Name: how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

Detta projekt har fått finansiering från de Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation (grant avtalet n ° 685778). Detta arbete stöddes av bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC, grant antalet BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB tack den BBSRC forskarnivå utbildning partnerskap Newcastle-Liverpool-Durham för en STUDENTTILLVARO och Durham University Institutionen för biovetenskaper bidra mot den finansiering som detta arbete. Vi tackar Ian Edwards för hans hjälp och Durham University Institutionen för kemi Mass Spectrometry avdelningen för deras instrumentell analys av Protein X. Vi är tacksamma mot Arnthor Ævarsson för sitt arbete med Virus-X projekt och tack även till Claire Hatty och NanoTemper GmbH för utlåning och bistå med Prometheus NT.48 systemet för detta projekt. Slutligen, tack till Frances Gawthrop och Tozer Seeds för deras stöd som en del av BBSRC iCASE award.

1. beredning av Protein prov
<ol><li>Formulera stabilitet skärmarna som 500 µL portioner i 96 brunnar block och tätning för lagring. Över 10 µL av varje villkorar av en stabilitet skärm till motsvarande väl av en plattan med 96 brunnar med flerkanalig pipett för att spara tid (figur 4A).</li>
	<li>Laga 1 mL av en cirka 1 mg mL-1 protein lösning i en lämplig buffertsystem. Även sammansättningen av en lämplig buffert varierar med varje protein prov, är en bra första buffert att prova natriumfosfat 10 mM med 100 mM NaCl, pH 7,2. Obs: Acceptabelt protein koncentrationer varierar av fall, men koncentrationsintervall 0.5 - 5 mg mL-1 framställs vanligen analyserbart kurvor. Utspädd buffertar rekommenderas för användning med skärmarna stabilitet att undvika maskera effekterna av varje tillstånd. Typiska buffert kompositioner är ungefär 10 mM buffert med runt 100 mM NaCl.</li>
	<li>Om utför ett TSA experiment, lägga till protein provet till en slutlig koncentration på 20 x SYPRO Orange färg. Blanda antingen genom inversion eller kort vortexa.</li>
	<li>Över 10 µL av den protein-lösningen till varje brunn den plattan med 96 brunnar beredd i steg 1,1 (figur 4B).</li>
	<li>Försegla och centrifugera plattan med 96 brunnar i 2 min på 600 x g för komponenten protein prov och skärmen är blandade (figur 4C).</li>
	<li>Åter försegla stabilitet skärmen djupt väl block och lagra på skärmen vid 4 ° C i upp till 4 månader. Förvara salt skärmen i mörker, eftersom vissa komponenter är ljuskänsliga.</li>
	<li>Om ett nanoDSF experiment, Fortsätt till steg 2. Om utför ett TSA experiment, hoppa till steg 4.</li>
</ol>2. förbereda en nanoDSF Experiment
<ol><li>Se till att utrustningen är ren, särskilt uppmärksamma damm nära prov racket. Om systemet har en backscattering spegel, ren den med etanol och en luddfri vävnad.</li>
	<li>Öppna lådan provet genom att trycka på knappen Öppna kassalådan . (Figur 5A).</li>
	<li>Ladda kapillärerna med ca 10 µL från varje brunn plattan med 96 brunnar av röra ena änden av kapillären i lösningen, och sedan placera dem i motsvarande kapillär innehavare av provet racket (figur 5B). Var noga med att inte förorena mitten av kapillärerna med fingeravtryck, osv., eftersom detta kunde störa fluorescens mätningar i hela experimentet.</li>
	<li>Immobilisera kapillärerna med den magnetiska försegla remsan (bild 5C).</li>
</ol>3. programmera en nanoDSF Experiment
<ol><li>Starta en preliminär genomsökning för att identifiera positionen och intensiteten i varje kapillär genom att trycka på knappen Börja skanna Discovery Discovery Skanna fliken ökning eller minskning incident excitation styrkan från en inledande kraften i 10% fram till den toppen av varje kapillär scan är mellan 4 000-12 000 enheter (figur 5D).</li>
	<li>För att säkerställa urvalet är vikta och tillräckligt koncentrerad, rekommenderas en initial smälta scan med en brant temperaturgradient. I den Smältande Skanna fliken program en smälta skanna genom att ange alternativet Temperatur lutning till 7,0 ° C min-1 Starta temperatur till 25 ° C och Slutet temperatur till 95 ° C, sedan starta nanoDSF experimentera genom att trycka på Starta smältning knappen. Om den resulterande smälta kurvor visar inte en detekterbar brytpunkt, överväga att koncentrera provet vidare eller kontrollera om proteinet viks ordentligt.</li>
	<li>Upprepa steg 2.1-2.4 att bereda proverna för en full experiment.</li>
	<li>I den Smältande Skanna fliken program en smälta skanna genom att ange alternativet Temperatur lutning till 1,0 ° C min-1 Starta temperatur till 25 ° C och Slutet temperatur till 95 ° C, sedan starta nanoDSF experimentera genom att trycka på knappen Börja smälta .</li>
</ol>4. utför ett TSA-Experiment
<ol><li>Öppna lådan urvalet genom att ordentligt trycka indraget på höger sida av lådan. Placera 96 brunnar facket i RT-PCR systemet med väl A1 till baksidan-vänster (figur 4D).</li>
	<li>Klicka på knappen Ny experimentera att börja ställa upp ett TSA-experiment.</li>
	<li>I fliken Experimentera egenskaper klickar du på alternativet Smälta kurva när frågade vilken typ av experiment vill du ställa in? och det andra alternativet när frågade vilka reagenser vill du använda för att identifiera målet sekvensen?
