Name: how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00
Duration: 7 min 22 s
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Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (beca Convenio n ° 685778). Este trabajo fue apoyado por la biotecnología y el Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC, grant números M011186/BB/1, J014516/BB/1). DB gracias el BBSRC Doctoral formación Asociación Newcastle-Liverpool-Durham para una beca y Departamento de biociencias de la Universidad de Durham para contribuir a la financiación de este trabajo. Agradecemos a Ian Edwards por su ayuda y el Departamento de la Durham University Departamento de química espectrometría de masas para su análisis instrumental de la proteína X. Agradecemos a Arnthor Ævarsson por su trabajo con el proyecto de Virus X y gracias también a Claire Hatty y NanoTemper GmbH para financiamiento y asistencia con el sistema de Prometheus NT.48 para este proyecto. Por último, gracias a Frances Gawthrop y Tozer semillas por su apoyo como parte del Premio de iCASE BBSRC.

1. preparación de la muestra de proteína
<ol><li>Formular las pantallas estabilidad como 500 alícuotas μL en bloques de 96 pocillos y sello para el almacenamiento. Transferir 10 μl de cada condición de una pantalla de estabilidad a los correspondientes de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal para ahorrar tiempo (figura 4A).</li>
	<li>Preparar 1 mL de una solución de proteína aproximadamente 1, mg mL-1 en un sistema apropiado. Mientras que la composición de un tampón apropiado varía con cada muestra de proteína, un buen buffer primera intentar es fosfato de sodio 10 mM con 100 mM NaCl, pH 7.2. Nota: Concentraciones de proteínas aceptable varían caso por caso, pero los rangos de concentración de 0.5 - 5 mg mL-1 suelen producen curvas analizables. Tampones diluidos se recomiendan para el uso con las pantallas de estabilidad para evitar enmascarar los efectos de cada condición. Composiciones típicas buffer son aproximadamente 10 mM de tampón con alrededor de 100 mM de NaCl.</li>
	<li>Si se realiza un experimento TSA, añadir colorante SYPRO Orange a la muestra de proteína a una concentración final de 20 x. Mezclar bien por inversión o Vortex breve.</li>
	<li>Transferir 10 μl de la solución de proteína en cada pocillo de la placa de 96 pocillos preparada en el paso 1.1 (figura 4B).</li>
	<li>Sello y centrifugar la placa de 96 pocillos por 2 min a 600 x g para el componente proteico de la muestra y la pantalla se mezclan (figura 4C).</li>
	<li>Volver a cerrar la pantalla de estabilidad bloque pozo profundo y guarde la pantalla a 4 ° C hasta por 4 meses. Guarde la pantalla sal en la oscuridad, ya que algunos componentes son fotosensibles.</li>
	<li>Si se realiza un experimento de nanoDSF, continuar al paso 2. Si se realiza un experimento TSA, vaya al paso 4.</li>
</ol>2. preparación de un experimento de nanoDSF
<ol><li>Asegúrese de que el equipo esté limpio, prestando especial atención a cualquier polvo cerca de la gradilla de muestras. Si el sistema tiene un espejo de retrodispersión, limpiar con etanol y una pelusa.</li>
	<li>Abrir el cajón de muestra pulsando el botón de Cajón abierto . (Figura 5A).</li>
	<li>Cargar los capilares con aproximadamente 10 μl de cada pocillo de la placa de 96 pocillos por tocar un extremo del tubo capilar en la solución, luego colocarlos en los correspondientes soportes capilares de la gradilla de muestras (figura 5B). Tenga cuidado de no contaminar el medio de los capilares con las huellas dactilares, etcetera., ya que esto podría interferir con la lectura de fluorescencia durante todo el experimento.</li>
	<li>Inmovilizar los capilares con la tira del lacre magnético (figura 5C).</li>
</ol>3. programar un nanoDSF experimento
<ol><li>Iniciar una exploración preliminar para detectar la posición y la intensidad de cada capilar presionando el botón Iniciar exploración de descubrimiento en la ficha de Descubrimiento exploración aumento o disminución de la fuerza de excitación incidente de una potencia inicial de 10% hasta el máxima de cada análisis capilar está entre 4.000-12.000 unidades(figura 5).</li>
	<li>Para asegurar la muestra es doblada y suficientemente concentrada, se recomienda una exploración de la fusión inicial con un escarpado gradiente de la temperatura. En la ficha De fusión escanear , programa un derretimiento analizar la opción de Temperatura cuesta de 7,0 ° C min-1, Iniciar la temperatura a 25 ° C y la Temperatura final a 95 ° C, luego lanzar el nanoDSF experimentar pulsando el Iniciar fusión botón. Si la resultante del derretimiento curvas no muestran un punto de inflexión detectable, considere concentrando la muestra más o comprobar si la proteína se dobla correctamente.</li>
	<li>Repita los pasos 2.1-2.4 para preparar las muestras para un experimento completo.</li>
	<li>En la ficha De fusión escanear , programa un derretimiento analizar la opción de Pendiente de la temperatura de 1.0 ° C min-1, Iniciar la temperatura a 25 ° C y la Temperatura final a 95 ° C, luego lanzar el nanoDSF experimentar pulsando el botón de Inicio de fusión .</li>
</ol>4. realizar un experimento TSA
<ol><li>Abrir el cajón de muestra presionando firmemente el guión en el lado derecho del cajón. Coloque la bandeja de 96 pocillos en el sistema de RT-PCR con A1 bien a la izquierda detrás (figura 4D).</li>
	<li>Pulsa el botón Nuevo experimento para empezar a configurar un experimento TSA.</li>
	<li>En la ficha del Experimento de propiedades , haga clic en la opción Curva fundir cuando se le preguntó ¿Qué tipo de experimento quieres configurar? y la otra opción cuando se le preguntó reactivos que desea utilizar para detectar la secuencia Diana?
