Name: how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

Ce projet est financé depuis le Conseil européen de recherche (CER) en vertu du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (subvention contrat n ° 685778). Ce travail a été soutenu par le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, subvention nombres BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB merci le BBSRC doctorat formation partenariat Newcastle-Liverpool-Durham pour une bourse d’étude et Durham University département de Biosciences de contribuer vers le financement de ces travaux. Nous remercions Ian Edwards pour son aide et le service de spectrométrie de masse Durham University département de chimie pour leur analyse instrumentale de protéine X. Nous sommes reconnaissants à Arnthor Ævarsson pour son travail avec le projet Virus-X et merci aussi à Claire Hatty et NanoTemper GmbH de prêts et d’aider avec le système NT.48 de Prométhée pour ce projet. Enfin, merci à Frances Gawthrop et Tozer graines pour leur soutien dans le cadre du prix BBSRC iCASE.

1. préparation de l’échantillon de protéine
<ol><li>Formuler les écrans de stabilité comme 500 µL d’extraits dans les blocs de 96 puits et d’étanchéité pour le stockage. Transférer 10 µL de chaque condition d’un écran de stabilité dans la correspond bien d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multi-canaux pour gagner du temps (Figure 4A).</li>
	<li>Préparer 1 mL d’une solution protéique-1 d’environ 1 mg mL dans un système tampon appropriée. Bien que la composition d’un tampon approprié varie avec chaque échantillon de protéine, un bon premier tampon pour essayer est phosphate de sodium 10 mM à 100 mM NaCl, pH 7,2. Remarque : Les concentrations de protéine Acceptable varient cas par cas, mais plages de concentration de 0,5 - 5 mg mL-1 produisent généralement courbes analysables. Tampons diluées sont recommandés pour une utilisation avec les écrans de stabilité pour éviter les effets de chaque condition de masque. Compositions de tampon typiques sont environ 10 mM tampon avec environ 100 mM NaCl.</li>
	<li>Si vous effectuez une expérience TSA, ajouter le colorant Orange SYPRO à l’échantillon de protéine à une concentration finale de 20 x. Mélanger par inversion ou brève agitation.</li>
	<li>Transférer 10 µL de la solution de protéines dans chaque puits de la plaque à 96 puits préparée à l’étape 1.1 (Figure 4B).</li>
	<li>Sceller et centrifuger la plaque 96 puits pendant 2 min à 600 g pour assurer la composante protéique de sample et écran sont mélangés (Figure 4C).</li>
	<li>Refermer l’écran stabilité bloc puit profond et stocker l’écran à 4 ° C pendant 4 mois. Stocker l’écran salée dans l’obscurité, car certains composants sont photosensibles.</li>
	<li>Si vous effectuez une expérience nanoDSF, passez à l’étape 2. Si vous effectuez une expérience TSA, passez à l’étape 4.</li>
</ol>2. préparer une nanoDSF expérience
<ol><li>S’assurer que l’équipement soit propre, accordant une attention particulière à toute poussière ou saleté près de la grille de l’échantillon. Si le système possède un miroir à rétrodiffusion, nettoyez-le à l’aide d’éthanol et un tissu non pelucheux.</li>
	<li>Ouvrir le tiroir de l’échantillon en appuyant sur le bouton Ouvrir le tiroir . (Figure 5A).</li>
	<li>Charger les capillaires avec environ 10 µL de chaque puits de la plaque de 96 puits en touchant à une extrémité du capillaire dans la solution, puis placez-les dans les supports capillaires correspondantes de la grille de l’échantillon (Figure 5B). Veillez à ne pas contaminer le milieu des capillaires avec empreintes digitales, etc.., car cela pourrait interférer avec fluorescence lecture tout au long de l’expérience.</li>
	<li>Immobiliser les capillaires avec la bande magnétique (Figure 5C).</li>
</ol>3. une nanoDSF expérience de programmation
<ol><li>Lancer une analyse préliminaire pour détecter la position et l’intensité de chaque capillaire en appuyant sur le bouton Démarrer l’analyse découverte dans l’onglet Découverte Scan augmentation ou diminuer la force d’excitation incidente d’une puissance initiale de 10 % jusqu'à la sommet de chaque balayage capillaire est entre 4 000-12 000 unités (Figure 5D).</li>
	<li>Pour s’assurer que l’échantillon est plié et suffisamment concentré, une analyse de fonte initiale avec un gradient de température raide est recommandée. Dans l’onglet Fusion Scan , programme un magma scan en définissant l’option de Température pente à 7,0 ° C min-1, Commencer à la température de 25 ° C et Température finale à 95 ° C, puis lancer la nanoDSF expérience en appuyant sur la Démarrer la fusion bouton. Si le résultat fond courbes ne montrent pas un point d’inflexion détectable, envisager de concentrer l’échantillon plus loin ou de vérifier si la protéine est pliée correctement.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.1 à 2.4 pour préparer les échantillons pour une expérience complète.</li>
	<li>Dans l’onglet Fusion Scan , programme une fonte scan en définissant l’option de Température pente à 1,0 ° C min-1, Commencer à la température de 25 ° C et Température finale à 95 ° C, puis lancer la nanoDSF expérience en appuyant sur le bouton Commencer à fondre .</li>
</ol>4. effectuer une expérience TSA
<ol><li>Ouvrir le tiroir de l’échantillon en appuyant fermement sur le tiret sur le côté droit du tiroir. Placez le plateau de 96 puits dans le système de RT-PCR avec puits A1 à l’arrière gauche (Figure 4D).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Nouveau expérimenter pour commencer la mise en place d’une expérience TSA.</li>
	<li>Dans l’onglet Propriétés d’expérimenter , cliquez sur l’option de Faire fondre courbe interrogé quel type d’expérience que vous voulez à mettre en place ? et l’autre option interrogé Quels réactifs voulez-vous utiliser pour détecter la séquence cible ?