</li>
	<li>I den plattan Setup / definiera mål och prover fliken, ange ett målnamn sedan ange Reporter som ROX och törstsläckare som ingen.</li>
	<li>I den plattan Setup / tilldela mål och prover flik, tilldela varje väl av plattan med 96 brunnar till målnamnet anges i föregående steg. Ange Välj färgen att använda som passiva referensen som ingeni samma flik.</li>
	<li>Kör metoden på fliken Radera steg tills det finns sammanlagt tre. Ange det första steget till 25,0 ° C, ramp kurs 100%, tid 00:05; det andra steget till 95,0 ° C, ramp kurs 1%, tid 01:00; det tredje steget till 95,0 ° C, ramp kurs 100%, tid 00:05. Välja att samla in data med hjälp av menyn Samla in Data eller genom att trycka på ikonen Datainsamling (figur 6).</li>
	<li>Inställt 20 µL reaktionsvolym Per brunn .</li>
	<li>Tryck på knappen Start Kör att påbörja TSA experimentet.</li>
</ol>5. dataanalys
<ol><li>Välja en våglängd att rita en smälta kurva med. För nanoDSF experiment, förhållandet mellan fluorescens intensiteter på 330 nm och 350 nm (motsvarande respektive tryptofan i nonpolar och polara miljöer)13 används ofta. För de flesta TSA, färgämne utsläpp maximal är lämplig för smälta kurva plottning (utsläpp högst SYPRO Orange är 569 nm)12.</li>
	<li>Beräkna Tm värden för varje villkor genom att bestämma de Böjningar (er) av varje smälta kurva. De flesta nanoDSF system beräkna automatiskt Tm värden genom numerisk differentiering av smälta kurvor efter datainsamling. Om den programvara som används automatiskt inte beräknas Tm , kan gratis, alternativa GUI-driven programvara såsom NAMI11 automatisera dataanalys och nedströms bearbetning, vilket ger möjlighet att producera en heatmap sammanfattande Tm värden för hela 96 brunnar experiment (medföljande referens ger vägledning och resurser för databehandling med NAMI).</li>
	<li>Jämför Tm värden av alla tillfrågade. Stabilitet skärmarna innehåller två brunnar i varje skärm (A1 och A2) som innehåller endast vatten. Tar endast vatten-värdena som riktmärke gör beräkningen av ΔTm värden, adressering systematiska fel och möjliggör enkel jämförelse av stabiliserande effekter. Högre Tm värden indikerar termiskt stabiliserande förhållanden som rekommenderas för nedströmsanvändningen. Lovande villkor visar ofta en koncentration beroende i deras stabilisering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+intracellular+processing+of+fusion+proteins+by+TEV+protease.">Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease.</a> Protein Expression and Purification. 19 (2), 312-318 (2000).</li><li>Cordingley, M. G., Register, R. B., Callahan, P. L., Garsky, V. M., Colonno, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+small+peptides+in+vitro+by+human+rhinovirus+14+3C+protease+expressed+in+Escherichia+coli.">Cleavage of small peptides in vitro by human rhinovirus 14 3C protease expressed in Escherichia coli.</a> Journal of Virology. 63 (12), 5037-5045 (1989).</li><li>Hjorleifsdottir, S., Aevarsson, A., Hreggvidsson, G. O., Fridjonsson, O. H., Kristjansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+genome+of+the+Rhodothermus+RM378+thermophilic+bacteriophage.">Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage.</a> Extremophiles. 18 (2), 261-270 (2014).</li><li>Alva, V., Nam, S. Z., S&#246;ding, J., Lupas, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MPI+bioinformatics+Toolkit+as+an+integrative+platform+for+advanced+protein+sequence+and+structure+analysis.">The MPI bioinformatics Toolkit as an integrative platform for advanced protein sequence and structure analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, 410-415 (2016).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> Methods in molecular biology. 1607, 17-50 (2017).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IUCr+Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+Thermofluor.">IUCr Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 69 (2), 209-214 (2013).</li><li>Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+purification+and+characterization+using+Thermofluor+screens.">Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens.</a> Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).</li><li>Kozak, S., Lercher, L., Karanth, M. N., Meijers, R., Carlomagno, T., Boivin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays.">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular NMR. 64 (4), 281-289 (2016).</li><li>Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Razgulyaev, O. I., Uversky, V. N., Gripas', A. F., Gilmanshin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+"molten+globule"+intermediate+state+in+protein+folding+by+a+hydrophobic+fluorescent+probe.">Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe.</a> Biopolymers. 31 (1), 119-128 (1991).</li><li>Gr&#248;ftehauge, M. K., Hajizadeh, N. R., Swann, M. J., Pohl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-ligand+interactions+investigated+by+thermal+shift+assays+(TSA)+and+dual+polarization+interferometry+(DPI).">Protein-ligand interactions investigated by thermal shift assays (TSA) and dual polarization interferometry (DPI).</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 71, 36-44 (2015).</li><li>Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYPRO+Orange+and+SYPRO+Red+Protein+Gel+Stains:+One-Step+Fluorescent+Staining+of+Denaturing+Gels+for+Detection+of+Nanogram+Levels+of+Protein.">SYPRO Orange and SYPRO Red Protein Gel Stains: One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detection of Nanogram Levels of Protein.</a> Analytical biochemistry. 239, 223-237 (1996).</li><li>Burstein, E. A., Vedenkina, N. S., Ivkova, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+the+location+of+tryptophan+residues+in+protein+molecules.">Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules.</a> Photochemistry and Photobiology. 18 (4), 263-279 (1973).</li><li>Haffke, M., Rummel, G., Boivineau, J., M&#252;nch, A., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoDSF:+label-free+thermal+unfolding+assay+of+G-protein-coupled+receptors+for+compound+screening+and+buffer+composition+optimization.">nanoDSF: label-free thermal unfolding assay of G-protein-coupled receptors for compound screening and buffer composition optimization.</a> Application Note NT-PR-008. , (2016).</li><li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoPlex:+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparsematrix+screening+of+chemical+space.">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparsematrix screening of chemical space.