</li>
	<li>En la instalación de placa / definir objetivos y muestras ficha, escriba un nombre de destino entonces establecer reportero como ROX y extintor como ninguno.</li>
	<li>En la instalación de placa / asignar objetivos y muestras pestaña, asignar a cada pocillo de la placa de 96 pocillos para el nombre del destino en el paso anterior. En la misma ficha, establezca Seleccione el tinte a utilizar como referencia pasiva como ninguno.</li>
	<li>En la ficha Método Run , eliminar pasos hasta que haya un total de tres. Establecer el primer paso a 25,0 ° C, rampa tipo 100%, tiempo 00:05; el segundo paso a 95,0 ° C, rampa tasa 1%, tiempo de 1:00; el tercer paso a 95,0 ° C, rampa tipo 100%, tiempo 00:05. Elegir para recopilar datos utilizando el menú desplegable de Recoger datos o pulsando el icono de la Colección de datos (figura 6).</li>
	<li>Ajuste el volumen de reacción por pozo a 20 μl.</li>
	<li>Presione el botón de Inicio ejecutar para comenzar el experimento de la TSA.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Elegir una longitud de onda para trazar una curva de fusión con. Para los experimentos de nanoDSF, la relación de intensidades de fluorescencia en 330 nm y 350 nm (correspondiente al triptófano en entornos no polares y polar, respectivamente)13 es de uso general. Para la mayoría de TSA, la emisión de tinte máximo es adecuada para el trazado de la curva de fusión (la máxima emisión de SYPRO Orange es de 569 nm)12.</li>
	<li>Calcular los valores dem de T de cada condición mediante la determinación de los puntos de inflexión de cada curva de fusión. Mayoría de los sistemas nanoDSF calcula automáticamente valores dem T por la diferenciación numérica de las curvas de fusión después de la adquisición de datos. Si el software utilizado no calcula automáticamente los valores dem T, software libre, alternativa basada en GUI como NAMI11 puede automatizar análisis de datos y río abajo procesando, dando la opción de producir un mapa de calor resumiendo Tm valores para todo el experimento de 96 pocillos (la referencia que proporciona orientación y recursos para el procesamiento de datos con NAMI).</li>
	<li>Comparar los valores dem de T de todas las condiciones encuestados. Las pantallas de estabilidad contienen dos pozos en cada pantalla (A1 y A2) que contienen solamente agua. Tomando los valores de agua solamente como punto de referencia permite calcular valores dem ΔT, abordar errores sistemáticos y que permite la comparación fácil de estabilizar efectos. Valores más altos dem T indican condiciones térmicamente estabilizadoras que se recomiendan para uso río abajo. Condiciones prometedoras a menudo muestran una dependencia de la concentración en su estabilización.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Los aspectos más importantes dentro del protocolo incluyen el paso de centrifugación y correcto sellado de la placa de 96 pocillos para experimentos TSA (criterio 1.5). Centrifugación asegura de que la condición de la pantalla y muestra de proteínas entran en contacto y mezcla. Además, si se utiliza una placa sin sellar para un experimento TSA, existe un riesgo significativo de solventes de evaporación durante todo el experimento, causando un aumento en la concentración de la muestra y aumenta las posibilidades de agregación de la proteína.
TSAs y nanoDSF son susceptibles a una amplia gama de muestras de proteínas; la gran mayoría de muestras puede producir curvas de fusión interpretables con un tinte de reportero basado en hidrofobicidad o a través de nanoDSF libre de tinte. Si fuentes de fluorescencia estándar no son adecuadas para su proteína, la modificación más simple para el protocolo que podría explorarse es la elección del fluoróforo. Varios tintes alternativos podrían ser adecuados para los experimentos de la TSA. Los ejemplos incluyen N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), un compuesto que aparece después de reaccionar con un tiol27y 4 - julolidine (dicyanovinyl) (DCVJ), un compuesto que varía su fluorescencia basada en la rigidez de su entorno, aumentando su fluorescencia como una muestra de la proteína despliega28,29 (el tinte de este último a menudo requiere altas concentraciones de la muestra).