</li>
	<li>Dans la plaque Setup / définir des cibles et des échantillons onglet, entrez un nom de cible puis définir journaliste comme ROX et extincteur car aucun.</li>
	<li>Dans la plaque Setup / assigner des objectifs et des échantillons onglet, assigner chaque puits de la plaque de 96 puits au nom de la cible est entré à l’étape précédente. Dans le même onglet, définissez Sélectionnez le colorant à utiliser comme référence de passive car aucun.</li>
	<li>Dans l’onglet de la Méthode Run , supprimer les étapes jusqu'à ce qu’il y a un total de trois. Définir la première étape à 25,0 ° C, taux de rampe 100 %, durée 00:05 ; la deuxième étape à 95,0 ° C, rampe taux 1 %, durée 01:00 ; la troisième étape à 95,0 ° C, taux de rampe 100 %, durée 00:05. Choisir de collecter des données en utilisant le menu déroulant de Collecter les données ou en appuyant sur l’icône de la Collecte de données (Figure 6).</li>
	<li>Réglez le Volume réactionnel par puits à 20 µL.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Démarrer Exécuter pour commencer l’expérience de la TSA.</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Choisir une longueur d’onde pour tracer une courbe de fusion avec. Pour les expériences de nanoDSF, le rapport entre les intensités de fluorescence à 330 nm et 350 nm (correspondant au tryptophane dans des environnements polaires et non polaires, respectivement)13 est couramment utilisé. Pour la plupart CST, l’émission de colorant maximale est adaptée pour le tracé de courbe de fusion (l’émission maximale de SYPRO Orange est 569 nm)12.</li>
	<li>Calculer les valeurs dem T de chaque condition de déterminer les points d’inflexion de chaque courbe de fusion. La plupart des systèmes de nanoDSF calculent automatiquement les valeurs dem T par la différentiation numérique des courbes de fusion après l’acquisition de données. Si le logiciel utilisé ne calcule pas automatiquement les valeurs dem T, libre, alternative logicielle pilotée par le GUI comme NAMI11 peut automatiser l’analyse des données et en aval de transformation, donnant la possibilité de produire un heatmap résumant Tm valeurs pour l’ensemble de l’expérience de 96 puits (la référence accompagnement fournit conseils et ressources pour le traitement des données avec NAMI).</li>
	<li>Comparer les valeurs dem T de toutes les conditions étudiées. Les écrans de stabilité contiennent deux puits dans chaque écran (A1 et A2) qui contiennent uniquement de l’eau. Prenant les valeurs de l’eau seulement comme point de référence permet de calculer des valeurs dem ΔT, traiter les erreurs systématiques et permettant une comparaison facile des effets de stabilisation. Des valeurs dem T plus élevées indiquent des conditions stabilisantes thermique qui sont recommandées pour l’utilisation en aval. Conditions prometteuses présentent souvent une dépendance de la concentration dans leur stabilisation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+intracellular+processing+of+fusion+proteins+by+TEV+protease.">Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease.</a> Protein Expression and Purification. 19 (2), 312-318 (2000).</li><li>Cordingley, M. G., Register, R. B., Callahan, P. L., Garsky, V. M., Colonno, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+small+peptides+in+vitro+by+human+rhinovirus+14+3C+protease+expressed+in+Escherichia+coli.">Cleavage of small peptides in vitro by human rhinovirus 14 3C protease expressed in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 63 (12), 5037-5045 (1989).</li><li>Hjorleifsdottir, S., Aevarsson, A., Hreggvidsson, G. O., Fridjonsson, O. H., Kristjansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+genome+of+the+Rhodothermus+RM378+thermophilic+bacteriophage.">Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage.</a> Extremophiles. 18 (2), 261-270 (2014).</li><li>Alva, V., Nam, S. Z., S&#246;ding, J., Lupas, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MPI+bioinformatics+Toolkit+as+an+integrative+platform+for+advanced+protein+sequence+and+structure+analysis.">The MPI bioinformatics Toolkit as an integrative platform for advanced protein sequence and structure analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, 410-415 (2016).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> Methods in molecular biology. 1607, 17-50 (2017).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IUCr+Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+Thermofluor.">IUCr Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 69 (2), 209-214 (2013).</li><li>Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+purification+and+characterization+using+Thermofluor+screens.">Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens.</a> Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).</li><li>Kozak, S., Lercher, L., Karanth, M. N., Meijers, R., Carlomagno, T., Boivin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays.">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular NMR. 64 (4), 281-289 (2016).</li><li>Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Razgulyaev, O. I., Uversky, V. N., Gripas', A. F., Gilmanshin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+"molten+globule"+intermediate+state+in+protein+folding+by+a+hydrophobic+fluorescent+probe.">Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe.</a> Biopolymers. 31 (1), 119-128 (1991).</li><li>Gr&#248;ftehauge, M. K., Hajizadeh, N. R., Swann, M. J., Pohl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-ligand+interactions+investigated+by+thermal+shift+assays+(TSA)+and+dual+polarization+interferometry+(DPI).">Protein-ligand interactions investigated by thermal shift assays (TSA) and dual polarization interferometry (DPI).</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 71, 36-44 (2015).</li><li>Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYPRO+Orange+and+SYPRO+Red+Protein+Gel+Stains:+One-Step+Fluorescent+Staining+of+Denaturing+Gels+for+Detection+of+Nanogram+Levels+of+Protein.">SYPRO Orange and SYPRO Red Protein Gel Stains: One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detection of Nanogram Levels of Protein.</a> Analytical biochemistry. 239, 223-237 (1996).</li><li>Burstein, E. A., Vedenkina, N. S., Ivkova, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+the+location+of+tryptophan+residues+in+protein+molecules.">Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules.</a> Photochemistry and Photobiology. 18 (4), 263-279 (1973).</li><li>Haffke, M., Rummel, G., Boivineau, J., M&#252;nch, A., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoDSF:+label-free+thermal+unfolding+assay+of+G-protein-coupled+receptors+for+compound+screening+and+buffer+composition+optimization.">nanoDSF: label-free thermal unfolding assay of G-protein-coupled receptors for compound screening and buffer composition optimization.</a> Application Note NT-PR-008. , (2016).