</a> Nature Methods. 12 (9), 859-865 (2015).</li><li>Laskowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDBsum:+summaries+and+analyses+of+PDB+structures.">PDBsum: summaries and analyses of PDB structures.</a> Nucleic Acids Research. 29 (1), 221-222 (2001).</li><li>Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S., Singh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li><li>Good, N. E., Izawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers.">Hydrogen ion buffers.</a> Methods in enzymology. 24, 53-68 (1972).</li><li>Ferguson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Analytical biochemistry. 104 (2), 300-310 (1980).</li><li>Welch, W. J., Brown, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+and+chemical+chaperones+on+protein+folding.">Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding.</a> Cell stress &amp; chaperones. 1 (2), 109-115 (1996).</li><li>Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+chaperones+regulate+molecular+chaperones+in+vitro+and+in+cells+under+combined+salt+and+heat+stresses.">Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses.</a> The Journal of biological chemistry. 276 (43), 39586-39591 (2001).</li><li>Yancey, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+osmolytes+as+compatible,+metabolic+and+counteracting+cytoprotectants+in+high+osmolarity+and+other+stresses.">Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (15), 2819-2830 (2005).</li><li>Garman, E. F., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocooling+and+radiation+damage+in+macromolecular+crystallography.">Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 32-47 (2006).</li><li>de Marco, A., Vigh, L., Diamant, S., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+folding+of+aggregation-prone+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+osmolytes,+plasmid-+or+benzyl+alcohol-+overexpressed+molecular+chaperones.">Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol- overexpressed molecular chaperones.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 329 (2005).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+data+bank.">The protein data bank.</a> Nucleic acids research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Bougouffa, S., Radovanovic, A., Essack, M., Bajic, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEOP:+A+database+on+osmoprotectants+and+associated+pathways.">DEOP: A database on osmoprotectants and associated pathways.</a> Database. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Fluorescent+Thermal+Stability+Assay+for+Membrane+Proteins.">Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Kung, C. E., Reed, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+molecular+rotors:+a+new+class+of+probes+for+tubulin+structure+and+assembly.">Fluorescent molecular rotors: a new class of probes for tubulin structure and assembly.</a> Biochemistry. 28 (16), 6678 (1989).</li><li>Iio, T., Itakura, M., Takahashi, S., Sawada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9-(Dicyanovinyl)julolidine+binding+to+bovine+brain+calmodulin.">9-(Dicyanovinyl)julolidine binding to bovine brain calmodulin.</a> Journal of biochemistry. 109 (4), 499-502 (1991).</li><li>Veros, C. T., Oldham, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lysozyme-ligand+binding+in+the+solution+and+gas+phases+by+electrospray+ionisation+mass+spectrometry.">Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (21), 3505-3510 (2007).</li><li>Kean, J., Cleverley, R. M., O'Ryan, L., Ford, R. C., Prince, S. M., Derrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+CorA+Mg2++transport+channel+from+Methanococcus+jannaschii+using+a+Thermofluor-based+stability+assay.">Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay.</a> Molecular membrane biology. 25 (8), 653-661 (2008).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallographica Section F. 68 (5), 596-600 (2012).</li><li>Morgan, H. P., Zhong, W., McNae, I. W., Michels, P. A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+pyruvate+kinases+display+evolutionarily+divergent+allosteric+strategies.">Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies.</a> Royal Society open science. 1 (140120), (2014).</li><li>Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aldehyde+dehydrogenase+1A3+complexed+with+NAD++and+retinoic+acid.">Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid.</a> Scientific reports. 6 (35710), (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Kritiska aspekter inom protokollet omfatta centrifugeringssteget och ordentlig tätning av plattan med 96 brunnar för TSA experiment (steg 1,5). Centrifugering säkerställer att villkoret protein prov och skärmen kommer i kontakt och blanda. Dessutom, om en oförseglade plattan används för ett TSA experiment, finns det en betydande risk för lösningsmedel avdunstar hela experimentet, orsakar en ökning i provets koncentration och ökar risken för prematur protein aggregering.
TSA och nanoDSF kan bli föremål för ett brett utbud av protein prover; den stora majoriteten av prover kan producera tolkningsbara smälta kurvor med en vattenavvisande egenskaper-baserade reporter färgämne eller genom dye-fri nanoDSF. Om standard fluorescens källor inte är lämplig för ditt protein, är enklaste ändring till det protokoll som kunde utforskas valet av fluorophore. Flera alternativa färgämnen kan vara lämplig för TSA experiment. Exempel är N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), en förening som fluorescerar i efter reagerar med en tiol274-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), en förening som varierar dess fluorescens baserat på den stelhet i dess miljö, öka dess fluorescens som protein prov utspelar sig28,29 (senare färgen ofta kräver höga koncentrationer av provet).
Alternativa analysmetoder smälta kurvan är tillgängliga om Tm inte beräknas automatiskt av programvaran instrument. Om data är homogen och endast en denaturering steg framgår i smälta kurvorna, kan en stympad datamängd monteras på en Boltzmann sigmoideum med följande ekvation:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg">
Där F är fluorescensintensiteten vid temperaturen T, Fmin och Fmax är fluorescens stödnivåerna före och efter denaturering övergången, respektive, Tm är mittpunkten temperaturen i denaturering övergång och C är lutningen på Tm. Även denna metod fungerar bra för enkla two-step denaturering processer, är det olämpligt för komplexa smälta kurvor med flera övergångar.