Métodos alternativos de análisis de la curva de fusión están disponibles si Tm no es calculado automáticamente por el software del instrumento. Si los datos son homogéneos y solo un paso de desnaturalización es evidente en las curvas de fusión, se puede montar un conjunto de datos truncado un colon sigmoide con la siguiente ecuación de Boltzmann:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg">
Donde F es la intensidad de fluorescencia a temperatura T, Fmin ymax F son las intensidades de fluorescencia antes y después de la transición de la desnaturalización, respectivamente, Tm la temperatura del punto medio de la transición de desnaturalización y C es la pendiente a Tm. Mientras que este método funciona bien para los procesos de desnaturalización de dos etapas simple, es inadecuado para las curvas de fusión compleja con múltiples transiciones.
Una de las principales ventajas de TSA es su accesibilidad; Experimentos TSA se pueden realizar en cualquier sistema de RT-PCR con filtros de longitudes de onda adecuadas para el colorante de fluorescencia empleado. Esto junto con el bajo costo de consumibles, facilidad de operación y la relativamente baja cantidad de proteína necesaria, hacer TSA una técnica valiosa para una amplia gama de escalas de proyecto, tanto en la industria y la academia.
Así como indicando las condiciones favorables de búfer, las pantallas contienen algunos pozos que pueden dar pistas a la presencia de metales estructurales dentro de una proteína de la muestra. Pozos que pueden ser de interés particular en la pantalla de sal son G6 y G7, que contienen EDTA 5 mM y 5 mM EGTA, respectivamente. Importante desestabilización térmica en estos pozos puede ser indicativo de importantes iones del metal en la proteína que son secuestrados por los chelants. Compuestos dentro de la pantalla del osmolyte también potencialmente pueden dar pistas a la función de una proteína. Muchos de los compuestos en la pantalla pertenecen a las clases de molécula que son sustratos comunes de enzimas. Por ejemplo, la estabilización general de sacáridos (presentes en pozos A11-B10) de lisozima se podía atribuir a su semejanza estructural a establecido los sustratos de la enzima N-acetilglucosamina oligómeros30.
Los protocolos TSA y nanoDSF mencionados también puede adaptarse para el estudio de las interacciones proteína-ligando. Ligandos que se unen específicamente a una proteína pueden aumentar su estabilidad térmica mediante la introducción de nuevas interacciones dentro del complejo. Un cambio positivo dependiente de la dosis de proteína Tm es un signo prometedor de una interacción exitosa proteína-ligando. La velocidad, rendimiento y bajo costo de detección compuestas bibliotecas con TSA ha hecho un método muy popular en el descubrimiento de la droga de la temprano-etapa.
Optimización de las condiciones de buffer de las proteínas Diana y sus complejos ligando puede ser esencial para el éxito de un proyecto, como lo demuestran los muchos ejemplos de literatura31,32,33,34. Con un típico ensayo tomando bajo 2 horas incluyendo tiempo de instalación, TSAs y nanoDSF juntada con las pantallas de estabilidad representan una técnica rápida, de bajo costo para optimizaciones de búfer.

Muchas enzimas útiles biotechnologically originan de fuentes virales, tales como el tabaco etch virus (TEV) proteasa1 y rinovirus humano tipo 3 C (HRV 3C) proteasa2. El proyecto (figura 1) Horizon2020 Virus-X3. El objetivo de este programa es (a) extender el rango de las propiedades de las familias de la enzima conocida y (b) caracterizar nuevas enzimas de función aún desconocida (enzima X). Determinación de la estructura cristalográfica desempeña un papel fundamental en la caracterización de la proteína objetivo, particularmente en aquellos casos en donde las secuencias de proteínas han evolucionado más allá de reconocimiento4. Estabilidad de la proteína es un factor clave en el proceso de cristalización; las muestras deben ser conformationally homogénea y estructuralmente durante un período de tiempo a forma de alta calidad, cristales de diffracting. Además, es esencial para los ensayos de actividad que las proteínas existen en su conformación activa, que también puede ser facilitado por un favorable entorno molecular.
A pesar del desarrollo en la tecnología disponible para cristalógrafos, cristalización de proteínas sigue siendo un proceso largo y requiere mano de obra empírica5. Experimentos preliminares biofísicos para mejorar la estabilidad de la proteína en solución dan claramente un punto de partida mejor para la cristalización de proteínas y generalmente consuman sólo una cantidad comparativamente pequeña de proteína muestra6,7, 8,9. La gran cantidad de proteínas de la blanco que se estudiarán en este proyecto también requiere un análisis de estabilidad, escalable, de alto rendimiento. Uno de los métodos más populares para la caracterización biofísica de la cristalización de las proteínas es el ensayo de cambio térmico (también conocido como TSA o diferencial de fluorimetría, DSF)10,11.
TSAs emplean un colorante fluorescente ambientalmente sensible a la desnaturalización térmica de las muestras de proteína. Muchos colorantes utilizados comúnmente tienen actividad de fluorescencia variable dependiendo de la polaridad de su entorno, a menudo mostrando una salida de alta fluorescencia en entornos hidrófobos pero sometidos a enfriamiento rápido en ambientes polares12. Proteínas generalmente causan aumentos pronunciados en la fluorescencia del tinte como sus corazones hidrofóbicos verse expuestos durante la desnaturalización, a menudo seguida por una disminución de la fluorescencia del tinte a muy altas temperaturas como las proteínas comienzan a agregados (figura 2).