</li><li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoPlex:+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparsematrix+screening+of+chemical+space.">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparsematrix screening of chemical space.</a> Nature Methods. 12 (9), 859-865 (2015).</li><li>Laskowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDBsum:+summaries+and+analyses+of+PDB+structures.">PDBsum: summaries and analyses of PDB structures.</a> Nucleic Acids Research. 29 (1), 221-222 (2001).</li><li>Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S., Singh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li><li>Good, N. E., Izawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers.">Hydrogen ion buffers.</a> Methods in enzymology. 24, 53-68 (1972).</li><li>Ferguson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Analytical biochemistry. 104 (2), 300-310 (1980).</li><li>Welch, W. J., Brown, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+and+chemical+chaperones+on+protein+folding.">Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding.</a> Cell stress &amp; chaperones. 1 (2), 109-115 (1996).</li><li>Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+chaperones+regulate+molecular+chaperones+in+vitro+and+in+cells+under+combined+salt+and+heat+stresses.">Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses.</a> The Journal of biological chemistry. 276 (43), 39586-39591 (2001).</li><li>Yancey, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+osmolytes+as+compatible,+metabolic+and+counteracting+cytoprotectants+in+high+osmolarity+and+other+stresses.">Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (15), 2819-2830 (2005).</li><li>Garman, E. F., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocooling+and+radiation+damage+in+macromolecular+crystallography.">Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 32-47 (2006).</li><li>de Marco, A., Vigh, L., Diamant, S., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+folding+of+aggregation-prone+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+osmolytes,+plasmid-+or+benzyl+alcohol-+overexpressed+molecular+chaperones.">Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol- overexpressed molecular chaperones.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 329 (2005).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+data+bank.">The protein data bank.</a> Nucleic acids research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Bougouffa, S., Radovanovic, A., Essack, M., Bajic, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEOP:+A+database+on+osmoprotectants+and+associated+pathways.">DEOP: A database on osmoprotectants and associated pathways.</a> Database. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Fluorescent+Thermal+Stability+Assay+for+Membrane+Proteins.">Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Kung, C. E., Reed, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+molecular+rotors:+a+new+class+of+probes+for+tubulin+structure+and+assembly.">Fluorescent molecular rotors: a new class of probes for tubulin structure and assembly.</a> Biochemistry. 28 (16), 6678 (1989).</li><li>Iio, T., Itakura, M., Takahashi, S., Sawada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9-(Dicyanovinyl)julolidine+binding+to+bovine+brain+calmodulin.">9-(Dicyanovinyl)julolidine binding to bovine brain calmodulin.</a> Journal of biochemistry. 109 (4), 499-502 (1991).</li><li>Veros, C. T., Oldham, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lysozyme-ligand+binding+in+the+solution+and+gas+phases+by+electrospray+ionisation+mass+spectrometry.">Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (21), 3505-3510 (2007).</li><li>Kean, J., Cleverley, R. M., O'Ryan, L., Ford, R. C., Prince, S. M., Derrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+CorA+Mg2++transport+channel+from+Methanococcus+jannaschii+using+a+Thermofluor-based+stability+assay.">Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay.</a> Molecular membrane biology. 25 (8), 653-661 (2008).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallographica Section F. 68 (5), 596-600 (2012).</li><li>Morgan, H. P., Zhong, W., McNae, I. W., Michels, P. A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+pyruvate+kinases+display+evolutionarily+divergent+allosteric+strategies.">Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies.</a> Royal Society open science. 1 (140120), (2014).</li><li>Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aldehyde+dehydrogenase+1A3+complexed+with+NAD++and+retinoic+acid.">Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid.</a> Scientific reports. 6 (35710), (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Aspects critiques au sein du protocole incluent l’étape de centrifugation et une bonne étanchéité de la plaque à 96 puits pour des expériences TSA (étape 1.5). Centrifugation veille à ce que la condition d’échantillon et écran de protéines entrent en contact et mélanger. En outre, si l'on utilise une plaque non scellée pour une expérience TSA, il y a un risque important de solvant d’évaporation tout au long de l’expérience, causant une augmentation de la concentration de l’échantillon et augmenter les chances d’agrégation de la protéine prématurée.
CST et nanoDSF se prêtent à une vaste gamme d’échantillons de protéines ; la grande majorité des échantillons peut produire des courbes de fusion interprétable avec un colorant journaliste hydrophobie ou par l’intermédiaire de nanoDSF sans colorant. Si les sources standard fluorescence ne conviennent pas à votre protéine, la simple modification du protocole qui pourrait être explorée est le choix de fluorophore. Plusieurs colorants alternatives pourraient être appropriés pour les expériences TSA. Les exemples incluent N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), un composé qui émet une fluorescence après réaction avec un thiol27et 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), un composé qui varie sa fluorescence basée sur la rigidité de son environnement, augmentant sa fluorescence comme un échantillon de protéines déroule le28,29 (la teinture ce dernier nécessite souvent des concentrations élevées d’échantillon).
Autres méthodes d’analyse des courbes de fusion sont disponibles si Tm n’est pas calculé automatiquement par le logiciel de l’instrument. Si les données sont homogènes et qu’une seule étape de dénaturation est apparente dans les courbes de fusion, un ensemble de données tronqué peut être monté sur un Boltzmann sigmoïde avec l’équation suivante :
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg">
Où F est l’intensité de la fluorescence à la température T, Fmin et Fmax est les intensités de fluorescence avant et après la transition de dénaturation, respectivement, Tm est la température du point médian de la transition de la dénaturation et la C est la pente au Tm. Alors que cette méthode fonctionne bien pour les procédés de dénaturation simple en deux étapes, il ne convient pas pour les courbes de fusion complexe avec plusieurs transitions.
