Name: how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान करार n ° ६८५७७८) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है. यह काम जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (BBSRC, अनुदान संख्या बी ओ/M011186/1, bb/J014516/ DB धंयवाद BBSRC डॉक्टरेट प्रशिक्षण भागीदारी न्यूकैसल-लिवरपूल-डरहम के लिए एक छात्र और डरहम विश्वविद्यालय के वित्त पोषण की ओर योगदान के लिए इस काम के लिए विज्ञान विभाग । हम उनकी मदद के लिए इयान एडवर्ड्स और रसायन विज्ञान मास स्पेक्ट्रोमेट्री विभाग के डरहम विश्वविद्यालय के विभाग उनके वाद्य प्रोटीन एक्स के विश्लेषण के लिए धंयवाद । हम वायरस के साथ अपने काम के लिए Arnthor Ævarsson के लिए आभारी है एक्स परियोजना, और धंयवाद भी क्लेयर Hatty और NanoTemper GmbH को ऋण देने के लिए और इस परियोजना के लिए प्रोमेथियस NT. 48 प्रणाली के साथ सहायता । अंत में, आप BBSRC iCASE पुरस्कार के भाग के रूप में उनके समर्थन के लिए फ्रांसिस Gawthrop और Tozer बीज के लिए धंयवाद ।