Mientras que un tinte sensible a la hidrofobicidad es a menudo una buena opción para un tinte TSA de uso general, puede ser inadecuado para proteínas con regiones hidrofóbicas grandes, expuestos al solvente, que a menudo muestran fluorescencia del fondo perjudicialmente altos. Fluoróforos con modos alternativos de acción existen (ver discusión), pero en cambio puede ser deseable para seguir la desnaturalización a través de la fluorescencia intrínseca de proteínas con nanoDSF.
Residuos de triptófano que están enterrados en las regiones no polares de una proteína es fluorescente con un máximo de emisión de 330 nm. Como una muestra de la proteína se despliega y estos residuos se convierten en expuesto a un solvente polar, su máximo de emisión somete a un cambio bathochromic a 350 nm13. nanoDSF aprovecha este cambio de emisión máxima para el despliegue de una muestra de proteína sin necesidad de fluoróforos extrínsecos14.
Derretir las curvas que muestra pasos de desnaturalización solo pueden analizarse introduciendo datos a un modelo sigmoidal de Boltzmann. La temperatura en el punto de inflexión de la transición de despliegue (Tm) se utiliza como una medida cuantitativa de estabilidad térmica de la proteína y un punto de referencia para comparar la favorabilidad de diversas condiciones.
Curvas de fusión de la misma proteína en diferentes condiciones a veces poseen un grado de heterogeneidad que puede hacer inviable un ajuste sigmoidal de Boltzmann. Para discernir los valores dem de T de los datos que se desvía de la topología clásica curva, pueden utilizarse métodos numéricos tales como los empleados en NAMI, un programa open source TSA datos análisis11. Marcos termodinámicos alternativos también pueden utilizarse para analizar curvas más complejas con múltiples pasos de desnaturalización, como la metodología de ProteoPlex15.
Las pantallas de estabilidad fueron diseñadas para su uso en experimentos de TSA y nanoDSF para identificar rápidamente las condiciones favorables para una proteína diana (figura 3, composiciones de pantalla están disponibles en la información complementaria). Información recogida con las pantallas se puede utilizar en muchas etapas de la pipeline cristalográfico, incluyendo: muestra de almacenamiento; purificación, minimizando la pérdida de rendimiento a través de la proteína desplegar durante el proceso de purificación; ensayo diseño, reforzar la funcionalidad de la proteína en los ensayos de actividad con estabilización térmica almacenadores intermediarios y finalmente la cristalización, guía ensayos de cristalización racionalmente diseñado.
Elegir una base de sistema tampón adecuado para una muestra de la proteína es vital; valores de pH incompatibles pueden conducir a la desactivación o la desnaturalización de una proteína. Sin embargo, la presencia de moléculas de co cristalizado búfer resuelto en un gran número de estructuras cristalinas de la radiografía (tabla 1) también podría ser indicativa de un efecto estabilizador que está separado a la regulación de pH simple y en lugar de ello se deriva la química características de la molécula de búfer.
Formulado utilizando varios buffers17,18,19 junto a otros sistemas comúnmente biológicamente compatible con buffer de buenos, la pantalla de pH está diseñada para deconvolucionar el efecto químico de una molécula de tampón en estabilidad de la proteína desde el pH real de la solución resultante. Proporciona tres valores de pH para cada sistema buffer e incorporando redundancia del valor de pH entre los diferentes sistemas, la pantalla de pH puede identificar valores favorables de pH y sistemas buffer favorable para una proteína de la blanco.
La pantalla de sal contiene comúnmente sales de laboratorio así como chaotropes, chelants, metales pesados y agentes reductores. La pantalla puede dar una indicación general de la afinidad de una muestra de proteína a los entornos con alta fuerza iónica, pero cada subgrupo de los compuestos también puede proporcionar información sobre la posible estructura de una proteína. Por ejemplo, un fertilizantes quelatados significativamente desestabilizar una proteína podrían ser indicativo de metales estructurales importantes dentro de la muestra. Si la muestra es también fuertemente estabilizada por un catión metálico dentro de la pantalla, esto puede proporcionar un punto de partida prometedor para experimentos estructurales adicionales.
Osmolitos son compuestos solubles que afectan las propiedades osmóticas de su medio ambiente. En la naturaleza, pueden ser utilizados como "chaperonas químicas", aplicar el plegamiento de proteínas desordenadas y estabilización, especialmente en condiciones de estrés20,21,22. Estas características hacen atractivas aditivos en Cristalografía de la proteína; utilizable como crioprotectores durante la cosecha de cristal, montaje y almacenamiento procesos23. Uso potencial de osmolitos se extiende también a la purificación de proteínas. Una proporción significativa de las proteínas recombinantes expresadas en e. coli puede ser insoluble y difícil de recuperar en el estado nativo usando métodos de purificación estándar. Osmolitos pueden utilizarse para estabilizar y salvar fracciones insolubles de proteínas, purificación cada vez mayor rinde24.
