Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
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这项工作得到了国家自然科学基金会 (81671016、31471008、3161613030) 和国家卫生研究院 (dc010012、dc015819) 和四元基金会的资助。

浙江大学动物护理和使用机构委员会对所有涉及小鼠的实验进行了评审和批准。建议在执行本协议之前佩戴适当的个人防护设备。
1. 小鼠和 dss 的制备
<ol><li>将敲除小鼠 (α-gustducin-/-) 和年龄、性别和身体体重匹配的野生对照 (α-gustducin+/+) c57bl6 小鼠单独保存在干净的笼子里。 注: 淘汰赛小鼠与 c57bl6 小鼠的反交叉时间超过20代, 具有近 100% c57bl"的遗传背景。...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

该方法可用于定量测定特定味觉基因突变对 dss 诱导的 ibd 小鼠模型炎症的影响。要充分利用 ibd, 最佳的 ibd 归纳是关键的一步。结肠炎的发展受多种因素的影响, 包括小鼠菌株、居住环境、肠道菌群以及感兴趣的基因。建议对少数小鼠进行试点实验, 以测试 dss 给药的不同剂量和持续时间。在试点实验中, 体重减轻、腹泻、肠道出血等严重症状, 以及组织损伤、免疫细胞浸润相关炎症、细胞因子表达...

炎症性肠病 (ibd)、克罗恩病 (cd) 和溃疡性结肠炎 (uc) 的两种主要形式的特点是慢性缓解或肠道进行性炎症的情况, 有多种因素的病因1,2.ibd 的发展取决于遗传以及某些环境因素, 如饮食、抗生素的使用, 以及重要的是致病性感染。然而, ibd 背后的病因和调控分子机制尚不清楚。因此, 许多化学诱导的 ibd 动物模型已经构建并应用, 以界定其发病机制和调节机制,并评估人类疗法的有效性3。
味觉受体是 g 蛋白偶联受体 (gpcr), 分为两种主要类型: i 型 (T1Rs) 和 ii 型 (T2Rs), 检测甜味、乌马米和苦味化合物。味觉信号级联是由味觉与 T1Rs 或 T2Rs 结合而开始的, 激活由α-gustpinin 和 gβγ二聚体组成的异位 g 蛋白, 并导致 gβ-γ亚基的释放。gβγ基团反过来刺激下游效应酶磷脂酶 c-β2 (plc-β2)。激活 plc-β2然后水解磷脂-4, 5-双磷酸酯水解成两个细胞内的次生信使 [肌醇-1, 4, 5-三磷酸 (ip 3) 和二酰基甘油], ip3结合并打开其通道受体 ip 3r3, 从内质网释放钙离子。这最终导致瞬态受体电位离子通道 trpm5 的开放和神经递质 atp 释放到味觉神经 4,5,6, 7.然而, 咸味和酸味的信号通路是不同的, 独立于甜味、乌米和苦味.此外, 味觉 gpcr 和下游蛋白的成分存在于各种口腔外组织中。最近的研究表明, α-gustducin, 味觉信号的主要组成部分, 被发现在肠道黏膜表达。需要进一步的研究来了解这些味觉信号成分在口腔外组织9,10的功能。
这里描述的方法是用来描述在口腔外组织中表达的味觉信号蛋白的功能。我们结合了转基因小鼠线开发的划定信号级联在味蕾与化学诱导的结肠炎模型。主要由于其程序简单和病理相似的人溃疡性结肠炎, 右旋糖酐硫酸钠 (dss) 诱导 ibd 模型已被最广泛地应用于各种化学诱导的结肠炎模型11。在这项研究中, 我们使用α-gustp型缺乏小鼠作为一个典型的小鼠行, 通过 1) 分析组织的形态变化和 2) 分析在表达的差异, 揭示α-gust糊涂 in 在肠道黏膜免疫和炎症中的新功能。与结肠炎症有关的细胞因子。这种方法可以用来定量和定性地确定味觉信号蛋白 (和其他蛋白质在肠道中表达) 对组织损伤和肠道炎症的贡献, 当转基因小鼠线的基因利息是可用的。这种方法的优点是使用户能够获得化学 dss 和感兴趣基因缺乏的作用所产生的综合数据。这种方法可以进一步改进, 以提高其敏感性, 并揭示在细胞和分子水平的微妙肠道变化。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