En av de stora fördelarna med TSA är dess tillgänglighet. TSA experiment kan utföras i alla RT-PCR-system med filter lämpliga våglängder för fluorescens färgämnet anställd. Detta i kombination med den låga kostnaden för förbrukningsvaror, enkel drift och relativt låg mängd protein som behövs, göra TSA en värdefull teknik för en lång rad projekt skalor, både inom industrin och akademin.
Förutom som visar gynnsamma buffert villkor, innehåller skärmarna några brunnar som kan ge ledtrådar till förekomsten av strukturella metaller inom ett prov protein. Brunnar som kan vara av särskilt intresse i salt skärmen är G6 och G7, som innehåller 5 mM EDTA och 5 mM EGTA, respektive. Betydande termisk destabilisering i dessa brunnar kan vara vägledande för viktiga metalljoner i proteinet som är binds av chelants. Föreningar inom osmolyte skärmen kan också potentiellt ge ledtrådar till funktionen av ett protein. Många av föreningarna i skärmen tillhör klasser av molekylen som är gemensamma substrat för enzymerna. Till exempel kunde allmänna stabiliseringen av sackarider (närvarande i brunnar A11-B10) för lysozym hänföras till deras strukturella likheten till etablerade substrat av enzymet, N-acetylglukosamin oligomerer30.
Protokollen TSA och nanoDSF som beskrivs ovan kan också anpassas till studera protein-ligand interaktioner. Ligander som binder specifikt till ett protein kan öka dess termiska stabilitet genom att införa nya interaktioner inom komplexet. En dosberoende positiv förskjutning i protein Tm är ett lovande tecken på en lyckad protein-ligand interaktion. Hastighet, genomströmning och låga kostnader för screening sammansatta bibliotek med TSA har gjort det till en mycket populär metod i tidig läkemedelsutveckling.
Optimera buffert villkoren för målproteiner och sin ligand komplex kan vara avgörande för ett projekts framgång, som många litteratur exempel visar31,32,33,34. Med en typisk analys tar under 2 h inklusive ställtid, representerar TSA och nanoDSF tillsammans med stabilitet skärmar en snabb, billig teknik för buffert optimeringar.

Många biotechnologically-användbara enzymer har viral källor, såsom tobaken etch virus (TEV) proteas1 och humant rhinovirus typ 3 C (HRV 3 C) proteas2. Horisont 2020 Virus-X projektet (figur 1)3. Syftet med detta program är (a) att utöka utbudet av egenskaperna för kända enzym familjer och (b) att karakterisera roman enzymer av ännu okänd funktion (enzym X). Kristallografiska strukturbestämning spelar en nyckelroll i mål protein karakterisering, särskilt i de fall där proteinsekvenser har utvecklats bortom erkännande4. Protein stabilitet är en nyckelfaktor i kristallisation; prover måste vara conformationally homogen och strukturellt ljud under en viss tidsperiod till formuläret i högkvalitativt, diffracting kristaller. Det är dessutom viktigt för aktivitet analyser som proteinerna som finns i deras aktiv konformation, som också kan underlättas genom en gynnsam molekylär miljö.
Trots utvecklingen i tekniken som finns för kristallografer förblir protein kristallisering en tidskrävande och arbetsintensiva empiriska processen5. Preliminära biofysiska experiment för att förbättra protein stabilitet i lösning ger helt klart en bättre utgångspunkt för protein kristallisation och konsumerar oftast endast en jämförelsevis liten mängd protein prov6,7, 8,9. Det stora antalet målproteiner studeras i detta projekt kräver också skalbar, hög genomströmning stabilitet analyser. En av de mest populära metoderna för pre kristallisering biofysiska karaktärisering av proteinerna är termisk Skift analysen (även känd som TSA eller differential scanning fluorimetry, DSF)10,11.
TSA anställa en miljövänliga fluorescerande färgämne att spåra den termiska denaturering av protein prover. Många vanliga färgämnen har variabel fluorescens aktivitet beroende på polariteten av sin miljö, ofta visar en hög fluorescence utgång i hydrofoba miljöer men som genomgår snabb kylning i polara miljöer12. Proteiner orsakar allmänt uttalad ökar i dye fluorescens som sina hydrofoba kärnor blir utsatta under denaturering, ofta följt av en minskning av färgämne fluorescens vid mycket höga temperaturer som proteiner börjar aggregat (figur 2).
Medan ett vattenavvisande egenskaper-känsliga färgämne är ofta ett bra val för ett allmänt använda TSA färgämne, kan det vara olämpliga för proteiner med stora, lösningsmedel-exponerade hydrofoba regioner, som ofta visar negativt hög bakgrund fluorescens. Fluorophores med alternativa verkningsmekanismer finns (se diskussion), men det kan istället vara önskvärt att spåra denaturering genom inneboende protein fluorescens med nanoDSF.
Tryptofan-rester som är begravda i nonpolar regioner i ett protein fluorescerar med ett utsläpp på högst 330 nm. Som ett protein prov utspelar sig och dessa rester blir utsatt för en polära lösningsmedel, genomgår deras maximala utsläpp en bathochromic övergång till 350 nm13. nanoDSF utnyttjar detta skifte i utsläpp maximal sond unfoldingen av ett protein prov utan behov av yttre fluorophores14.
Smälta kurvor visar enda denaturering steg kan analyseras genom att montera data till en Boltzmann sigmoidal modell. Temperaturen vid en brytpunkt för den pågående övergången (Tm) används som ett kvantitativt mått av protein termisk stabilitet och ett riktmärke för att jämföra favorability av olika villkor.