1. प्रोटीन सैंपल तैयार करना
<ol><li>९६-अच्छी तरह से ब्लॉकों और भंडारण के लिए मुहर में ५०० µ l aliquots के रूप में स्थिरता स्क्रीन तैयार करना । स्थानांतरण 10 µ एल एक स्थिरता स्क्रीन की एक ९६-अच्छी तरह से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए समय बचाने के लिए प्लेट की इसी अच्छी तरह से एक शर्त (चित्रा 4ए) ।</li>
	<li>एक उचित बफर सिस्टम में लगभग 1 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 प्रोटीन समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें । जबकि एक उपयुक्त बफर की संरचना प्रत्येक प्रोटीन नमूने के साथ बदलता है, की कोशिश करने के लिए एक अच्छा पहला बफर १०० mm NaCl, पीएच ७.२ के साथ 10 मिमी सोडियम फॉस्फेट है । नोट: स्वीकार्य प्रोटीन सांद्रता मामले दर-मामले बदलती हैं, लेकिन ०.५ की एकाग्रता पर्वतमाला-5 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 आम तौर पर विश्लेषण घटता उत्पादन । पतला बफ़र्स प्रत्येक शर्त के प्रभाव मास्किंग से बचने के लिए स्थिरता स्क्रीन के साथ उपयोग के लिए अनुशंसित हैं । विशिष्ट बफ़र रचनाएं लगभग १०० mm NaCl के साथ 10 मिमी बफर हैं ।</li>
	<li>एक TSA प्रयोग प्रदर्शन कर रहे हैं, 20x की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन के नमूने के लिए SYPRO ऑरेंज डाई जोड़ें । या तो उलटा या संक्षिप्त भंवर से मिश्रण ।</li>
	<li>९६-अच्छी तरह से १.१ चरण में तैयार की थाली के प्रत्येक कुआं में प्रोटीन समाधान के 10 µ एल स्थानांतरण (चित्रा 4बी) ।</li>
	<li>सील और ९६ के लिए अच्छी तरह से प्लेट केंद्रापसारक ६०० एक्स जी में 2 मिनट के लिए सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन का नमूना और स्क्रीन घटक मिश्रित कर रहे है (चित्रा 4सी) ।</li>
	<li>फिर से स्थिरता स्क्रीन को सील करें गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक और 4 महीने के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर स्क्रीन की दुकान । अंधेरे में नमक स्क्रीन स्टोर, के रूप में कुछ घटकों सहज हैं ।</li>
	<li>एक nanoDSF प्रयोग करते हैं, तो चरण 2 से जारी रखें । एक TSA प्रयोग प्रदर्शन कर रहा है, तो चरण 4 पर जाएं ।</li>
</ol>2. एक nanoDSF प्रयोग की तैयारी
<ol><li>सुनिश्चित करें कि उपकरण साफ है, नमूना रैक के पास किसी भी धूल के लिए विशेष रूप से ध्यान दे । यदि प्रणाली एक backscattering दर्पण है, यह इथेनॉल और एक एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक का उपयोग कर साफ ।</li>
	<li>खुला दराज बटन दबाकर नमूना दराज खोलें. (चित्रा ५अ).</li>
	<li>समाधान में केशिका के एक छोर को छूने से ९६-well थाली की प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग 10 µ एल के साथ केशिकाओं लोड, तो नमूना रैक (चित्रा 5बी) के इसी केशिका धारकों में उन्हें जगह है । इस प्रयोग के दौरान प्रतिदीप्ति रीडिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, के रूप में फिंगरप्रिंट, आदिके साथ केशिकाओं के बीच दूषित करने के लिए नहीं सावधान रहना ।</li>
	<li>चुंबकीय सील पट्टी (चित्रा 5सी) के साथ केशिकाओं को स्थिर ।</li>
</ol>3. प्रोग्रामिंग एक nanoDSF प्रयोग
<ol><li>डिस्कवरी स्कैन टैब में डिस्कवरी स्कैन प्रारंभ करें बटन दबाकर प्रत्येक केशिका की स्थिति और तीव्रता का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक स्कैन लॉन्च करें । वृद्धि या घटना उत्तेजना ताकत 10% की एक प्रारंभिक शक्ति से कम हर केशिका स्कैन की चोटी 4000-12000 इकाइयों (चित्रा 5डी) के बीच है ।</li>
	<li>सुनिश्चित करने के लिए नमूना जोड़ रहा है और पर्याप्त ध्यान केंद्रित, एक खड़ी तापमान ढाल के साथ एक प्रारंभिक स्कैन पिघल सिफारिश की है । पिघलने स्कैन टैब में, एक प्रोग्राम ७.० ° c न्यूनतम करने के लिए तापमान ढलान विकल्प की स्थापना करके स्कैन पिघल-1, तापमान शुरू करने के लिए 25 ° c और अंत तापमान ९५ ° c करने के लिए, तब दबाकर nanoDSF प्रयोग लांच पिघलने शुरू बटन । यदि परिणामस्वरूप पिघल curves एक detectable मोड़ बिंदु नहीं दिखा है, नमूना आगे ध्यान केंद्रित करने पर विचार या जांच अगर प्रोटीन ठीक से जोड़ रहा है ।</li>