炎症性肠病 (ibd) 是一种与免疫有关的胃肠道疾病, 包括溃疡性结肠炎和克罗恩病, 影响着全世界数百万人的生活质量。ibd 症状包括腹痛、腹泻和直肠出血, 这可能是肠道微生物群、食物成分、肠道上皮细胞和免疫细胞相互作用造成的。评估肠道上皮和免疫细胞中表达的每个关键基因如何影响结肠炎症尤为重要。在肠道中发现了 g 蛋白偶联味觉受体, 包括 g 蛋白亚基α-gustducin 和其他信号蛋白。在这里, 我们以α-gustcducin 为代表, 描述了糊精硫酸钠 (dss) 诱导的 ibd 模型, 以评估味觉基因突变对肠道黏膜免疫和炎症的影响。该方法将基因敲除技术与化学诱导的 ibd 模型相结合, 可用于评估味觉基因失效的结果, 以及可能旺盛或抑制 dss 诱导的结肠免疫反应的其他基因。突变体小鼠在一定时期内使用 dss 进行监测和记录其体重、粪便和直肠出血。在给药过程中的不同时间点, 对一些小鼠进行安乐死, 然后测量其脾脏和结肠的大小和重量, 收集和处理肠道组织, 进行组织学和基因表达分析。数据显示, α-胃动素敲除导致过度减肥, 腹泻,肠道出血, 组织损伤, 和炎症相比, 野生类型的小鼠。由于诱导炎症的严重程度受小鼠菌株、居住环境和饮食的影响, 在试点实验中优化 dss 浓度和给药时间尤为重要。通过调整这些因素, 这种方法可以用来评估抗炎和促炎作用。

通过在饮用水中对α-瓜司素敲除 (ko) 和野生类型 (wt) 小鼠进行3% 的 dss 处理, 建立了 dss 诱导的 ibd 程序。与 wt 小鼠相比, 淘汰赛小鼠表现出更严重的结肠炎, 体重过多、腹泻和肠道出血 (图 1)。用 h & amp; e 染色作为组织学方法, 在7天的 dss 给药后, 分析了组织完整性的差异, 在敲除小鼠的近端、中、远端结肠中发现的组织损伤比 wt 小鼠严...

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Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

