (PDB). البيانات التي تم الحصول عليها من خلال بدبسوم16 من مجموع الإدخالات 144,868 (الصحيح اعتبارا من 05/12/18).
معلومات تكميلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Information.docx" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف</a>. 
التكميلية الجدول 1- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف</a>. 
التكميلية الجدول 2- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_2.xlsx" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف</a>. 
التكميلية الجدول 3- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_3.xlsx" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف</a>.

Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

كيفية تثبيت البروتين: تحول الشاشات الاستقرار الحراري لفحوصات والتفاضلي نانو فلوريميتري في المشروع الفيروس العاشر

بروتوكول يرد بسرعة اختبار الثبات الحراري للبروتينات في مجموعة متنوعة من الظروف من خلال فحوصات التحول الحراري ونانو فرق المسح فلوريميتري. تتألف من ثلاث شاشات استقرار فريدة من نوعها، هي جزيئي نظم المخزن المؤقت والأملاح والمواد المضافة، معا مع البروتينات لتحديد مخازن مناسبة للدراسات الفنية والهيكلية.

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

هذه الطريقة يمكن الإجابة على الأسئلة في الكيمياء البروتين واكتشاف المخدرات مثل الظروف التي استقرار البروتين؟ ما هي الطفرات التي تؤثر على قابلية التر حرارة الإنزيم؟ وما هي اليغانندات التي ترتبط بهدف البروتين؟المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة، يتم تنفيذها بسهولة في مختبر قياسي، ومناسبة تمامًا لتطبيقات متوسطة إلى عالية الإنتاجية. لإعداد عينة البروتين نقل 10 ميكرولترات من كل حالة من شاشة الاستقرار في بئر المقابلة من 96 لوحة البئر باستخدام ماصة متعددة القنوات لتوفير الوقت. ثم إعداد ملليلتر واحد من ما يقرب من مليغرام واحد لكل ميلليلتر حل البروتين في نظام عازلة مناسبة.إذا كان إجراء تحليل التحول الحراري إضافة صبغة البرتقال SYPRO إلى عينة البروتين إلى تركيز النهائي من 20X. تخلط إما عن طريق عكس أو دوامة وجيزة. الآن نقل 10 ميكرولترات من محلول البروتين في كل بئر من 96 لوحة جيدا.ختم وطاردة مركزية لوحة 96 بئر لمدة دقيقتين في 600 مرة G لضمان مزيج عينة البروتين وعنصر الشاشة. إعادة الغلق شاشة الاستقرار كتلة جيدة عميقة وتخزين الشاشة في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أشهر. لتنفيذ تجربة TSA، افتح درج العينة عن طريق الضغط بقوة على المسافة البادئة على الجانب الأيمن من الدرج.ضع علبة 96 بئرًا في نظام RTPCR مع A-One جيدًا إلى اليسار الخلفي. انقر على زر التجربة الجديد لبدء إعداد تجربة TSA. في علامة التبويب خصائص التجربة، انقر فوق الخيار تذوب منحنى عند سؤال، ما نوع التجربة التي تريد إعدادها؟ثم انقر فوق الخيار الآخر عند سؤاله، أي الكواشف التي تريد استخدامها للكشف عن التسلسل المستهدف؟ في علامة التبويب إعداد لوحة ، تعريف الأهداف والعينات ، أدخل اسم الهدف ، ثم تعيين مراسل كـ ROX. و (كوينشر) كـ لا شيءفي علامة التبويب إعداد لوحة تعيين الأهداف و النماذج، قم بتعيين الصبغة لاستخدامها كمرجع سلبي كـ بلا. في نفس التبويب، تعيين كل بئر من لوحة 96 جيدا إلى اسم الهدف الذي تم إدخاله في الخطوة السابقة. في التبويب تشغيل أسلوب، حذف الخطوات حتى يكون هناك إجمالي ثلاثة.تعيين الخطوة الأولى إلى 25 درجة مئوية، مع معدل منحدر من 100٪ والوقت من خمس ثوان. تعيين الخطوة الثانية إلى 95 درجة مئوية، مع معدل منحدر من 1٪ والوقت من دقيقة واحدة. وأخيرا، تعيين الخطوة الثالثة إلى 95 درجة مئوية مع معدل منحدر من 100٪ والوقت من خمس ثوان.