	<li>दोहराएं एक पूर्ण प्रयोग के लिए नमूने तैयार करने के लिए 2.1-2.4 कदम ।</li>
	<li>पिघलने स्कैन टैब में, प्रोग्राम एक पिघला तापमान ढलान विकल्प की स्थापना के द्वारा स्कैन १.० ° c मिनट-1, तापमान शुरू करने के लिए 25 ° c और अंत तापमान ९५ ° c, तो दबाकर nanoDSF प्रयोग प्रक्षेपण पिघलने शुरू बटन ।</li>
</ol>4. एक TSA प्रयोग प्रदर्शन
<ol><li>मजबूती से दराज के दाहिने हाथ की ओर से इंडेंट दबाकर नमूना दराज खोलें. बैक-लेफ्ट (चित्रा 4डी) को अच्छी तरह से A1 के साथ आरटी-पीसीआर सिस्टम में ९६-well ट्रे रखें ।</li>
	<li>एक TSA प्रयोग की स्थापना शुरू करने के लिए नया प्रयोग बटन पर क्लिक करें ।</li>
	<li>प्रयोग गुण टैब में, जब पूछा जाए कि आप किस प्रकार के प्रयोग को सेट करना चाहते हैं , तो वक्र पिघलने के विकल्प पर क्लिक करें? और दूसरा विकल्प यह पूछे जाने पर कि आप लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के लिए कौन-से एजेंट उपयोग करना चाहते हैं?
</li>
	<li>में प्लेट सेटअप/लक्ष्य और नमूने टैब को परिभाषित करने के लिए, एक लक्ष्य नाम दर्ज करें तो ROX और शमनकर्ता के रूप में कोई भी रिपोर्टर के रूप में सेट ।</li>
	<li>में प्लेट सेटअप/असाइन लक्ष्य और नमूने टैब, पिछले चरण में दर्ज लक्ष्य नाम के लिए ९६-well प्लेट की हर अच्छी तरह से असाइन करें. एक ही टैब में, सेट के रूप में कोई भी निष्क्रिय संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए डाई का चयन करें ।</li>
	<li>कोई कुल तीन है जब तक कि विधि चलाएँ टैब में, चरणों को हटाएँ । २५.० डिग्री सेल्सियस, रैंप दर १००%, समय 00:05 के लिए पहला कदम सेट; ९५.० डिग्री सेल्सियस, रैंप दर 1%, समय 01:00 के लिए दूसरा कदम; ९५.० डिग्री सेल्सियस, रैंप दर १००%, समय 00:05 के लिए तीसरे चरण । डेटा एकत्रित करें ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके या डेटा संग्रह चिह्न (चित्र 6) दबाकर डेटा एकत्रित करना चुनें.</li>
	<li>20 µ एल के लिए अच्छी तरह से प्रति प्रतिक्रिया मात्रा निर्धारित करें</li>
	<li>प्रेस शुरू भागो बटन TSA प्रयोग शुरू करने के लिए ।</li>
</ol>5. डेटा विश्लेषण
<ol><li>एक तरंग दैर्ध्य के साथ एक पिघल वक्र साजिश चुनें । nanoDSF प्रयोगों के लिए, ३३० एनएम और ३५० एनएम में प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात (इसी tryptophan के लिए ध्रुवीय और ध्रुवीय वातावरण में, क्रमशः)13 सामांयतः प्रयोग किया जाता है । सबसे TSAs के लिए, डाई उत्सर्जन अधिकतम पिघलने के लिए उपयुक्त है वक्र साजिश रचने (SYPRO ऑरेंज के उत्सर्जन अधिकतम ५६९ एनएम है)12।</li>
	<li>प्रत्येक हालत के टीएम मूल्यों की गणना प्रत्येक पिघल वक्र के मोड़ बिंदु (ओं) का निर्धारण करके । अधिकांश nanoDSF प्रणालियों स्वचालित रूप से आंकड़ा अधिग्रहण के बाद पिघल curves के संख्यात्मक भेदभाव से टीएम मूल्यों की गणना । यदि सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया स्वचालित रूप से टीएम मूल्यों की गणना नहीं करता है, मुफ्त, वैकल्पिक जीयूआई-ऐसे नामि11 के रूप में संचालित सॉफ्टवेयर डेटा विश्लेषण और बहाव प्रसंस्करण स्वचालित कर सकते हैं, एक हीटमैप सारांश टीएम उत्पादन का विकल्प दे पूरे ९६ के लिए मान-अच्छी तरह से प्रयोग (साथ संदर्भ के मार्गदर्शन और नामि साथ डेटा प्रोसेसिंग के लिए संसाधन प्रदान करता है) ।</li>
	<li>सर्वे की गई सभी शर्तों के टीएम मूल्यों की तुलना करें । स्थिरता स्क्रीन प्रत्येक स्क्रीन (A1 और A2) है कि केवल पानी में दो कुओं होते हैं । पानी लेने केवल एक बेंचमार्क के रूप में मूल्यों ΔTएम मूल्यों की गणना की अनुमति देता है, व्यवस्थित त्रुटियों को संबोधित और प्रभाव स्थिर करने की अनुमति आसान तुलना. उच्च टीएम मूल्यों के बहाव के उपयोग के लिए सिफारिश कर रहे हैं, जो थर्मल स्थिर परिस्थितियों को इंगित । आशाजनक स्थितियां अक्सर उनके स्थिरीकरण में एकाग्रता पर निर्भरता दर्शाती हैं ।</li>
</ol>