Smälta kurvor av samma protein i olika förhållanden äg ibland en grad av heterogenitet som kan göra en Boltzmann sigmoidal passande ogenomförbara. För att urskilja Tm värden från data som avviker från den klassiska kurva topologin, kan numeriska metoder användas som sysselsatta i NAMI, en öppen källkod TSA data analys program11. Alternativa termodynamiska ramar kan också användas för att analysera mer komplexa kurvor med flera denaturering steg, till exempel de ProteoPlex metodik15.
Stabilitet skärmarna har utformats för användning i TSA och nanoDSF experiment att snabbt identifiera goda förutsättningar för ett målprotein (figur 3, skärmen kompositioner finns kompletterande uppgifter i). Information som samlats in med skärmar kan användas i många skeden av kristallografiska pipeline, inklusive: prova lagring; rening, minimera avkastning förlust genom protein som utspelas under reningsprocessen; assay design, förstärka protein funktionalitet i aktivitet analyser med termiskt stabilisera buffertar och slutligen kristallisering, vägledande rationellt-designade kristallisering prövningar.
Att välja en lämplig buffert system grunden för ett protein prov är avgörande; inkompatibla pH-värden kan leda till inaktivering eller denaturering av ett protein. Förekomsten av samtidig kristalliserad buffert molekyler löst i ett stort antal röntgen kristallen strukturerar (tabell 1) kunde dock också vara vägledande för en stabiliserande effekt som är separat enkel pH-reglering och i stället härstammar från kemiskt funktioner av buffert molekylen.
Formulerad med flera av Goods buffertar17,18,19 tillsammans med andra vanligen biologiskt-kompatibel buffertsystem, är pH skärmen utformad för att deconvolute kemiska effekten av en buffert molekyl på protein stabilitet faktiska pH-värdet i den resulterande lösningen. Genom att erbjuda tre pH-värden för varje buffertsystem och införliva pH värde redundans mellan olika system, kan skärmen pH identifiera både goda pH-värden och gynnsamma buffertsystem för ett målprotein.
Salt skärmen innehåller vanligen laboratorium salter samt chaotropes, chelants, tungmetaller och reduktionsmedel. Skärmen kan ge en allmän indikation på ett protein prov affinitet till miljöer med höga Joniska styrkor, men varje undergrupp av föreningar kan också ge information om potentiella strukturen av ett protein. Exempelvis kan en chelant som avsevärt destabiliserande ett protein vara vägledande viktiga strukturella metaller inom provet. Om provet är också starkt stabiliseras av en metall cation inom skärmen, kan detta ge en lovande utgångspunkt för ytterligare strukturella experiment.
Osmolytes är lösliga föreningar som påverkar egenskaperna osmotisk i deras miljö. I naturen, kan de användas som ”kemiska chaperones”, att genomdriva den vikningen av oordnade proteiner och stabilisera dem, särskilt i stress villkor20,21,22. Dessa egenskaper gör dem attraktiva tillsatser i röntgenkristallografi; kan användas som cryoprotectants under crystal skörd, montering och förvaring processer23. Osmolytes' potentiella användning omfattar även rening av proteiner. En betydande andel av rekombinanta proteiner som uttrycks i E. coli kan vara olösliga och svårt att återställa i native tillstånd att använda standard reningsmetoder. Osmolytes kan användas för att stabilisera och rädda proteiner från olösliga fraktioner, ökande rening avkastningen24.
Skärmen osmolyte utformades med hjälp av etablerade föreningar som finns i Protein Data Bank poster25 och Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated vägar (DEOP)26 databasen och optimerad iterativt använder standard proteiner. Skärmen är byggd omkring åtta underklasser till osmolyte: glycerol, sockerarter och polyoler, icke-tvättmedel sulfobetaines (NDSBs), betaines och deras analoger, organiska fosforföreningar, dipeptider, aminosyror och deras derivat och en slutlig Diverse grupp. Varje osmolyte är närvarande i flera koncentrationer baserad på dess löslighet och effektiv koncentration spänner för jämförelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:71px;">Melford Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L38100</td>
			<td style="width:435px;">Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham pH Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-101</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">The Durham Salt Screen</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:119px;">MD1-102</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">The Durham Osmolyte Screen</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S6651</td>
			<td style="width:435px;">Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well PCR Plate</td>
			<td style="width:71px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">1403-7700</td>
			<td style="width:435px;">Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td style="width:71px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4362143</td>
			<td style="width:435px;">96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:216px;">Prometheus NT.48</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td align="center" style="width:119px;">#N/A</td>
			<td style="width:435px;">Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (&#916;G and &#916;&#916;G), and aggregation results (Tagg) using built-in software.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">NanoTemper Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PR-C002</td>
			<td style="width:435px;">Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. &#34;High sensitivity&#34; variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (&#60;200 &#181;g ml-1).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the virus-x project

Horisont 2020 Virus-X projektet etablerades 2015 för att utforska virosphere valda extrema biotoper och upptäck nya virala proteiner. För att utvärdera potentiella bioteknisk värdet av dessa proteiner, analys av protein är strukturer och funktioner en central utmaning i detta program. Stabiliteten i protein prov är nödvändigt att ge meningsfull analys resultat och öka crystallizability målen. Termiska Skift analysen (TSA), en fluorescens-baserad teknik, är etablerad som en populär metod för att optimera förutsättningarna för protein stabilitet i hög genomströmning. I TSA är de anställda fluorophores extrinsic, miljövänliga färger. Ett alternativ, liknande teknik är nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), som bygger på protein infödda fluorescens. Vi presenterar här en roman osmolyte skärm, en 96-skick skärmen av organiska tillsatser avsedda att vägleda kristallisering prövningar genom preliminära TSA experiment. Tillsammans med tidigare utvecklade pH och salt skärmar ger uppsättningen tre skärmar en omfattande analys av protein stabilitet i ett brett utbud av buffertsystem och tillsatser. Nyttan av skärmarna demonstreras i TSA och nanoDSF analys av lysozym och Protein X, ett målprotein för Virus-X projektet.