La pantalla del osmolyte fue diseñada usando establecidos compuestos presentes en el Protein Data Bank entradas25 y la base de datos de Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated vías (DEOP)26 y había optimizado iterativamente usando proteínas estándar. La pantalla está construida alrededor de ocho subclases de osmolyte: glicerol, azúcares y polioles, detergente no sulfobetaines (NDSBs), betaínas y sus análogos, organofosforados, dipéptidos, aminoácidos y sus derivados y un último grupo misceláneo. Cada osmolyte está presente en concentraciones múltiples basadas en su solubilidad y rangos de concentración efectiva para comparación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:71px;">Melford Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L38100</td>
			<td style="width:435px;">Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham pH Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-101</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham Salt Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-102</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">The Durham Osmolyte Screen</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S6651</td>
			<td style="width:435px;">Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well PCR Plate</td>
			<td style="width:71px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">1403-7700</td>
			<td style="width:435px;">Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td style="width:71px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4362143</td>
			<td style="width:435px;">96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:216px;">Prometheus NT.48</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (&#916;G and &#916;&#916;G), and aggregation results (Tagg) using built-in software.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PR-C002</td>
			<td style="width:435px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. &#34;High sensitivity&#34; variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (&#60;200 &#181;g ml-1).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project

El proyecto Horizon2020 Virus-X se estableció en 2015 a la virosphere de biotopos extremos seleccionados de explorar y descubrir nuevas proteínas virales. Para evaluar el valor potencial biotecnológico de estas proteínas, el análisis de la proteína las estructuras y funciones es un desafío central en este programa. La estabilidad de la muestra de proteína es esencial para proporcionar resultados significativos y aumentar el crystallizability de los objetivos. El ensayo de cambio térmico (TSA), una técnica basada en la fluorescencia, se establece como un método popular para la optimización de las condiciones para la estabilidad de la proteína de alto rendimiento. En TSA, los fluoróforos empleadas son tintes extrínsecos, ambientalmente sensible. Una alternativa técnica similar es nano diferencial fluorimetría (nanoDSF), que se basa en la fluorescencia nativa de la proteína. Presentamos aquí una novela osmolyte pantalla, una pantalla de 96-condición de aditivos orgánicos diseñados para ensayos de cristalización a través de experimentos preliminares de TSA. Junto con pantallas sal y pH desarrollado previamente, el conjunto de tres pantallas ofrece un exhaustivo análisis de estabilidad de la proteína en una amplia gama de aditivos y sistemas de amortiguación. La utilidad de las pantallas se demuestra en el análisis TSA y nanoDSF de la lisozima y la proteína X, una proteína de la blanco del proyecto Virus X.

Lisozima fue probada con las pantallas de la estabilidad y la proteína X, una proteína diana en el proyecto de Virus X, fue probada con la pantalla osmolyte. Ambas proteínas producidas generalmente derriten las curvas con transiciones de desnaturalización definida claramente en experimentos TSA y nanoDSF (ver acompañando a figuras de curvas representativas). En algunos casos donde las muestras que no producen curvas interpretable con una transición de desnaturalización definida fueron interpretadas como desnaturalizadas y no esta incluidas en las comparaciones dem de T.
La figura 7 muestra resultados de la muestra en la pantalla sal, ejemplificar las propiedades de estabilización térmica de cloruro de amonio a la lisozima. Dependencias de concentración como el que se muestra arriba a menudo son indicativas de condiciones prometedoras, pero puede ser útil para comparar los resultados de aumento de la concentración de iones con varias diferentes sales para ver si estabilización térmica generalmente surge de un aumento de la fuerza iónica del buffer o si la presencia de iones específicos confiere estabilidad adicional.
Comparación de los valores dem de T de la lisozima con la pantalla de pH (figura 8) revela dos pedazos de información. En primer lugar, hay una tendencia general de aumento de estabilidad con la disminución de los valores de pH. En segundo lugar, los valores dem rango de T obtenidos mediante sistemas tampón diferentes con valores de pH idénticas pueden ser significativos.
Datos en la figura 8 indican que el acuerdo entre TSA y nanoDSF en este experimento es generalmente bueno, pero nanoDSF muestra una tendencia a identificar valores ligeramente mayores dem T y un poco más grande Tm cambios de TSA. Sin embargo, algunos pozos con valores de pH superiores a 8.5 muestran grandes discrepancias entre los valores dem T obtenidos de TSA y nanoDSF. Diferencias potencialmente podrían atribuirse al mecanismo de la desnaturalización de la proteína a valores de pH diferentes; por ejemplo, un colorante sensible a la hidrofobicidad podría dar un comparativamente bajo Tm si hidrofóbicas regiones de una proteína verse expuestas al solvente significativamente más rápido que el ambiente de cambios de residuos de triptófano en la polaridad de la lectura.