<ol>
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A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+pyruvate+kinases+display+evolutionarily+divergent+allosteric+strategies.">Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies.</a> Royal Society open science. 1 (140120), (2014).</li><li>Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aldehyde+dehydrogenase+1A3+complexed+with+NAD++and+retinoic+acid.">Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid.</a> Scientific reports. 6 (35710), (2016).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल है केंद्रापसारक कदम और ९६ के उचित सील-TSA प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से थाली (१.५ कदम) । केंद्रापसारक सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन का नमूना और स्क्रीन हालत संपर्क और मिश्रण में आते हैं । इसके अतिरिक्त, एक सील प्लेट एक TSA प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है, तो प्रयोग भर में विलायक वाष्पीकरण का एक महत्वपूर्ण जोखिम है, नमूना एकाग्रता में वृद्धि के कारण और समय से पहले प्रोटीन एकत्रीकरण की संभावना बढ़ रही है ।
TSAs और nanoDSF प्रोटीन नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी हैं; नमूनों की विशाल बहुमत एक hydrophobicity आधारित रिपोर्टर डाई के साथ या डाई मुक्त nanoDSF के माध्यम से व्याख्यात्मक पिघल घटता उत्पादन कर सकते हैं. यदि मानक प्रतिदीप्ति सूत्रों अपने प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हैं, प्रोटोकॉल है कि पता लगाया जा सकता है के लिए सरलतम संशोधन fluorophore की पसंद है । कई वैकल्पिक रंजक TSA प्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है । उदाहरणों में शामिल है N-[4-(7-diethylamino-4-मिथाइल-3-coumarinyl) फिनाइल] maleimide (सीपीएम), एक यौगिक है कि एक fluoresces27के साथ प्रतिक्रिया करने के बाद thiol, और 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), एक यौगिक है कि अपने प्रतिदीप्ति के आधार पर बदलता है अपने पर्यावरण की कठोरता, एक प्रोटीन नमूने के रूप में अपनी प्रतिदीप्ति में वृद्धि28,29 (उत्तरार्द्ध डाई अक्सर नमूना के उच्च सांद्रता की आवश्यकता है) करेंगी ।
पिघल वक्र विश्लेषण के वैकल्पिक तरीकों उपलब्ध है अगर टीएम स्वचालित रूप से साधन सॉफ्टवेयर द्वारा गणना नहीं है । यदि डेटा समरूप है और केवल एक विकार चरण में पिघल curves स्पष्ट है, तो एक छोटा dataset बोल्ट्जमान अवग्रह के साथ निंन समीकरण के लिए फ़िट किया जा सकता:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg">
जहां च तापमान टी, एफमिनट और एफमैक्स पर प्रतिदीप्ति तीव्रता है प्रतिदीप्ति तनाव से पहले और बाद विकार संक्रमण, क्रमशः, टीएम विकार संक्रमण और सी के मध्यबिंदु तापमान है टीएमपर ढलान है । हालांकि इस विधि सरल दो कदम विकार प्रक्रियाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यह कई संक्रमण के साथ जटिल पिघल curves के लिए अनुपयुक्त है ।
TSA के प्रमुख लाभों में से एक इसकी पहुंच है; TSA प्रयोगों प्रतिदीप्ति डाई कार्यरत के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर फिल्टर के साथ किसी भी आरटी-पीसीआर प्रणाली में किया जा सकता है । यह उपभोग्य सामग्रियों की कम लागत के साथ युग्मित, ऑपरेशन की आसानी और प्रोटीन की जरूरत अपेक्षाकृत कम राशि, TSA परियोजना तराजू की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक मूल्यवान तकनीक बनाने, दोनों उद्योग और शिक्षा में ।
के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुकूल बफर शर्तों का संकेत है, स्क्रीन कुछ कुओं कि एक नमूना प्रोटीन के भीतर संरचनात्मक धातुओं की उपस्थिति के लिए सुराग दे सकता है होते हैं । कुओं कि नमक स्क्रीन में विशेष रुचि के हो सकता है G6 और G7, जो क्रमशः 5 मिमी EDTA और 5 मिमी EGTA होते हैं । महत्वपूर्ण इन कुओं में थर्मल स्थिरीकरण प्रोटीन है कि chelants द्वारा तनहा है में महत्वपूर्ण धातु आयनों का संकेत हो सकता है । osmolyte स्क्रीन के भीतर यौगिकों भी संभावित एक प्रोटीन के समारोह के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं । स्क्रीन में यौगिकों के कई अणु की कक्षाएं है कि एंजाइमों की आम सब्सट्रेट कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सामांय स्थिरीकरण saccharides द्वारा afforded (वेल्स A11-B10 में मौजूद) lysozyme के लिए उनके संरचनात्मक समानता एंजाइम की स्थापित सब्सट्रेट करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, N-acetylglucosamine oligomers30।
TSA और nanoDSF प्रोटोकॉल ऊपर उल्लिखित भी प्रोटीन ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । लाइगैंडों कि विशेष रूप से एक प्रोटीन को बांध परिसर के भीतर नई बातचीत शुरू करने से अपने थर्मल स्थिरता में वृद्धि कर सकते हैं । प्रोटीन टीएम में एक खुराक पर निर्भर सकारात्मक बदलाव एक सफल प्रोटीन-ligand बातचीत का एक आशाजनक संकेत है । गति, प्रवाह और TSAs के साथ यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के कम लागत यह प्रारंभिक चरण दवा खोज में एक बहुत लोकप्रिय तरीका बना दिया है ।
लक्ष्य प्रोटीन और उनके ligand परिसरों के बफर शर्तों के अनुकूलन एक परियोजना की सफलता के लिए आवश्यक हो सकता है, के रूप में कई साहित्य उदाहरण31,३२,३३,३४का प्रदर्शन । एक ठेठ सेटअप समय, TSAs और स्थिरता स्क्रीन के साथ मिलकर nanoDSF सहित 2 एच के तहत ले परख के साथ बफर अनुकूलन के लिए एक तेजी से, सस्ती तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