Lysozym var analyseras med stabilitet skärmar och Protein X, ett målprotein i projektet Virus-X, var analyseras med osmolyte skärmen. Båda proteiner i allmänhet produceras smälta kurvor med klart definierade denaturering övergångar i både TSA och nanoDSF experiment (se åtföljande siffror för representativa kurvor). I några fall där de prover som gjorde inte producera tolkningsbara kurvor med en definierad denaturering övergång tolkades som denaturerad och ingår inte i Tm jämförelser.
Figur 7 visar provresultat från salt skärmen, exemplifierar ammoniumklorid mot lysozym termiskt-stabiliserande egenskaper. Koncentration beroenden som den som visas ovan är ofta vägledande av lovande förutsättningar, men det kan vara bra att jämföra resultaten av ökande jonkoncentration med flera olika salter för att se om termisk stabiliserings generellt uppkommer en ökning av buffert jonstyrka eller om förekomsten av specifika joner ger ytterligare stabilitet.
Jämförelse mellan Tm värden av lysozym med pH skärmen (figur 8) visar två bitar av information. För det första, finns det en allmän trend att öka stabiliteten med minskande pH-värden. För det andra kan de utbud av Tm värden som erhålls med olika buffertsystem med identiska pH-värden vara betydande.
Uppgifterna i figur 8 visar att avtalet mellan TSA och nanoDSF i detta experiment är i allmänhet bra, men nanoDSF visar en tendens att identifiera något högre Tm värden och något större Tm skiftar än TSA. Vissa brunnar med pH-värden över 8,5 visar dock stora skillnader mellan Tm värden som erhålls från TSA och nanoDSF. Skillnader skulle potentiellt kunna tillskrivas mekanismen denaturering av protein vid olika pH-värden; ett vattenavvisande egenskaper-känsliga färgämne kan exempelvis ge en jämförelsevis låg Tm läsning om hydrofoba regioner av ett protein blir utsatt för lösningsmedel betydligt snabbare än miljön av tryptofan rester förändringar i polaritet.
Figur 9 visar en heatmap av Tm värden som erhålls med lysozym använda skärmen osmolyte. Villkor med högsta Tm ökningar jämfört med kontrollbrunnarna (brunnar A1 och A2, som innehåller avjoniserat vatten) färgas mörkblå. Särskilt stabiliserande villkor identifieras i figur 9 omfattar glycerol, 1 M D-sorbitol, 100 mM hypotaurine och 10 mM Ala-Gly (brunnar A4-A6, A9, E7 och F8, respektive).
Figur 10 visar en heatmap av Tm värden som erhålls med Protein X. TSA och nanoDSF experiment med skärmen Osmolyte avslöja att majoriteten av osmolytes testat ge antingen en mindre ökning i Tm (inom 1 ° C) eller ha en skadlig effekt på Protein kryssen stabilitet. I synnerhet verkar dipicolinic syra med en koncentration på 10 mM (väl D1) att denaturera provet vid rumstemperatur. TSA och nanoDSF resultaten identifiera snabbt dipicolinic syra som en inkompatibel tillsats för Protein X som bör undvikas när du arbetar med proteinet. Dock höga halter av D-sorbitol och arabinos (brunnar A9 och B9, både på 1 M) samt glycerol och TMAO (brunnar A4-A6 och E1, respektive) identifierades som termiskt-stabiliserande.
För lysozym testades kombinationer av villkor som ger högsta Tm värdena från varje stabilitet skärm för att probe för en synergistisk kombinerade effekt. Figur 11 visar en allmän ökning i Tm värden som mer komponenter i buffert systemet (pH, salt och osmolyte) läggs. När det gäller MES, ammoniumsulfat och D-sorbitol, en Tm öka så stor som 10 ° C kan observeras när alla komponenter är närvarande jämfört MES ensam. Figur 11 visar att en märkbar synergistisk effekt kan uppstå när enskilda komponenter i en buffert är optimerad och kombinerade med skärmarna stabilitet.