Un des avantages majeurs de la TSA est son accessibilité ; TSA expériences peuvent être effectuées dans n’importe quel système de RT-PCR avec filtres à des longueurs d’onde appropriées pour la teinture de fluorescence employées. Ceci couplé avec le faible coût des consommables, facilité d’utilisation et relativement faible quantité de protéines nécessaire, faire des TSA une technique précieuse pour une large gamme d’échelles de projet, aussi bien dans l’industrie et les universités.
Ainsi que ce qui indique des conditions favorables de tampon, les écrans contiennent certains puits qui peuvent donner des indices de la présence de métaux structures au sein d’une protéine de l’échantillon. Puits pouvant être d’un intérêt particulier dans l’écran de sel sont G6 et G7, qui contiennent de l’EDTA de 5 mM et 5 mM EGTA, respectivement. La déstabilisation thermique importante dans ces puits peut être le signe d’importantes ions métalliques dans la protéine qui sont séquestrées par la chelants. Composés dans l’écran osmolyte peuvent également potentiellement fournir des indices à la fonction d’une protéine. Bon nombre de ces composés dans l’écran appartiennent aux classes de molécules qui sont communs substrats d’enzymes. Par exemple, la stabilisation générale offerte par saccharides (présents dans les puits A11-B10) pour lysozyme pourrait être attribuée à leur similarité structurelle à établi des substrats de l’enzyme, la N-acétylglucosamine oligomères30.
Les protocoles TSA et nanoDSF décrites ci-dessus peuvent être adaptées à l’étude des interactions protéine-ligand. Les ligands qui se lient spécifiquement à une protéine peuvent augmenter sa stabilité thermique en introduisant de nouvelles interactions au sein du complexe. Un changement positif de dose-dépendante de protéine Tm est un signe prometteur d’une interaction de protéine-ligand réussie. La vitesse, de débit et de faible coût du dépistage des banques de composés avec CST a fait une méthode très populaire dans la découverte de médicaments de stade précoce.
Optimiser les conditions de tampon de protéines cibles et leurs complexes de ligand peut être essentielle pour la réussite d’un projet, comme le montrent de nombreux exemples de littérature31,32,33,34. Avec un essai typique prenant moins de 2 h, y compris le temps d’installation, CST et nanoDSF couplé avec des écrans de stabilité représentent une technique rapide et peu coûteuse pour les optimisations de mémoire tampon.

De nombreuses enzymes biotechnologique-utiles proviennent de sources virales, telles que le tabac etch virus (TEV) protéase1 et le rhinovirus humain type 3C (VRC 3c) protéase2. Le projet (Figure 1) de Horizon2020 Virus-X3. Ce programme vise b d’élargir la palette des propriétés de familles d’enzymes connus et (b) de caractériser de nouveaux enzymes de fonction encore inconnue (Enzyme X). Détermination de la structure cristallographique joue un rôle central dans la caractérisation des protéines cibles, en particulier dans les cas où les séquences de protéines ont évolué au-delà de la reconnaissance de4. Stabilité des protéines est un facteur clé dans le processus de cristallisation ; échantillons doivent être conformationnellement homogènes et charpentées sur une période de temps de forme haute qualité, diffractant cristaux. En outre, il est essentiel pour les tests d’activité qui les protéines existent dans leur conformation active, qui peut également être facilitée par un environnement favorable moléculaire.
Malgré le développement de la technologie disponible pour cristallographes, cristallisation de protéines demeure un processus empirique de longues et fastidieuses5. Des expériences préliminaires biophysiques pour améliorer la stabilité des protéines en solution donnent clairement un meilleur point de départ pour la cristallisation de protéines et consomment habituellement seulement une infime quantité de protéine échantillon6,7, 8,9. Le grand nombre de protéines cibles à étudier dans ce projet nécessite également des essais de stabilité évolutive et à haut débit. L’une des méthodes plus populaires pour la caractérisation biophysique avant la cristallisation des protéines est l’analyse de décalage thermique (également connu sous le nom TSA ou différentielle à balayage fluorimétrie, DSF)10,11.
CST employer un colorant fluorescent sensible à l’environnement pour suivre la dénaturation thermique d’échantillons de protéines. Beaucoup de colorants couramment utilisés ont une activité fluorescence variable selon la polarité de leur environnement, souvent affichant un rendement de fluorescence élevée dans un environnement hydrophobe mais subissant un trempage rapide dans les milieux polaires12. Les protéines provoquent généralement des augmentations prononcées fluorescence colorant comme leurs cœurs hydrophobes deviennent exposées au cours de la dénaturation, souvent suivie d’une diminution de la fluorescence du colorant à très haute température comme protéines commencent à s’agréger (Figure 2).
Alors qu’un colorant hydrophobicité sensible est souvent un bon choix pour une teinture TSA d’usage général, il peut être impropre à être grandes, exposés au solvant régions hydrophobes, qui présentent souvent la fluorescence de fond négativement élevé des protéines. Fluorophores avec d’autres modes d’action existent (voir Discussion), mais il peut au contraire être souhaitable de suivre la dénaturation par fluorescence intrinsèque de protéine avec nanoDSF.
Résidus de tryptophane qui sont enterrés dans des régions non polaires d’une protéine sont fluorescents avec une émission maximale de 330 nm. Comme un échantillon de la protéine se déroule et ces résidus deviennent exposés à un solvant polaire, leur émission maximale subit un déplacement bathochrome à 350 nm13. nanoDSF exploite ce changement d’émission maximale pour sonder le déroulement d’un échantillon de protéines sans nécessiter de fluorophores extrinsèque14.
Faire fondre les courbes montrant étapes de dénaturation unique peuvent être analysés en ajustant les données pour un modèle sigmoïde de Boltzmann. La température au point d’inflexion de la transition qui se déroule (Tm) est utilisée comme une mesure quantitative de la stabilité thermique des protéines et un point de repère pour comparer la favorabilité de différentes conditions.
Courbes de fusion de la protéine même dans des conditions différentes possèdent parfois un degré d’hétérogénéité qui peut faire un raccord sigmoïde de Boltzmann infaisable. Pour discerner les valeursm T de données qui s’écarte de la topologie de la courbe classique, méthodes numériques peuvent être utilisées comme celles employées en NAMI, un open source TSA/data analysis programme11. Autres cadres thermodynamiques permet également d’analyser les courbes plus complexes avec plusieurs étapes de dénaturation, tels que la méthodologie de ProteoPlex15.