कई प्रौद्योगिकी उपयोगी एंजाइमों वायरल स्रोतों से शुरू, जैसे कि तंबाकू खोदना वायरस (टेव)1 और मानव राइनोवायरस प्रकार 3 सी (HRV 3 सी) को छेड़ो2। Horizon2020 वायरस एक्स परियोजना (चित्रा 1)3. इस कार्यक्रम का उद्देश्य (क) ज्ञात एंजाइम परिवारों के गुणों की सीमा का विस्तार करने के लिए है और (ख) अभी तक अज्ञात समारोह के उपंयास एंजाइमों की विशेषताएं (एंजाइम एक्स) । Crystallographic संरचना निर्धारण लक्ष्य प्रोटीन लक्षण वर्णन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां प्रोटीन अनुक्रम मांयता4से परे विकसित किया है । प्रोटीन स्थिरता क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कारक है; नमूने समरूप और संरचनात्मक रूप से उच्च गुणवत्ता, diffracting क्रिस्टल बनाने के लिए समय की एक अवधि से अधिक ध्वनि होना चाहिए । इसके अलावा, यह गतिविधि परख के लिए आवश्यक है कि प्रोटीन उनके सक्रिय रूप में मौजूद है, जो भी एक अनुकूल आणविक वातावरण की सुविधा हो सकती है ।
crystallographers के लिए उपलब्ध प्रौद्योगिकी के विकास के बावजूद, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण एक समय लेने वाली और श्रम गहन अनुभवजंय प्रक्रिया5रहता है । प्रारंभिक भौतिक प्रयोगों में प्रोटीन स्थिरता में सुधार करने के लिए स्पष्ट रूप से प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक बेहतर प्रारंभिक बिंदु दे और आमतौर पर केवल प्रोटीन नमूना6,7की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि का उपभोग, 8,9. लक्ष्य प्रोटीन की बड़ी संख्या में इस परियोजना में अध्ययन किया जा करने के लिए भी आवश्यक स्केलेबल, उच्च प्रवाह स्थिरता परख । एक पूर्व के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक-क्रिस्टलीकरण प्रोटीन के भौतिक लक्षण वर्णन थर्मल शिफ्ट परख (भी TSA या अंतर स्कैनिंग fluorimetry, DSF)10,11के रूप में जाना जाता है ।
TSAs एक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई को रोजगार के लिए प्रोटीन के नमूनों की थर्मल विकार ट्रैक । कई सामांयतः-रंजक इस्तेमाल अपने पर्यावरण के ध्रुवीकरण के आधार पर चर प्रतिदीप्ति गतिविधि है, अक्सर hydrophobic वातावरण में एक उच्च प्रतिदीप्ति उत्पादन प्रदर्शित लेकिन ध्रुवीय वातावरण12में तेजी से शमन के दौर से गुजर । प्रोटीन आमतौर पर डाई प्रतिदीप्ति में स्पष्ट वृद्धि के कारण के रूप में उनके hydrophobic कोर विकार के दौरान उजागर हो, अक्सर बहुत उच्च तापमान पर डाई प्रतिदीप्ति में कमी के बाद प्रोटीन के रूप में कुल शुरू (चित्रा 2) ।
जबकि एक hydrophobicity-संवेदनशील डाई अक्सर एक सामांय उपयोग TSA डाई के लिए एक अच्छा विकल्प है, यह बड़े, विलायक उजागर hydrophobic क्षेत्रों, जो अक्सर हानिकारक उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदर्शन के साथ प्रोटीन के लिए अनुपयुक्त हो सकता है । कार्रवाई के वैकल्पिक साधनों के साथ Fluorophores मौजूद (चर्चा देखें), लेकिन यह बजाय nanoDSF के साथ आंतरिक प्रोटीन प्रतिदीप्ति के माध्यम से विकार ट्रैक वांछनीय हो सकता है ।
Tryptophan अवशेषों कि ३३० एनएम के एक उत्सर्जन अधिकतम के साथ एक प्रोटीन fluoresce के ध्रुवीय क्षेत्रों में दफन कर रहे हैं । एक प्रोटीन नमूने के रूप में करेंगी और इन अवशेषों एक ध्रुवीय विलायक को उजागर हो, उनके उत्सर्जन अधिकतम ३५० एनएम13के लिए एक bathochromic बदलाव से गुजरना । nanoDSF बाह्य fluorophores14के लिए आवश्यकता के बिना एक प्रोटीन नमूने का खुलासा जांच करने के लिए उत्सर्जन अधिकतम में इस बदलाव का दोहन ।
पिघल एक विकार कदम दिखा घटता एक बोल्ट्जमान sigmoidal मॉडल के लिए डेटा फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । खुलासा संक्रमण के मोड़ बिंदु पर तापमान (टीएम) प्रोटीन थर्मल स्थिरता और एक बेंचमार्क के एक मात्रात्मक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है विभिंन स्थितियों के पक्ष की तुलना ।
पिघला विभिंन स्थितियों में एक ही प्रोटीन के curves विविधता है कि एक बोल्ट्जमान sigmoidal फिटिंग व्यवहार्य बना सकते है की एक डिग्री के अधिकारी कभी नहीं । डेटा से टीएम मूल्यों विचार है कि क्लासिक वक्र टोपोलॉजी से भटक, संख्यात्मक तरीके ऐसे नामि, एक खुला स्रोत TSA डेटा विश्लेषण कार्यक्रम11में कार्यरत लोगों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक ऊष्मा चौखटे भी ऐसे ProteoPlex15पद्धति के रूप में कई विकार कदम, के साथ और अधिक जटिल curves का विश्लेषण किया जा सकता है ।
स्थिरता स्क्रीन TSA और nanoDSF प्रयोगों में उपयोग के लिए तेजी से एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल परिस्थितियों की पहचान करने के लिए डिजाइन किए गए थे (चित्रा 3, स्क्रीन रचनाओं पूरक जानकारी में उपलब्ध हैं) । जानकारी स्क्रीन के साथ इकट्ठा crystallographic पाइपलाइन के कई चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है सहित: नमूना भंडारण; शुद्धिकरण, प्रोटीन शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान खुलासा करने के माध्यम से उपज हानि को कम; परख डिजाइन, थर्मल स्थिर बफ़र्स और अंत में क्रिस्टलीकरण के साथ गतिविधि परख में प्रोटीन कार्यक्षमता मजबूत, तर्कसंगत डिजाइन क्रिस्टलीकरण परीक्षण मार्गदर्शक ।