La figura 9 muestra un mapa de calor de Tm valores obtenidos con lisozima utilizando la pantalla osmolyte. Condiciones con el más alto Tm aumenta en comparación con los pocillos de control (pozos A1 y A2, que contiene agua desionizada) son de color azul oscuro. Condiciones especialmente estabilización identificadas en la figura 9 incluyen glicerol, D-sorbitol 1 M, hipotaurina 100 mM y 10 mM Ala-Gly (pozos A4-A6, A9, E7 y F8, respectivamente).
La figura 10 muestra un heatmap de Tm valores obtenidos con la proteína X. TSA y experimentos de nanoDSF con la pantalla Osmolyte revelan que la mayoría de los osmolitos probado o un aumento menor en Tm (dentro de 1 ° C) o tener un efecto perjudicial en la estabilidad de la proteína x. En particular, el ácido dipicolinic en una concentración de 10 mM (bien D1) parece desnaturalizar la muestra a temperatura ambiente. Los resultados de TSA y nanoDSF identifican rápidamente ácido dipicolinic como aditivo incompatible para X de proteína que debe ser evitada cuando se trabaja con la proteína. Sin embargo, altas concentraciones de D-sorbitol y arabinosa (pozos A9 y B9, ambos a 1 M) así como glicerol y OTMA (pozos A4-A6 y E1, respectivamente) fueron identificados como estabilizar térmicamente.
Para lisozima, combinaciones de condiciones de rendimiento los valores más altos dem T de cada pantalla de estabilidad fueron probados para la punta de prueba de un efecto combinado sinérgico. La figura 11 muestra un aumento general en los valores dem T como más componentes del sistema tampón (pH, sal y osmolyte) se agregan. En el caso del MES, sulfato de amonio y el d-sorbitol, un Tm aumentar tan grande como 10 ° C puede observarse cuando todos los componentes están presentes en comparación con el MES solo. La figura 11 muestra que un notable efecto sinérgico puede ocurrir cuando los componentes individuales de un tampón se optimizado y combinados con las pantallas de estabilidad.
De manera más general, figura 11 también muestra la magnitud de los valores dem ΔT que puede ser observado en TSA y nanoDSF experimentos. La magnitud de ΔTm alcanzable varía significativamente basado en el sistema de la proteína, pero cualquier valor dem ΔT alrededor y por encima de 5 ° C a menudo es indicativo de un beneficioso efecto estabilizador.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig1.jpg"> Figura 1 : Bioprospección. Recogida de muestras de un ambiente extremo en el proyecto de Virus X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig2.jpg"> Figura 2: esquema TSA. Ejemplo anotado de una curva de fusión típicos obtenida de un experimento TSA. Esta curva es característica de la proteína de "dos Estados" clásico despliegue, donde la población muestra las transiciones de dobla a desnaturalizado sin intermediarios detectables parcialmente plegada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig3.jpg"> Figura 3 : Estabilidad de pantallas de flujo de trabajo. Flujo de trabajo estándar de optimización de búfer mediante las pantallas de estabilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig4.jpg"> Figura 4 : Flujo de trabajo de una norma TSA experimentar con las pantallas estabilidad. De izquierda a derecha: (A) pipeteo de alícuotas de las pantallas de estabilidad en una placa de 96 pocillos. B pipetear la muestra de proteína con colorante fluorescente en la placa. (C) sellado de la placa antes de la centrifugación. (D) colocación de la placa en un sistema de RT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig5.jpg"> Figura 5: flujo de trabajo de un experimento estándar de nanoDSF. (A) apertura del tubo capilar carga del rack. (B) carga de los capilares en la parrilla. (C) inmovilizando los capilares con la tira del lacre magnético. (D) un experimento de programación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig6.jpg"> Figura 6 : Interfaz de usuario para el sistema de RT-PCR. Un experimento de la TSA ha sido programado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig7.jpg"> Figura 7 : Pantalla de datos de muestra de la sal. (A) relación de las intensidades de fluorescencia a 350 nm vs 330 nm para un experimento de la etiqueta-libre nanoDSF con lisozima. Las muestras corresponden a los pozos C7-C12 de la pantalla sal (1,5 M - cloruro de amonio 0,2 M). Valores dem T calculados para cada condición se superponen a la trama. (B) Resumen de los valores dem T calculada a partir de los datos presentados en la figura 7A. Intensidades de fluorescencia (C) a 590 nm para un experimento TSA con un tinte sensible a la hidrofobicidad reportero de lisozima. Como figura 7A, las muestras corresponden a los pozos C7-C12 de la pantalla de la sal. Valores calculados dem T se superponen en el gráfico. (D) Resumen de los valores dem T calculada a partir de datos presentes en la figura 7C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig8.jpg"> Figura 8: datos de muestra de pantalla de pH. Resumen de Tm cambios obtenidos con la lisozima y la pantalla de pH. Cada punto representa una condición independiente; puntos en el mismo valor de pH son de sistemas de amortiguamiento diferentes en el mismo pH. Tm cambios se calculan en relación a un control Tm de 68,0 ° C para los experimentos TSA y 71,9 ° C para los experimentos de nanoDSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig9.jpg"> Figura 9 : Datos de muestra de