På en mer allmän anmärkning illustrerar figur 11 också omfattningen av ΔTm värden som kan observeras i TSA och nanoDSF experiment. Omfattningen av ΔTm kan uppnås varierar betydligt beroende på systemets protein, men något ΔTm värde runt och över 5 ° C är ofta vägledande för en positiv stabiliserande effekt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig1.jpg"> Figur 1 : Bioprospektering. Insamling av prover från en extrem miljö i projekt Virus-X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig2.jpg"> Figur 2: TSA Schematisk. Kommenterade exempel på en typisk smälta kurva som erhålls från ett TSA-experiment. Denna kurva är kännetecken av klassiska ”två-påstå” protein utspelar sig, där ett urval av populationen övergångar från vikt till denaturerat utan påvisbara delvis-viks intermediärer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig3.jpg"> Figur 3 : Stabilitet skärmar arbetsflödet. Standardarbetsflöde buffert optimering via skärmarna stabilitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig4.jpg"> Figur 4 : Arbetsflöde standard TSA experimentera med stabilitet skärmarna. Från vänster till höger: (A) Pipetting alikvoter av stabilitet skärmarna i en plattan med 96 brunnar. (B) pipettering protein prov med fluorescerande färgämne i plattan. (C) tätning plattan innan centrifugering. (D) att placera plattan i en RT-PCR-system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig5.jpg"> Figur 5: arbetsflöde för ett standard nanoDSF experiment. (A) öppna kapillären lastning rack. B lastnings kapillärerna i racket. (C) immobilisera kapillärerna med den magnetiska försegla remsan. (D) programmering ett experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig6.jpg"> Figur 6 : Användargränssnittet för RT-PCR system. Ett TSA experiment har programmerats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig7.jpg"> Figur 7 : Salt skärmen exempeldata. (A) förhållandet mellan fluorescens intensiteter på 350 nm vs 330 nm för en etikett-fri nanoDSF experiment med lysozym. Prover motsvarar brunnarna C7-C12 på skärmen salt (1,5 M - 0.2 M ammoniumklorid). Beräknade Tm värden för varje villkor är ovanpå tomten. (B) Sammanfattning av Tm värden beräknade från de data som presenteras i figur 7A. (C) fluorescens intensiteter på 590 nm för ett TSA experiment med lysozym med ett vattenavvisande egenskaper-känsliga reporter färgämne. Som figur 7Amotsvarar proverna brunnarna C7-C12 av salt skärmen. Beräknade Tm värden är ovanpå grafen. (D) Sammanfattning av Tm värden beräknade från data i figur 7C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig8.jpg"> Figur 8: pH skärmen exempeldata. Sammanfattning av Tm Skift erhålls med lysozym och pH skärmen. Varje punkt representerar en oberoende tillstånd; punkter med samma pH-värde är av olika buffertsystem på samma pH. Tm förskjutningar beräknas i förhållande till en kontroll Tm 68,0 ° C för TSA experiment och 71,9 ° C för nanoDSF experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig9.jpg"> Figur 9 : Osmolyte skärmen exempeldata (lysozym). Sammanfattning av Tm värden som erhålls från en etikett-fri nanoDSF experiment med lysozym och varje brunn av osmolyte skärmen. Tm värden (i ° C) jämförs brunnarna A1 och A2 som innehåller vatten som en kontroll. En heatmap genererades utifrån ΔTm värden jämfört (blå betecknar en Tm ökning och röd Tm minskade). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig9large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig10.jpg"> Figur 10: Osmolyte skärmen exempeldata (Protein X). (A) Sammanfattning av Tm värden som erhålls från en etikett-fri nanoDSF experiment med Protein X och osmolyte skärmen. Tm -värdena jämförs brunnar A1 och A2 som innehåller vatten som en kontroll. En heatmap genererades utifrån ΔTm värden jämfört (blå betecknar en Tm ökning och röd Tm minskade). (B) nanoDSF kurvor erhållits från väl A9 (1 M D-sorbitol, ett stabiliserande tillstånd) och D1 (10 mM dipicolinic syra, ett destabiliserande tillstånd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig11.jpg"> Figur 11 : Buffert optimering effekt på Tm. TSA Tm värden av lysozym kombinerat med villkoren för varje skärm som ges den största ökningen i Tm. 100 mM ättiksyra, pH 4,2 och 100 mM MES, pH 5,6, valdes som buffert systemen, tillsammans med 1,5 M ammoniumsulfat som salt. Osmolyte koncentrationer var identiska med de som finns i skärmen osmolyte: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50 mM L-lysin och 100 mM hypotaurine. Felstaplar representera standardavvikelsen för sex replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Molekyl</td>
			<td>PDB kod</td>
			<td>Frekvensen av samtidig kristallisation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfat</td>
			<td>PO4</td>
			<td>5132</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetat</td>
			<td>ACT</td>
			<td>4521</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic syra (MES)</td>
			<td>MES</td>
			<td>1334</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris (hydroxymetyl) aminometan (tris)</td>
			<td>TRS</td>
			<td>1155</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formate</td>
			<td>FMT</td>
			<td>1072</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammanfattning av buffert molekyl samtidig kristallisation frekvens i Protein Data Bank (PDB) poster. Data som erhållits genom PDBsum16 från totalt 144,868 bidrag (korrekt per den 12-5-18).
Tilläggsinformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Information.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen</a>. 
Kompletterande tabell 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen</a>. 
Kompletterande tabell 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_2.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen</a>. 
Kompletterande tabell 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_3.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen</a>.

Watch this Scientific Journal Video about How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project at JoVE.com

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Hur man stabilisera Protein: stabilitet skärmar för termiska skifta analyser och Nano Differential Scanning Fluorimetry i projektet Virus-X

Ett protokoll presenteras för att snabbt testa den termiska stabiliteten av proteiner i en mängd olika förhållanden genom termisk Skift analyser och nano differential scanning fluorimetry. Buffertsystem, salter och tillsatser, grupp är bestående av tre unika stabilitet skärmar, analyseras med proteiner för att identifiera lämpliga buffertar för funktionella och strukturella studier.