एक प्रोटीन नमूने के लिए एक उपयुक्त बफर सिस्टम के आधार का चयन महत्वपूर्ण है; असंगत पीएच मान एक प्रोटीन की निष्क्रियता या विकार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, सह के एक बड़ी संख्या में हल-सघन बफर अणुओं की उपस्थिति एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाओं (तालिका 1) भी एक स्थिर प्रभाव है कि सरल पीएच विनियमन के लिए अलग है और इसके बजाय रासायनिक से उपजी का संकेत हो सकता है बफर अणु की विशेषताएँ.
अंय सामांयतः जैविक रूप से संगत बफर सिस्टम के साथ है गुड buffers17,18,19 के कई का उपयोग कर तैयार की, पीएच स्क्रीन पर एक बफर अणु के रासायनिक प्रभाव deconvolute के लिए डिज़ाइन किया गया है परिणामस्वरूप समाधान के वास्तविक पीएच से प्रोटीन स्थिरता । प्रत्येक बफर सिस्टम के लिए तीन पीएच मूल्यों को उपलब्ध कराने और विभिंन प्रणालियों के बीच पीएच मूल्य अतिरेक को शामिल करके, पीएच स्क्रीन दोनों अनुकूल पीएच मूल्यों और एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल बफर सिस्टम की पहचान कर सकते हैं ।
नमक स्क्रीन आमतौर पर प्रयोगशाला लवण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से chaotropes, chelants, भारी धातुओं और एजेंटों को कम होता है । स्क्रीन उच्च ईओण ताकत के साथ वातावरण के लिए एक प्रोटीन नमूना के संबध के एक सामांय संकेत दे सकते हैं, लेकिन यौगिकों के प्रत्येक उपसमूह भी एक प्रोटीन की क्षमता संरचना के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक chelant काफी एक प्रोटीन स्थिर नमूना के भीतर महत्वपूर्ण संरचनात्मक धातुओं का संकेत हो सकता है । नमूना भी दृढ़ता से स्क्रीन के भीतर एक धातु कटियन द्वारा स्थिर है, तो यह आगे संरचनात्मक प्रयोगों के लिए एक आशाजनक प्रारंभिक बिंदु प्रदान कर सकते हैं ।
Osmolytes घुलनशील यौगिकों कि उनके पर्यावरण के आसमाटिक गुणों को प्रभावित कर रहे हैं । प्रकृति में, वे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है "रासायनिक chaperones", परिक्रमा प्रोटीन की तह लागू करने और उन्हें स्थिर, विशेष रूप से तनाव की स्थिति में20,21,22. ये विशेषताएँ उन्हें प्रोटीन क्रि में आकर्षक additives बनाते हैं; क्रिस्टल संचयन के दौरान cryoprotectants के रूप में प्रयोग करने योग्य, बढ़ते और भंडारण23प्रक्रियाओं । Osmolytes ' संभावित उपयोग भी प्रोटीन की शुद्धि के लिए फैली हुई है. रिकॉमबिनेंट ई. कोलाई में व्यक्त प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण अनुपात अघुलनशील और देशी राज्य में ठीक करने के लिए मुश्किल मानक शोधन विधियों का उपयोग कर सकते हैं । Osmolytes को स्थिर और अघुलनशील भिन्नताओं से प्रोटीन को उबारने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शुद्धीकरण पैदावार में वृद्धि24.
osmolyte स्क्रीन प्रोटीन डेटा बैंक प्रविष्टियों में वर्तमान स्थापित यौगिकों का उपयोग कर डिजाइन किया गया था25 और Osmoprotection के ड्रैगन एक्सप्लोरर-जुड़े रास्ते (DEOP)26 डाटाबेस और iteratively मानक प्रोटीन का उपयोग कर अनुकूलित । स्क्रीन osmolyte के आठ उपवर्गों के आसपास बनाया गया है: ग्लिसरॉल, शर्करा और polyols, गैर-डिटर्जेंट sulfobetaines (NDSBs), betaines और उनके एनालॉग, organophosphates, dipeptides, अमीनो एसिड और उनके डेरिवेटिव और एक अंतिम विविध समूह । प्रत्येक osmolyte तुलना के लिए अपनी घुलनशीलता और प्रभावी एकाग्रता पर्वतमाला के आधार पर कई सांद्रता में मौजूद है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:71px;">Melford Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L38100</td>
			<td style="width:435px;">Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham pH Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-101</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham Salt Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-102</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">The Durham Osmolyte Screen</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S6651</td>
			<td style="width:435px;">Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well PCR Plate</td>
			<td style="width:71px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">1403-7700</td>
			<td style="width:435px;">Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td style="width:71px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4362143</td>
			<td style="width:435px;">96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:216px;">Prometheus NT.48</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (&#916;G and &#916;&#916;G), and aggregation results (Tagg) using built-in software.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PR-C002</td>
			<td style="width:435px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. &#34;High sensitivity&#34; variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (&#60;200 &#181;g ml-1).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project