Les écrans de stabilité ont été conçus pour une utilisation dans des expériences de TSA et nanoDSF d’identifier rapidement les conditions favorables pour une protéine cible (Figure 3, compositions d’écran sont disponibles dans les informations complémentaires). Informations recueillies avec les écrans peuvent être utilisées à plusieurs étapes du pipeline cristallographique, y compris : l’échantillon de stockage ; purification, réduisant au minimum les pertes de rendement par l’intermédiaire de protéines qui se déroulent au cours du processus de purification ; design, fonctionnalité de protéine dans les tests d’activité avec stabilisant thermique tampons et, enfin, cristallisation, guidant les essais de cristallisation conçu rationnellement d’armature de dosage.
Choisir une base de système tampon adapté pour un échantillon de protéine est vitale ; valeurs de pH incompatible peuvent entraîner la désactivation ou la dénaturation d’une protéine. Cependant, la présence de molécules cocristallisés tampon résolu dans un grand nombre de structures radiocristallographiques (tableau 1) pourrait également être indicative d’un effet stabilisateur qui est séparée de la régulation du pH simple et au lieu de cela découle de la substance chimique caractéristiques de la molécule de tampon.
Formulé en utilisant plusieurs de tampons17,18,19 , aux côtés d’autres systèmes couramment biologiquement compatible avec tampon de Good, l’écran de pH est conçu pour deconvolute l’effet chimique d’une molécule tampon sur stabilité des protéines de la réelle pH de la solution obtenue. En fournissant les trois valeurs de pH pour chaque système de tampon et incorporant la redondance de valeur de pH entre les différents systèmes, l’écran de pH peut identifier les valeurs de pH favorable et systèmes tampon favorable pour une protéine cible.
L’écran de sel contient généralement sels de laboratoire ainsi que chaotropes, chelants, métaux lourds et les agents réducteurs. L’écran peut donner une indication générale de l’affinité d’un échantillon de protéines pour les environnements avec des forces ioniques élevées, mais chaque sous-groupe des composés peut également fournir des informations sur la structure potentielle d’une protéine. Par exemple, un chélateur considérablement déstabiliser une protéine pourrait être révélateur de métaux structurels importants au sein de l’échantillon. Si l’échantillon est également fortement stabilisé par un cation métallique dans l’écran, cela peut fournir un point de départ prometteur pour autres structurels expériences.
Osmolytes sont des composés solubles qui affectent les propriétés osmotiques de leur environnement. Dans la nature, il peuvent être utilisés comme « chaperons chimiques », appliquer le repliement des protéines désordonnées et stabiliser, surtout dans des conditions de stress20,21,22. Ces caractéristiques rendent attrayants additifs en cristallographie des protéines ; utilisable comme cryoprotecteurs pendant la récolte du cristal, montage et stockage traite23. Utilisation potentielle des osmolytes s’étend également à la purification des protéines. Une proportion importante des protéines recombinantes exprimée chez e. coli peut être difficile de le récupérer à l’état natif à l’aide de méthodes de purification standard et insolubles. Osmolytes peuvent servir à stabiliser et à récupérer des protéines des fractions insolubles, purification croissante conduit à24.
L’écran osmolyte a été conçu à l’aide d’établies composés présents dans la Protein Data Bank entrées25 et la base de données de26 Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated voies (DEOP) et optimisé par itération à l’aide de protéines standard. L’écran est construit autour de huit sous-classes d’osmolyte : glycérol, sucres et polyols, non détergente sulfobétaïnes (NDSBs), bétaïnes et leurs analogues, organophosphorés, dipeptides, acides aminés et leurs dérivés et un dernier groupe divers. Chaque osmolyte est présent dans plusieurs concentrations basées sur sa solubilité et les plages de concentration efficace aux fins de comparaison.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:71px;">Melford Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L38100</td>
			<td style="width:435px;">Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham pH Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-101</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham Salt Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-102</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">The Durham Osmolyte Screen</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S6651</td>
			<td style="width:435px;">Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well PCR Plate</td>
			<td style="width:71px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">1403-7700</td>
			<td style="width:435px;">Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td style="width:71px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4362143</td>
			<td style="width:435px;">96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:216px;">Prometheus NT.48</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (&#916;G and &#916;&#916;G), and aggregation results (Tagg) using built-in software.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PR-C002</td>
			<td style="width:435px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. &#34;High sensitivity&#34; variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (&#60;200 &#181;g ml-1).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project

Le projet Horizon2020 Virus-X a été mis en place en 2015 pour explorer la virosphere de certains biotopes extrêmes et découvrir de nouvelles protéines virales. Afin d’évaluer la valeur potentielle de biotechnique de ces protéines, l’analyse des protéines, structures et fonctions est un défi central dans ce programme. La stabilité de l’échantillon de protéine est essentielle pour fournir des résultats significatifs et augmenter le crystallizability des cibles. Le dosage de décalage thermique (TSA), une technique axée sur la fluorescence, est établi comme une méthode populaire pour optimiser les conditions pour la stabilité des protéines à haut débit. En CST, les fluorophores indépendants sont des colorants extrinsèques, sensible à l’environnement. Une alternative, technique semblable est nano différentielle à balayage fluorimétrie (nanoDSF), qui s’appuie sur la fluorescence natif de protéine. Nous présentons ici un roman osmolyte écran, un écran de 96-condition d’additifs organiques conçu pour guider les essais de cristallisation à travers des expériences préliminaires de TSA. Ainsi que des écrans sels et pH développés précédemment, l’ensemble des trois écrans fournit une analyse complète de la stabilité des protéines dans un large éventail de systèmes de tampon et d’additifs. L’utilité des écrans est démontrée dans l’analyse de la TSA et nanoDSF de lysozyme et protéine X, une protéine cible du projet Virus-X.