pantalla Osmolyte (lisozima). Resumen de Tm valores obtenidos de un experimento de la etiqueta-libre nanoDSF con lisozima y cada bien de la pantalla del osmolyte. Se comparan valores dem T (en ° C) en los pocillos A1 y A2 que contienen agua como control. Un heatmap se genera en base a ΔTm valores comparados (azul denota un aumento dem T y rojo una disminución dem del T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig10.jpg"> Figura 10: datos de muestra de pantalla Osmolyte (proteína X). (A) Resumen de Tm valores obtenidos de un experimento de la etiqueta-libre nanoDSF con proteína X y la pantalla osmolyte. Tm valores se comparan a los pozos A1 y A2 que contienen agua como control. Un heatmap se genera en base a ΔTm valores comparados (azul denota un aumento dem T y rojo una disminución dem del T). (B) nanoDSF curvas obtienen bien A9 (1 M D-sorbitol, una condición de estabilización) y D1 (10 mM dipicolinic ácido, una condición desestabilizadora). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig11.jpg"> Figura 11 : Buffer efecto optimización en Tm. Valores de lisozima junto con las condiciones de cada pantalla que el mayor incremento en Tmen TSA Tm . 100 mM ácido acético, pH 4,2 y 100 mM MES, pH 5.6, fueron elegidos como los sistemas de amortiguación, junto con sulfato de amonio de 1,5 M como la sal. Las concentraciones del Osmolyte eran idénticas a las encontradas en la pantalla del osmolyte: Ala-Gly, D-sorbitol 1 M, 50 mM de L-lisina e hipotaurina 100 mM de 10 mM. Barras de error representan el desvío estándar de seis repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Molécula de</td>
			<td>Código PDB</td>
			<td>Frecuencia de cristalización Co</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato de</td>
			<td>PO4</td>
			<td>5132</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetato de</td>
			<td>actuar</td>
			<td>4521</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido de 2-(N-Morpholino)-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido (MES)</td>
			<td>MES</td>
			<td>1334</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris (hidroximetil) aminometano (tris)</td>
			<td>TRS</td>
			<td>1155</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formiato de</td>
			<td>FMT</td>
			<td>1072</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de la frecuencia de la cristalización de molécula de buffer en las entradas del Banco de datos de la proteína (PDB). Datos obtenidos a través de PDBsum16 de un total de 144.868 entradas (correctos a partir del 05/12/18).
Información complementaria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Information.docx" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo</a>. 
Complementario tabla 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo</a>. 
Adicional cuadro 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_2.xlsx" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo</a>. 
Adicional cuadro 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_3.xlsx" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo</a>.

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How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Cómo estabilizar proteínas: pantallas estabilidad térmica cambio ensayos y diferencial de Nano fluorimetría en el proyecto de Virus X

Un protocolo se presenta para probar rápidamente la estabilidad térmica de las proteínas en una variedad de condiciones a través de ensayos de cambio térmico y diferencial fluorimetría de nano. Los sistemas tampón, sales y aditivos, juntos con tres pantallas de estabilidad única, se analizan con proteínas para identificar los tampones adecuados para estudios funcionales y estructurales.

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Este método puede responder preguntas en química de proteínas y descubrimiento de fármacos como qué condiciones estabilizan una proteína? ¿Qué mutaciones afectan la termoestabilidad de una enzima? ¿Y qué ligandos se unen a un objetivo proteico?Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, se realiza fácilmente en un laboratorio estándar y se adapta perfectamente a aplicaciones de rendimiento medio a alto. Para preparar la muestra de proteína transferir 10 microlitros de cada condición de una pantalla de estabilidad en el pozo correspondiente de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal para ahorrar tiempo. A continuación, prepare un mililitro de aproximadamente un miligramo por mililitro de solución de proteína en un sistema tampón adecuado.Si realiza un ensayo de cambio térmico, añada el tinte de naranja SYPRO a la muestra de proteína a una concentración final de 20X. Mezclar por inversión o por un breve vórtice. Ahora transfiera 10 microlitros de la solución proteica a cada pozo de la placa de 96 pozos.Selle y centrifuga la placa de 96 pozos durante dos minutos a 600 veces G para garantizar que la muestra de proteína y el componente de la pantalla se mezclen. Vuelva a sellar la pantalla de estabilidad y almacene la pantalla a cuatro grados centígrados durante un máximo de cuatro meses. Para realizar el experimento TSA, abra el cajón de muestra presionando firmemente la sangría en el lado derecho del cajón.Coloque la bandeja de 96 pozos en el sistema RTPCR con bien A-uno en la parte posterior izquierda. Haga clic en el nuevo botón de experimento