Horizon2020 वायरस एक्स परियोजना २०१५ में चयनित चरम biotopes और डिस्कवर उपंयास वायरल प्रोटीन की virosphere का पता लगाने के लिए स्थापित किया गया था । इन प्रोटीन के संभावित तकनीकी मूल्य का मूल्यांकन करने के लिए, प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों का विश्लेषण इस कार्यक्रम में एक केंद्रीय चुनौती है । प्रोटीन के नमूने की स्थिरता के लिए सार्थक परख परिणाम प्रदान करने और लक्ष्यों की सघन वृद्धि आवश्यक है । थर्मल शिफ्ट परख (TSA), एक प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक, उच्च प्रवाह में प्रोटीन स्थिरता के लिए शर्तों के अनुकूलन के लिए एक लोकप्रिय विधि के रूप में स्थापित किया गया है । TSAs में कार्यरत fluorophores बाह्य हैं, पर्यावरण के प्रति संवेदनशील रंजक हैं. एक वैकल्पिक, इसी तरह की तकनीक नैनो अंतर स्कैनिंग fluorimetry (nanoDSF) है, जो प्रोटीन देशी प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है । हम यहां एक उपंयास osmolyte स्क्रीन, जैविक additives के एक ९६ की स्थिति स्क्रीन प्रारंभिक TSA प्रयोगों के माध्यम से क्रिस्टलीकरण परीक्षण के लिए मार्गदर्शन डिजाइन प्रस्तुत करते हैं । पहले से विकसित पीएच और नमक स्क्रीन के साथ, तीन स्क्रीन के सेट बफर सिस्टम और additives की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रोटीन स्थिरता का एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है । स्क्रीन की उपयोगिता TSA और lysozyme और प्रोटीन एक्स, वायरस एक्स परियोजना के एक लक्ष्य प्रोटीन के nanoDSF विश्लेषण में प्रदर्शन किया है ।