Lysozyme a été testée avec les écrans de la stabilité et la protéine X, une protéine cible du projet Virus-X, a été testée avec l’écran osmolyte. Les deux protéines produites généralement faire fondre les courbes avec des transitions de dénaturation clairement définis dans des expériences de TSA et de nanoDSF (voir figures pour les courbes représentatives d’accompagnement). Dans de rares cas où les échantillons qui n’ont pas produit des courbes interprétable avec une transition de dénaturation définis ont été interprétés comme dénaturés et ne figurent pas dans les comparaisonsm T.
La figure 7 illustre les résultats de l’échantillon dans l’écran de sel, illustrant les propriétés stabiliser thermiquement de chlorure d’ammonium vers lysozyme. Comme indiqué ci-dessus, les dépendances de concentration sont souvent des conditions prometteuses, mais il peut être utile de comparer les résultats de l’augmentation de la concentration ionique avec plusieurs sels différents pour voir si la stabilisation thermique découle généralement d’un augmentation de la force ionique de tampon ou si la présence d’ions spécifiques confère une stabilité supplémentaire.
Comparaison des valeurs dem T du lysozyme avec l’écran de pH (Figure 8) révèle deux éléments d’information. Tout d’abord, il y a une tendance générale d’accroître la stabilité avec la diminution des valeurs de pH. Deuxièmement, les valeurs de plage de Tm obtenues à l’aide de systèmes tampons différentes avec des valeurs de pH identique peuvent être importantes.
Données à la Figure 8 donne à penser que l’accord entre TSA et nanoDSF dans cette expérience est généralement bonne, mais nanoDSF montre une tendance à identifier les valeurs dem T légèrement plus élevées et légèrement plus grand Tm déplace que TSA. Cependant, certains puits avec des valeurs de pH supérieur à 8,5 montrent de grandes différences entre les valeurs dem T obtenues de TSA et nanoDSF. Différences pourraient potentiellement être attribuées au mécanisme de dénaturation de la protéine à différents pH ; par exemple, un colorant hydrophobicité sensible pourrait donner une relativement faible Tm lecture si les régions hydrophobes d’une protéine deviennent exposées au solvant nettement plus rapide que l’environnement des changements de résidus de tryptophane en polarité.
La figure 9 illustre un heatmap de Tm valeurs obtenues avec lysozyme en utilisant l’écran osmolyte. Conditions avec les plus fortes hausses dem T par rapport aux puits de contrôle (puits A1 et A2, contenant de l’eau désionisée) sont de couleur bleu foncé. Surtout stabilisateurs conditions identifiées dans la Figure 9 comprennent le glycérol, 1 M, D-sorbitol, hypotaurine de 100 mM et 10 mM Gly-Ala (puits A4-A6, A9, E7 et F8, respectivement).
La figure 10 montre un heatmap de Tm valeurs obtenues avec la protéine X. TSA et des expériences de nanoDSF avec l’écran Osmolyte révèlent que la majorité des osmolytes testé donne soit une légère hausse en Tm (à moins de 1 ° C) ou avoir un effet préjudiciable sur la stabilité de la protéine x. En particulier, l’acide dipicolinique à une concentration de 10 mM (bien D1) apparaît pour dénaturer l’échantillon à la température ambiante. Les résultats de la TSA et nanoDSF identifient rapidement l’acide dipicolinique comme additif incompatible pour X de protéines qui devraient être évitées lorsque vous travaillez avec la protéine. Néanmoins, de fortes concentrations de D-sorbitol et arabinose (puits A9 et B9, tous deux à 1 M) ainsi que le glycérol et TMAO (puits A4-A6 et E1, respectivement) ont été identifiés comme la stabilisation thermique.
Pour le lysozyme, combinaisons de conditions, ce qui donne les valeurs dem T plus hauts de chaque écran de stabilité ont été testés pour sonder pour obtenir un effet combiné synergique. La figure 11 montre une augmentation générale dans les valeurs dem T en plus de composants du système tampon (pH, sel et osmolyte) sont ajoutés. Dans le cas de MES, sulfate d’ammonium et D-sorbitol, un Tm augmentent aussi grande que 10 ° C peuvent être observé lorsque tous les composants sont présents par rapport à MES seuls. La figure 11 montre qu’un effet synergique sensible peut se produire lorsque des composants individuels d’un tampon sont optimisés et combinés avec les écrans de stabilité.