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Denna metod kan svara på frågor i protein kemi och läkemedelsupptäckt såsom vilka förhållanden stabilisera ett protein? Vilka mutationer påverkar termostabiliteten hos ett enzym? Och vilka ligander binder till ett proteinmål?De viktigaste fördelarna med denna teknik är att det är snabbt, enkelt utförs i ett standardlaboratorium, och perfekt anpassade till medium till hög genomströmning applikationer. För att förbereda proteinprovet överföring 10 mikroliter av varje villkor av en stabilitetsskärm i motsvarande brunn av en 96 brunnsplatta med hjälp av en flerkanalig pipett för att spara tid. Förbered sedan en milliliter på cirka ett milligram per milliliter proteinlösning i ett lämpligt buffertsystem.Om utför en termisk skift assay lägga SYPRO orange färgämne till proteinet provet till en slutlig koncentration av 20X. Blanda antingen genom inversion eller en kort virvelning. Överför nu 10 mikroliter av proteinlösningen till varje brunn av 96 brunnsplattan.Täta och centrifug 96 brunnsplattan i två minuter vid 600 gånger G för att säkerställa att proteinprovet och skärmkomponenten blandas. Återförslut stabiliteten skärmen djup väl blockera och lagra skärmen på fyra grader Celsius i upp till fyra månader. För att utföra TSA-experimentet öppnar du provlådan genom att trycka ordentligt på indraget på den högra sidan av byrålådan.Placera 96 brunnsbrickan i RTPCR-systemet med väl A-1 till vänster bak. Klicka på den nya experimentknappen för att börja ställa in ett TSA-experiment. Klicka på alternativet Smältkurva när du får frågan på fliken Experimentegenskaper, vilken typ av experiment vill du ställa in?Klicka sedan på det andra alternativet när du blir tillfrågad, vilka reagenser vill du använda för att upptäcka målsekvensen? I fliken Plattan setup, Definiera mål och exempel, ange en Målnamn, sedan ange Reporter som ROX. Och Quencher som Ingen.I fliken Plattan setup, Tilldela mål och prover, ange Välj färgämnet att använda som passiv referens som Ingen. I samma flik, tilldela varje brunn av 96 väl plattan till målnamnet anges i föregående steg. Ta bort steg i fliken Kör metod tills det finns totalt tre.Ställ in det första steget till 25 grader Celsius, med en ramphastighet på 100%och tid på fem sekunder. Ställ in det andra steget till 95 grader Celsius, med en ramphastighet på 1%och tid på en minut. Ställ slutligen in det tredje steget till 95 grader Celsius med en ramphastighet på 100%och tid på fem sekunder.Välj att samla in data med hjälp av menyn för att släppa in data eller genom att klicka på datainsamlingsikonen. Ställ in reaktionsvolymen per brunn till 20 mikroliter. Klicka på startkörningsknappen för att påbörja TSA-experimentet.NanoDSF kan användas för att sond protein termisk stabilitet utan användning av intrinsikala färgämnen. Prover kan beredas i 96 brunnsplattor som beskrivits tidigare i protokollet men utan att tillföra något SYPRO orange färgämne. Öppna exempellådan genom att trycka på knappen Öppna ritlåda.Se till att utrustningen är ren, spelar särskild uppmärksamhet på eventuellt damm i närheten av provet rack. Om systemet har tillbaka spridning spegel rengöra den med hjälp av etanol och en ludd fri vävnad. Ladda kapillärerna med cirka 10 mikroliter från varje brunn av 96 brunnsplattan genom att vidröra kapillärens ena ände i lösningen.Och placera sedan kapillären i motsvarande kapillärhållare av provstället. Var noga med att inte förorena mitten av kapillärerna med fingeravtryck eftersom detta kan störa fluorescens avläsningar under hela experimentet. Immobilisera kapillärerna med en magnetisk tätningslist.Starta en preliminär genomsökning för att upptäcka position och intensitet för varje kapillär genom att trycka på knappen Starta identifieringssökning i fliken Identifieringsskanning. Öka eller minska den infallande excitation styrka från en initial effekt på 10%tills toppen av varje kapillär skanning är mellan 4, 000 och 12, 000 enheter. I fliken Smältande skanna en Smältskanning genom att ställa in alternativet Temperaturlutning till 7,0 grader per minut.Starta Temperatur till 25 grader Celsius. Och Sluttemperatur till 95 grader Celsius. Starta sedan nanoDSF-experimentet genom att trycka på knappen Börja smälta.Upprepa dessa steg för att förbereda proverna för ett fullständigt experiment. När hela experimentet har ställts in navigerar du till fliken Smältande skanning och programmerar en Melt Scan genom att ställa in alternativet Temperaturlutning till 1,0 grader Celsius per minut. Starta Temperatur till 25 grader Celsius.Och Sluttemperatur till 95 grader Celsius. Slutligen, starta nanoDSF experimentet genom att trycka på knappen Börja smälta. T m används som ett kvantitativt mått på protein termisk stabilitet i ett riktmärke för att jämföra favorability av olika förhållanden.Visas här är provresultat från saltskärmen, exemplifierar termiskt stabiliserande egenskaper av ammoniumklorid mot lysozym. Jämförelse av T m värden av lysozym med pH-skärmen avslöjar att avtalet mellan TSA och nanoDSF är i allmänhet bra men nanoDSF visar en tendens att identifiera något högre T m värden i något större T m skift än TSA. Det finns en allmän trend av ökande stabilitet med minskande pH-värden.Det intervall av T m-värden som erhålls med hjälp av olika buffertsystem med identiska pH-värden kan vara signifikant. För lysozym kombinationer av förhållanden som ger de högsta TSA T m-värdena från varje stabilitetsskärm testades för att sondera för en synergistisk kombinerad effekt. Det finns en allmän ökning av T m-värden som fler komponenter i buffertsystemet läggs till.En märkbar synergistisk påverkan kan uppstå när enskilda komponenter i en buffert optimeras och kombineras med stabilitetsskärmarna. Efter denna teknik andra metoder såsom kristallisation kan användas för att bestämma den tredimensionella strukturen av ett protein och riva upp den molekylära grunden för ligand bindning. Förutom att vi ger insikt i proteinstabilitet som en del av Virus-X-projektet, är denna teknik tillämplig på ett brett spektrum av läkemedelsupptäckts- och utvecklingssystem.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry - en metod för bedömning av termisk stabilitet och konformationen av proteinantigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA-agarosgel-retardationsanalyser för analys av<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -treonylkarbamoyladenosin-TcdA-funktionen

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...