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How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

कैसे प्रोटीन को स्थिर करने के लिए: थर्मल शिफ्ट परख और वायरस एक्स परियोजना में नैनो अंतर स्कैनिंग Fluorimetry के लिए स्थिरता स्क्रीन

एक प्रोटोकॉल तेजी से थर्मल शिफ्ट परख और नैनो अंतर स्कैनिंग fluorimetry के माध्यम से शर्तों की एक किस्म में प्रोटीन के थर्मल स्थिरता परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया है । बफर सिस्टम, लवण और additives, एक साथ तीन अद्वितीय स्थिरता स्क्रीन शामिल, प्रोटीन के साथ परख के लिए कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त बफ़र्स की पहचान कर रहे हैं ।

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

यह विधि प्रोटीन रसायन विज्ञान और दवा की खोज में सवालों के जवाब दे सकती है जैसे कि कौन सी स्थितियां प्रोटीन को स्थिर कर देती हैं? कौन सा उत्परिवर्तन एंजाइम की थर्मोस्थेबिलिटी को प्रभावित करता है? और कौन सा लिगामेंट्स प्रोटीन लक्ष्य से बांधते हैं?इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह तेजी से, आसानी से एक मानक प्रयोगशाला में किया जाता है, और मध्यम से उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए पूरी तरह से अनुकूल है। प्रोटीन नमूना हस्तांतरण तैयार करने के लिए एक स्थिरता स्क्रीन की प्रत्येक स्थिति के 10 माइक्रोलीटर एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 96 अच्छी तरह से प्लेट के इसी कुएं में समय बचाने के लिए। फिर एक उपयुक्त बफर प्रणाली में लगभग एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रोटीन समाधान का एक मिलीलीटर तैयार करें।यदि थर्मल शिफ्ट परख का प्रदर्शन करते हैं तो प्रोटीन नमूने में SYPRO नारंगी डाई को 20X की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। या तो उलटा या एक संक्षिप्त भंवर से मिलाएं। अब प्रोटीन समाधान के 10 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें।सील और अपकेंद्रित्र ६०० बार जी पर दो मिनट के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली प्रोटीन नमूना और स्क्रीन घटक सुनिश्चित करने के लिए मिलाया जाता है । स्थिरता स्क्रीन डीप वेल ब्लॉक को फिर से सील करें और स्क्रीन को चार महीने तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। टीएसए प्रयोग करने के लिए, दराज के दाहिने हाथ की ओर मजबूती से मांगपत्र दबाकर नमूना दराज खोलें।96 अच्छी ट्रे को आरटीपीसीआर सिस्टम में अच्छी तरह से ए-वन के साथ बैक लेफ्ट में रखें। TSA प्रयोग सेट करना शुरू करने के लिए नए प्रयोग बटन पर क्लिक करें। प्रयोग गुण टैब में, मेल्ट कर्व विकल्प पर क्लिक करें जब उनसे पूछा गया, आप किस प्रकार का प्रयोग स्थापित करना चाहते हैं?फिर दूसरे विकल्प पर क्लिक करें जब उनसे पूछा गया कि आप टारगेट सीक्वेंस का पता लगाने के लिए कौन से रिएजेंट्स का इस्तेमाल करना चाहते हैं? प्लेट सेटअप में, लक्ष्य और नमूने टैब को परिभाषित करें, एक लक्ष्य नाम दर्ज करें, फिर रिपोर्टर को रॉक्स के रूप में सेट करें। और कोई नहीं के रूप में Quencher ।प्लेट सेटअप में, लक्ष्य और नमूने टैब असाइन करें, डाइ को निष्क्रिय संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए चुनें। एक ही टैब में, पिछले चरण में दर्ज लक्ष्य नाम के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट के हर कुएं को आवंटित करें। रन मेथड टैब में, चरणों को तब तक हटाएं जब तक कि कुल तीन न हों।100% की रैंप दर और पांच सेकंड के समय के साथ, 25 डिग्री सेल्सियस के लिए पहला कदम निर्धारित करें। 1% की रैंप दर और एक मिनट के समय के साथ, 95 डिग्री सेल्सियस के लिए दूसरा कदम निर्धारित करें। अंत में, 100% की रैंप दर और पांच सेकंड के समय के साथ 95 डिग्री सेल्सियस तक तीसरा कदम निर्धारित करें।डेटा ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करके या डेटा संग्रह आइकन पर क्लिक करके डेटा एकत्र करने के लिए चुनें। 20 माइक्रोलीटर के लिए प्रति अच्छी तरह से प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करें। टीएसए प्रयोग शुरू करने के लिए स्टार्ट रन बटन पर क्लिक करें।नैनोडएसएफ का उपयोग बाह्य रंगों के उपयोग के बिना प्रोटीन थर्मल स्थिरता की जांच करने के लिए किया जा सकता है। नमूने 96 अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार किया जा सकता है के रूप में प्रोटोकॉल में पहले वर्णित है लेकिन किसी भी SYPRO नारंगी डाई जोड़ने के बिना। ओपन ड्रामे का बटन दबाकर सैंपल ड्रार खोलें।सुनिश्चित करें कि उपकरण साफ है, नमूना रैक के पास किसी भी धूल पर विशेष ध्यान दे रहा है। यदि सिस्टम में इथेनॉल और लिंट मुक्त ऊतक का उपयोग करके दर्पण को वापस साफ किया गया है। समाधान में केशिका के एक छोर को छूकर 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से लगभग 10 माइक्रोलीटर के साथ केशिकाओं को लोड करें।और फिर नमूना रैक के इसी केशिका धारकों में केशिका रखें। उंगलियों के निशान के साथ केशिकाओं के बीच दूषित नहीं सावधान रहें क्योंकि यह पूरे प्रयोग में फ्लोरेसेंस रीडिंग में हस्तक्षेप कर सकता है। एक चुंबकीय सीलिंग पट्टी के साथ केशिकाओं को स्थिर करें।डिस्कवरी स्कैन टैब में स्टार्ट डिस्कवरी स्कैन बटन दबाकर प्रत्येक केशिका की स्थिति और तीव्रता का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक स्कैन लॉन्च करें। वृद्धि या 10% की एक प्रारंभिक शक्ति से घटना उत्तेजन शक्ति को कम जब तक हर केशिका स्कैन के शिखर 4, 000 और 12, 000 इकाइयों के बीच है । पिघलने स्कैन टैब कार्यक्रम में 7.0 डिग्री प्रति मिनट के लिए तापमान ढलान विकल्प स्थापित करके एक पिघल स्कैन।तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस तक शुरू करें। और तापमान 95 डिग्री सेल्सियस तक समाप्त करें। इसके बाद स्टार्ट मेल्टिंग बटन दबाकर नैनोडएसएफ प्रयोग को लॉन्च करें।नमूनों को पूर्ण प्रयोग के लिए तैयार करने के लिए इन चरणों को दोहराएं। एक बार पूरा प्रयोग सेट हो जाने के बाद, पिघलने वाले स्कैन टैब पर नेविगेट करें, और तापमान ढलान विकल्प को 1.0 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट सेट करके पिघल स्कैन प्रोग्राम करें। तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस तक शुरू करें।और तापमान 95 डिग्री सेल्सियस तक समाप्त करें। अंत में, स्टार्ट मेल्टिंग बटन दबाकर नैनोडीएसएफ प्रयोग लॉन्च करें। टी एम का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों की अनुकूलता की तुलना करने के लिए बेंचमार्क में प्रोटीन थर्मल स्थिरता के मात्रात्मक उपाय के रूप में किया जाता है।यहां दिखाया गया है नमक स्क्रीन से नमूना परिणाम, lysozyme की ओर अमोनियम क्लोराइड के थर्मल स्थिर गुणों का उदाहरण । पीएच स्क्रीन के साथ lysozyme के टी एम मूल्यों की तुलना से पता चलता है कि TSA और nanoDSF के बीच समझौता आम तौर पर अच्छा है, लेकिन nanoDSF TSA की तुलना में थोड़ा बड़ा टी एम बदलाव में थोड़ा अधिक टी एम मूल्यों की पहचान करने की प्रवृत्ति से पता चलता है । पीएच मूल्यों को कम करने के साथ स्थिरता बढ़ाने की एक सामान्य प्रवृत्ति है।समान पीएच मूल्यों के साथ विभिन्न बफर सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त टी एम मूल्यों की सीमा महत्वपूर्ण हो सकती है। प्रत्येक स्थिरता स्क्रीन से उच्चतम टीएसए टी एम मूल्यों को उत्पन करने वाली स्थितियों के lysozyme संयोजनों के लिए एक सहक्रियात्मक संयुक्त प्रभाव की जांच करने के लिए परीक्षण किया गया था। बफर सिस्टम के अधिक घटकों को जोड़े जाने के रूप में टी एम मूल्यों में सामान्य वृद्धि हुई है।एक उल्लेखनीय सहक्रियात्मक प्रभाव तब हो सकता है जब बफर के व्यक्तिगत घटकों को अनुकूलित किया जाता है और स्थिरता स्क्रीन के साथ संयुक्त किया जाता है। इस तकनीक के बाद अन्य तरीकों जैसे कि क्रिस्टलीकरण का उपयोग प्रोटीन की त्रि-आयामी संरचना को निर्धारित करने और लिगांड बाध्यकारी के लिए आणविक आधार को जानने के लिए किया जा सकता है। साथ ही हम वायरस-एक्स परियोजना के हिस्से के रूप में प्रोटीन स्थिरता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, यह तकनीक दवा खोज और विकास प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

अंतर स्कैनिंग उष्मामिति - थर्मल स्थिरता और प्रोटीन एंटीजन की रचना का आकलन के लिए एक विधि

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

प्रोटीन-टीआरएनए एगरोस जेल डिटैडेडेशन एसेरेस ऑफ़ द एनालिसिस<em&gt; एन</em<sup&gt; 6</sup&gt; -रेरोनीएल्कार्बामॉलेडिनोसिन टीसीडीए फंक्शन

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

कैसे थोक में और जीने की कोशिकाओं में Photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश को बढ़ाता है

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली और सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण के लिए क्रायोतैयारी पर सेल कल्चर

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...