D’une manière plus générale, la Figure 11 illustre également l’importance des valeurs dem ΔT que l'on peut observer dans les TSA et nanoDSF des expériences. L’amplitude de ΔTm réalisables varie significativement selon le système de protéine, mais n’importe quelle valeur dem ΔT autour et au-dessus de 5 ° C est souvent signe d’un effet stabilisant bénéfique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig1.jpg"> Figure 1 : Bioprospection. Prélèvement d’échantillons du milieu extrême du projet Virus-X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig2.jpg"> Figure 2: schéma TSA. Annoté par exemple d’une courbe typique de la fonte obtenue d’une expérience TSA. Cette courbe est caractéristique du déroulement classique « deux États » protéine, où l’échantillon de population effectue une transition de plié à dénaturé sans détectables intermédiaires partiellement repliée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig3.jpg"> Figure 3 : Stabilité des écrans workflow. Flux de travail standard d’optimisation de mémoire tampon en utilisant les écrans de stabilité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig4.jpg"> Figure 4 : Flux de travail d’une norme TSA expérimenter avec les écrans stabilité. De gauche à droite : (A) aliquotes de pipetage des écrans stabilité dans une plaque de 96 puits. (B) échantillon de protéine avec un colorant fluorescent dans la plaque de pipetage. (C) la plaque avant la centrifugation de soudure. (D) placer la plaque dans un système de RT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig5.jpg"> Figure 5: Workflow d’une expérimentation de la norme nanoDSF. (A) ouverture le capillaire rack de chargement. (B) les capillaires de chargement dans le rack. (C) immobiliser les capillaires avec la bande magnétique. (D) une expérience de programmation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig6.jpg"> Figure 6 : Interface utilisateur pour le système de RT-PCR. Une expérience de la TSA a été programmée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig7.jpg"> Figure 7 : Données d’échantillon écran de sel. (A) rapport des intensités de fluorescence à 350 nm vs 330 nm pour une expérience exempte d’étiquette nanoDSF avec lysozyme. Les échantillons correspondent aux puits C7-C12 de l’écran de sel (1,5 M - 0,2 M de chlorure d’ammonium). Les valeurs dem T calculées pour chaque condition sont superposent sur le terrain. B résumé des valeursm T calculé d’après les données présentées dans la Figure 7A. Intensités de Fluorescence (C) à 590 nm pour une expérience TSA à l’aide de lysozyme avec un colorant sensible hydrophobicité journaliste. Comme la Figure 7A, les échantillons correspondent aux puits C7-C12 de l’écran de sel. Les valeurs calculées dem T sont superposent sur le graphique. (D) résumé des valeursm T calculé à partir de données présentes dans la Figure 7C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig8.jpg"> Figure 8: données d’échantillon écran pH. Résumé de Tm quarts obtenus avec le lysozyme et l’écran de pH. Chaque point représente une condition d’indépendante ; points à la même valeur de pH sont des systèmes tampons différents au même pH. Tm déplacements sont calculés par rapport à un contrôle Tm de 68,0 ° C pour des expériences TSA et 71,9 ° C pour des expériences de nanoDSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig9.jpg"> Figure 9 : Données d’échantillon Osmolyte écran (lysozyme). Résumé de Tm valeurs obtenues d’une expérience nanoDSF exempte d’étiquette avec le lysozyme et chaque puits de l’écran osmolyte. Valeurs dem T (en ° C) sont comparées aux puits A1 et A2 qui contiennent de l’eau sous forme de contrôle. Une heatmap a été généré en fonction ΔTm valeurs comparées (bleu dénote une augmentation dem T et rouge une diminution dem T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig10.jpg"> Figure 10: données d’échantillon Osmolyte écran (protéine X). (A) résumé des Tm valeurs obtenues d’une expérience exempte d’étiquette de nanoDSF avec la protéine X et l’écran osmolyte. Tm valeurs sont comparées aux puits A1 et A2 qui contiennent de l’eau sous forme de contrôle. Une heatmap a été généré en fonction ΔTm valeurs comparées (bleu dénote une augmentation dem T et rouge une diminution dem T). (B) nanoDSF courbes obtient bien A9 (1 M D-sorbitol, une condition de stabilisation) et D1 (acide dipicolinique 10 mM, une condition déstabilisante). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig10large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig11.jpg"> Figure 11 : Tampon effet optimisation sur Tm. TSA Tm valeurs du lysozyme combinées avec les conditions de chaque écran que procure la plus forte augmentation Tm. pH de l’acide acétique, pH 4,2 et 100 mM MES, 100 mM 5,6, ont été choisis comme les systèmes tampon, aux côtés de 1,5 M de sulfate d’ammonium sous forme de sel. Osmolyte concentrations étaient identiques à ceux trouvés dans l’écran osmolyte : 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50 mM de L-lysine et hypotaurine de 100 mM. Barres d’erreur représentent l’écart de six réplicats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig11large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Molécule</td>
			<td>Code PDB</td>
			<td>Fréquence de cristallisation co</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphate</td>
			<td>PO4</td>
			<td>5132</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acétate de</td>
			<td>LOI SUR LES</td>
			<td>4521</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic acide (MES)</td>
			<td>MES</td>
			<td>1334</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (tris)</td>
			<td>TRS</td>
			<td>1155</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formiate</td>
			<td>FMT</td>
			<td>1072</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : sommaire des tampon molécule cocristallisation fréquence dans les écritures de la Protein Data Bank (PDB). Données obtenues par le biais de PDBsum16 sur un total de 144 868 entrées (corrects en date du 05/12/18).
Des informations complémentaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Information.docx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier</a>. 
Supplémentaire Table 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier</a>. 
Tableau supplémentaire 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_2.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier</a>. 
Supplémentaires tableau 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_3.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier</a>.

Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Comment faire pour stabiliser les protéines : écrans de stabilité thermique décaler dosages et Nano différentielle Fluorimétrie dans le projet Virus-X à balayage

Un protocole est présenté pour tester rapidement la stabilité thermique des protéines dans une variété de conditions par décalage thermique et nano différentielle à balayage fluorimétrie. Systèmes tampon, de sels et d’additifs, ensemble comprenant trois écrans de stabilité unique, sont dosés avec des protéines afin d’identifier des tampons adaptés pour des études fonctionnelles et structurelles.