para comenzar a configurar un experimento de TSA. En la pestaña Propiedades del experimento, haga clic en la opción Curva de fusión cuando se le pregunte, ¿qué tipo de experimento desea configurar?A continuación, haga clic en la otra opción cuando se le pregunte, ¿qué reactivos desea utilizar para detectar la secuencia de destino? En la ficha Configuración de placa, Definir destinos y muestras, escriba un Nombre de destino y, a continuación, establezca Reportero como ROX. Y Quencher como Ninguno.En la ficha Configuración de placa, Asignar objetivos y muestras, defina la opción Seleccionar el tinte que se utilizará como referencia pasiva como Ninguno. En la misma pestaña, asigne cada pozo de la placa de 96 pozos al nombre de destino introducido en el paso anterior. En la pestaña Método de ejecución, elimine los pasos hasta que haya un total de tres.Establezca el primer paso en 25 grados centígrados, con una velocidad de rampa del 100% y un tiempo de cinco segundos. Establezca el segundo paso en 95 grados centígrados, con una velocidad de rampa del 1% y un tiempo de un minuto. Finalmente, establece el tercer paso en el 95 grados Celsius con una velocidad de rampa del 100% y un tiempo de cinco segundos.Elija Recopilar datos mediante el menú desplegable Recopilar datos o haciendo clic en el icono de recopilación de datos. Ajuste el volumen de reacción por pozo a 20 microlitros. Haga clic en el botón Iniciar ejecución para iniciar el experimento de TSA.NanoDSF se puede utilizar para sondear la estabilidad térmica de proteínas sin el uso de tintes extrínsecos. Las muestras se pueden preparar en 96 placas de pozo como se describió anteriormente en el protocolo, pero sin añadir ningún tinte naranja SYPRO. Abra el cajón de muestras pulsando el botón Abrir cajón.Asegúrese de que el equipo esté limpio, prestando especial atención a cualquier polvo cerca del estante de muestras. Si el sistema tiene un espejo dispersante de espalda, límpielo con etanol y un tejido libre de pelusas. Cargue los capilares con aproximadamente 10 microlitros de cada pozo de la placa de 96 pozos tocando un extremo del capilar en la solución.Y luego coloque el capilar en los soportes capilares correspondientes del estante de muestra. Tenga cuidado de no contaminar el centro de los capilares con huellas dactilares, ya que esto podría interferir con las lecturas de fluorescencia a lo largo del experimento. Inmovilizar los capilares con una tira de sellado magnética.Inicie un escaneo preliminar para detectar la posición y la intensidad de cada capilar pulsando el botón Iniciar análisis de descubrimiento en la pestaña Análisis de detección. Aumente o disminuya la fuerza de excitación incidente desde una potencia inicial del 10% hasta que el pico de cada exploración capilar esté entre 4.000 y 12.000 unidades. En la pestaña Escaneo de fusión, programe un Análisis de fusión estableciendo la opción Pendiente de temperatura en 7,0 grados por minuto.Temperatura de inicio a 25 grados centígrados. Y la temperatura final a 95 grados centígrados. A continuación, inicie el experimento nanoDSF pulsando el botón Iniciar fusión.Repita estos pasos para preparar los ejemplos para un experimento completo. Una vez configurado el experimento completo, vaya a la pestaña Escaneo de fusión y programe un Análisis de fusión estableciendo la opción Pendiente de temperatura en 1,0 grados centígrados por minuto. Temperatura de inicio a 25 grados centígrados.Y la temperatura final a 95 grados centígrados. Por último, inicie el experimento nanoDSF pulsando el botón Iniciar fusión. T m se utiliza como una medida cuantitativa de la estabilidad térmica de proteínas en un punto de referencia para comparar la favorabilidad de diferentes condiciones.Aquí se muestran los resultados de la muestra de la pantalla de sal, ejemplificando las propiedades de estabilización térmica del cloruro de amonio hacia la lysozyme. La comparación de los valores T m de la lysozyme con la pantalla de pH revela que el acuerdo entre TSA y nanoDSF es generalmente bueno, pero nanoDSF muestra una tendencia a identificar valores de T m ligeramente más altos en cambios T m ligeramente más grandes que TSA. Existe una tendencia general de aumento de la estabilidad con la disminución de los valores de pH.El rango de valores T m obtenidos utilizando diferentes sistemas de búfer con valores de pH idénticos puede ser significativo. Para combinaciones de lysozyme de condiciones que producen los valores TSA T m más altos de cada pantalla de estabilidad se probaron para sondear un efecto combinado sinérgico. Hay un aumento general en los valores de T m a medida que se agregan más componentes del sistema de búfer.Un efecto sinérgico notable puede ocurrir cuando los componentes individuales de un búfer se optimizan y se combinan con las pantallas de estabilidad. Siguiendo esta técnica se pueden utilizar otros métodos como la cristalización para determinar la estructura tridimensional de una proteína y desentrañar la base molecular para la unión de ligandos. Además, proporcionamos información sobre la estabilidad de las proteínas como parte del proyecto Virus-X, esta técnica es aplicable a una amplia gama de sistemas de descubrimiento y desarrollo de fármacos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

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