اختر تجميع البيانات باستخدام القائمة المنسدلة تجميع البيانات أو بالنقر فوق رمز تجميع البيانات. تعيين حجم التفاعل في جيدا إلى 20 ميكرولتر. انقر فوق الزر بدء التشغيل لبدء تجربة TSA.NanoDSF يمكن استخدامها للتحقيق الاستقرار الحرارية البروتين دون استخدام الأصباغ extrinsic. يمكن إعداد العينات في 96 صحن البئر كما هو موضح سابقا في البروتوكول ولكن دون إضافة أي صبغة برتقال SYPRO. افتح درج العينة بالضغط على زر الدرج المفتوح.تأكد من أن المعدات نظيفة، ولعب اهتماما خاصا لأي غبار بالقرب من رف العينة. إذا كان النظام قد يعود مبعثر مرآة تنظيفها باستخدام الإيثانول والأنسجة الحرة الوبر. تحميل الشعيرات الدموية مع ما يقرب من 10 ميكرولترات من كل بئر من 96 لوحة البئر عن طريق لمس واحدة من نهاية الشعيرات الدموية في الحل.ثم ضع الشعيرات الدموية في حاملي الشعيرات الدموية المقابلة من رف العينة. يجب الحرص على عدم تلويث منتصف الشعيرات الدموية ببصمات الأصابع لأن هذا يمكن أن يتعارض مع قراءات الفلورانس طوال التجربة. شلّب الشعيرات الدموية بشريط مغناطيسي للختم.قم بتشغيل فحص أولي للكشف عن موضع وكثافة كل شعرية عن طريق الضغط على الزر "فحص اكتشاف ابدأ" في علامة التبويب "مسح اكتشاف". زيادة أو نقصان قوة إثارة الحادث من قوة أولية من 10٪ حتى ذروة كل مسح شعري هو ما بين 4، 000 و 12، 000 وحدة. في برنامج علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي مسح تذوب عن طريق تعيين خيار درجة الحرارة المنحدر إلى 7.0 درجة في الدقيقة الواحدة.تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية. ونهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية. ثم قم بتشغيل تجربة nanoDSF عن طريق الضغط على زر بدء الذوبان.كرر هذه الخطوات لإعداد العينات لتجربة كاملة. بمجرد إعداد التجربة الكاملة، انتقل إلى علامة التبويب مسح الذوبان، وبرنامج مسح تذوب عن طريق تعيين خيار درجة الحرارة المنحدر إلى 1.0 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة. تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية.ونهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية. وأخيراً، قم بتشغيل تجربة nanoDSF عن طريق الضغط على زر بدء الذوبان. يستخدم T m كمقياس كمي للاستقرار الحراري للبروتين في معيار للمقارنة بين تفضيل الظروف المختلفة.تظهر هنا نتائج عينة من شاشة الملح، تجسد خصائص الاستقرار الحراري لكلورايد الأمونيوم نحو الميزوزيم. المقارنة بين قيم T m من lysozyme مع الشاشة pH يكشف أن الاتفاق بين TSA و nanoDSF جيدة عموما ولكن nanoDSF يظهر ميلا إلى تحديد أعلى قليلا T m القيم في أكبر قليلا T m التحولات من TSA. هناك اتجاه عام لزيادة الاستقرار مع انخفاض قيم درجة الوفيات.يمكن أن يكون نطاق قيم T m التي تم الحصول عليها باستخدام أنظمة عازلة مختلفة ذات قيم رقمية متطابقة كبيرًا. بالنسبة لمجموعات lysozyme من الظروف التي تسفر عن أعلى قيم TSA T m من كل شاشة استقرار تم اختبارها للتحقيق في تأثير مشترك تعاوني. هناك زيادة عامة في قيم T m حيث يتم إضافة المزيد من مكونات نظام المخزن المؤقت.يمكن أن يحدث تأثير تآزري ملحوظ عندما يتم تحسين المكونات الفردية من المخزن المؤقت ودمجها مع شاشات الاستقرار. بعد هذه التقنية يمكن استخدام طرق أخرى مثل التبلور لتحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد للبروتين وكشف الأساس الجزيئي للليغاند ملزم. كذلك نحن نقدم نظرة ثاقبة في استقرار البروتين كجزء من مشروع فيروس العاشر، وهذا الأسلوب ينطبق على مجموعة واسعة من اكتشاف المخدرات ونظم التنمية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

الكالوري الضوئي التفاضلية - منهج في تقييم الثبات الحراري والتشكل من البروتين مستضد

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

البروتين الحمض الريبي النووي النقال - أغروز فحوصات جل التخلف عن تحليل<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine وظيفة تددا

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...