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Cette méthode peut répondre à des questions sur la chimie des protéines et la découverte de médicaments, telles que les conditions qui stabilisent une protéine? Quelles mutations ont un impact sur la thermostabilité d’une enzyme ? Et quels ligands se lient à une cible protéique ?Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, facile à effectuer dans un laboratoire standard, et parfaitement adaptée aux applications à débit moyen à élevé. Pour préparer l’échantillon de protéines transférer 10 microlitres de chaque condition d’un écran de stabilité dans le puits correspondant d’une plaque de puits 96 à l’aide d’une pipette multicanal pour gagner du temps. Préparez ensuite une millilitre d’environ un milligramme par solution protéique millilitre dans un système tampon approprié.Si vous effectuez un test de décalage thermique, ajoutez le colorant orange SYPRO à l’échantillon de protéines à une concentration finale de 20X. Mélanger soit par inversion, soit par un bref tourbillon. Maintenant, transférez 10 microlitres de la solution protéique dans chaque puits de la plaque de puits 96.Sceller et centrifuger la plaque de puits 96 pendant deux minutes à 600 fois G pour s’assurer que l’échantillon de protéines et le composant de l’écran sont mélangés. Reseal l’écran de stabilité profondément bloc de puits et de stocker l’écran à quatre degrés Celsius pour un jusqu’à quatre mois. Pour effectuer l’expérience TSA, ouvrez le tiroir de l’échantillon en appuyant fermement sur l’indent sur le côté droit du tiroir.Placez le plateau de puits 96 dans le système RTPCR avec bien A-one à l’arrière gauche. Cliquez sur le nouveau bouton d’expérience pour commencer à mettre en place une expérience TSA. Dans l’onglet Propriétés d’expérience, cliquez sur l’option Courbe de fusion lorsqu’on vous le demande, quel type d’expérience souhaitez-vous configurer ?Ensuite, cliquez sur l’autre option lorsqu’on vous demande quels reagents voulez-vous utiliser pour détecter la séquence cible? Dans la configuration de la plaque, définissez l’onglet Cibles et Échantillons, entrez un nom cible, puis définissez Reporter comme ROX. Et Quencher comme aucun.Dans l’onglet Configuration de la plaque, attribuez des cibles et des échantillons, définissez le colorant à utiliser comme référence passive comme Aucun. Dans le même onglet, attribuez chaque puits de la plaque de puits 96 au nom cible entré dans l’étape précédente. Dans l’onglet Méthode d’exécuter, supprimez les étapes jusqu’à ce qu’il y en ait un total de trois.Réglez la première étape à 25 degrés Celsius, avec un taux de rampe de 100% et le temps de cinq secondes. Réglez la deuxième étape à 95 degrés Celsius, avec un taux de rampe de 1% et le temps d’une minute. Enfin, réglez la troisième étape à la 95 degrés Celsius avec un taux de rampe de 100% et le temps de cinq secondes.Choisissez de collecter des données à l’aide du menu collecter ou en cliquant sur l’icône de collecte de données. Réglez le volume de réaction par puits à 20 microlitres. Cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’expérience TSA.NanoDSF peut être utilisé pour sonder la stabilité thermique des protéines sans l’utilisation de dyes extrinsèques. Les échantillons peuvent être préparés dans 96 plaques de puits comme décrit précédemment dans le protocole, mais sans ajouter de colorant orange SYPRO. Ouvrez le tiroir de l’échantillon en appuyant sur le bouton Open Drawer.Assurez-vous que l’équipement est propre, en jouant une attention particulière à toute poussière près de la grille de l’échantillon. Si le système a rétro-diffusion miroir le nettoyer à l’aide d’éthanol et un tissu sans peluche. Chargez les capillaires avec environ 10 microlitres de chaque puits de la plaque de puits 96 en touchant une extrémité du capillaire dans la solution.Et puis placez le capillaire dans les supports capillaires correspondants de la grille d’échantillon. Veillez à ne pas contaminer le milieu des capillaires avec des empreintes digitales car cela pourrait interférer avec les lectures de fluorescence tout au long de l’expérience. Immobiliser les capillaires à l’aide d’une bande d’étanchéité magnétique.Lancez une analyse préliminaire pour détecter la position et l’intensité de chaque capillaire en appuyant sur le bouton Démarrer découverte scan dans l’onglet Discovery Scan. Augmentez ou diminuez la force d’excitation de l’incident d’une puissance initiale de 10% jusqu’à ce que le pic de chaque balayage capillaire se situe entre 4000 et 12 000 unités. Dans le programme d’onglet Melting Scan, un balayage de fusion en fixant l’option Pente de température à 7,0 degrés par minute.Commencez la température à 25 degrés Celsius. Et terminer la température à 95 degrés Celsius. Lancez ensuite l’expérience nanoDSF en appuyant sur le bouton Démarrer la fusion.Répétez ces étapes pour préparer les échantillons pour une expérience complète. Une fois l’expérience complète mise en place, accédez à l’onglet Analyse de fusion et programmez un balayage de fusion en définissant l’option Pente de température à 1,0 degré Celsius par minute. Commencez la température à 25 degrés Celsius.Et terminer la température à 95 degrés Celsius. Enfin, lancez l’expérience nanoDSF en appuyant sur le bouton Start Melting. T m est utilisé comme mesure quantitative de la stabilité thermique des protéines dans une référence pour comparer la favorabilité des différentes conditions.Voici les résultats de l’échantillon de l’écran de sel, ilplifiant les propriétés thermiquement stabilisatrices du chlorure d’ammonium vers le lysozyme. La comparaison des valeurs T m du lysozyme avec l’écran de pH révèle que l’accord entre la TSA et le nanoDSF est généralement bon, mais nanoDSF montre une tendance à identifier des valeurs T m légèrement plus élevées dans les décalages T m légèrement plus grands que la TSA. Il y a une tendance générale à la stabilité croissante avec la baisse des valeurs de pH.La plage de valeurs T m obtenues à l’aide de différents systèmes tampons avec des valeurs de pH identiques peut être significative. Pour les combinaisons lysozyme de conditions donnant les valeurs tsa t m les plus élevées de chaque écran de stabilité ont été testés pour sonder pour un effet combiné synergique. Il ya une augmentation générale des valeurs T m que plus de composants du système tampon sont ajoutés.Un effet synergique notable peut se produire lorsque les composants individuels d’un tampon sont optimisés et combinés avec les écrans de stabilité. Suivant cette technique, d’autres méthodes telles que la cristallisation peuvent être utilisées pour déterminer la structure tridimensionnelle d’une protéine et démêler la base moléculaire de la liaison ligand. De plus, nous fournissons un aperçu de la stabilité des protéines dans le cadre du projet Virus-X, cette technique s’applique à un large éventail de systèmes de découverte et de développement de médicaments.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Recherche

Biochimie

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode d&#39;évaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Dosages de retard de gel d&#39;agarose et de protéine-ARNt pour l&#39;analyse de la<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -thereylcarbamoyladénosine TcdA Fonction

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimétrie dissipatif pour étudier la dynamique de la liaison des phospholipides Binding Protein annexine A2 de bicouches lipidiques solide soutenu par utilisant un résonateur à Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Comment quantifier la Fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...