在这里, 我们提出了一个方案, 以调查取消与阵风相关的基因对免疫反应的影响, 糊精硫酸钠 (dss) 诱导的炎症性肠病 (ibd) 小鼠模型。

味觉信号蛋白废除对炎症性肠病小鼠肠道炎症的影响

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

这种方法可以帮助回答炎症性生物疾病领域有关溃疡性结肠炎和克罗恩病的关键问题。该技术的主要优点是，它可以用来评估信号蛋白的第一个抗和亲作用。该技术的含义扩展了气体在新进展和炎症中的调查。虽然这种方法可以提供对肠道炎症的遗传效应的见解。它也可以应用于其他因素，如饮食和微生物群。一般来说，这个学期的新鲜人会挣扎，因为治疗疾病疤痕组织是棘手的。这种方法的视觉演示是至关重要的，因为解剖和组织准备步骤是很难学习的，因为肿瘤和细胞组织结构可能会改变。要诱导硫酸钠或DDS结肠炎，用3%DSS溶液代替普通饮用水，加入7天。每天测量每只老鼠的体重、DSS 溶液的消耗量和粪便生产。在七天治疗结束时，将鼠标放在苏皮位置，用小剪刀在腹部做一个三厘米长的中线切口。收获脾脏并测量其大小。然后使用钳子提起结肠，以便将其与周围的肠胃分离。提取整个结肠，直到切库姆和直肠可见。在结肠边缘的转流组织。和骨盆深处分别释放近位和近结。测量并记录隔离冒号的长度。并使用装有格瓦奇针的 10 毫升注射器用 10 毫升的冰冷 PBS 冲洗结肠，以去除粪便和血液，直到病菌运行清楚。对于组织学鉴定，将组织样本分成大小相等的近位、中间和近面部分。在4摄氏度下将组织在4%的甲醛中过夜。对于分离的结肠组织的血氧素和 eosin 染色，第二天早上，将组织片中 30%蔗糖和 PBS 中过夜地淹没在单独的 15 毫升管中，用于对样品进行低温保护。第二天，将组织嵌入最佳切割温度或 OCT 化合物中。在零下20摄氏度下冷却组织，直到奥克百年变硬。将 OCT 块放在低温器中，将厚度表盘设置为 12 微米。然后将 12 微米厚的冷冻部分切片并收集到玻璃显微镜幻灯片上。当所有组织都切块后，在热板上加热65摄氏度的滑梯20分钟。在用赤氧林染色溶液染色五分钟之前，先在蒸馏水中短暂清洗加热部分。去除多余的赤氧树脂溶液，在自来水中运行五分钟。区分乙醇中0.5%盐酸的部分30秒，然后用自来水冲洗1分钟。接下来，在 PBS 中清洗样品一分钟。接着在自来水下再洗五分钟。在洗涤结束时，将组织浸入上升乙醇系列中，每次浸入10秒。接着是 eosin 的反污了两分钟。对于样品的脱水，将滑梯浸入95%乙醇和两次100%乙醇的改变，每浸5分钟。接着清除了二甲苯的两分五分钟的变化。然后对每个实验组的近结、中间结肠和近结的组织损伤进行评分。对于免疫石化学分析，在热板上加热部分20分钟后，在PBS中清洗幻灯片三次，每次洗涤10分钟。通过10分钟3%过氧化氢孵育，消除内源性过氧化物酶。在孵化结束时，如演示，在 PBS 中清洗样品三次，并在室温下用阻塞缓冲液阻止任何非特异性结合至少一小时。然后，用感兴趣的原抗体鸡尾酒替换阻塞缓冲液。在4摄氏度下过夜孵育。第二天早上，吸出多余的原抗体溶液，并在PBS中洗三次幻灯片。最后一次洗涤后，用适当的生物基化二次抗体鸡尾酒孵育幻灯片。其次是在室温下用斯特雷普他丁马萝卜过氧化物酶复合物标记。要可视化免疫反应细胞，请用 DAB 标记样品，直到形成浅棕色或深棕色。用赤氧林和0.3%稀释氨来对抗这些部分。当幻灯片干燥后，使用光学显微镜在 10 倍放大倍率下获取组织部分的明亮场图像。并使用图像处理程序来识别和量化上皮和层状丙体中标记的免疫细胞的数量。对于 DSS 治疗结肠的基因表达分析，根据标准 RNA 提取方案，从零下 80 摄氏度解冻的结肠组织样本中提取 RNA。并混合一微克与总RNA与2.5微升20毫摩尔寡氧胺12至18个底土和1微升莫洛尼穆林白血病病毒逆转录酶。在42摄氏度下孵育60分钟后，将cDNA的一微升与0.5%的合适前向和反向定量PCR底板混合，用于感兴趣的细胞因子和2倍荧光绿色染料。然后在适当的参数下运行定量PCR，根据标准协议计算相对基因表达。与野生型小鼠相比，α阵风霉素敲除小鼠表现出更严重的结肠炎，体重过度减轻，腹泻和肠道出血。经过七天的DSS施用后，对结肠部分的组织学分析表明，与野生型小鼠相比，敲鼠的近位、中号和近结结肠内组织损伤更加严重。这种过度的免疫活化导致结肠炎的诱导，免疫组织化学分析观察到，各种炎症细胞在敲除动物结肠中具有强大的渗透作用。此外，定量PCR分析表明，与野生型小鼠结肠相比，TNF alpha和不鱼伽玛表达水平较高，但IL-5、10和13的表达较低，在TGF beta一个表达中没有差异。在尝试此过程时，重要的是要记住优化文本南瓦钠剂量和示范持续时间。转发这个程序，其他方法，如获得培养，以了解其他问题，如炎症在肠道组织起源的影响。在它的发展之后，这项技术为肠道炎症领域的研究人员探索基因突变对生物疾病侵蚀和其他脊椎动物的严重程度的贡献铺平了道路。不要忘记，与疾病肠道组织及其内容工作可能是极其危险的，并影响，如穿的东西是适当的，个人保护永久应该始终采取，而执行这个程序。

Research

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infect humans and livestock1. ...

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The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

皮层肌动蛋白流通过结构照明显微镜数据的时空图像相关光谱量化性T细胞

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

高通量设置的建立筛选小分子能调节C-二GMP信令<em&gt;绿脓杆菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

可视化痰生物膜发展影响使用腔室盖玻片型号

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

精密切割的小鼠肺切片可视化现场肺树突状细胞

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

IL-8瞬时转化的小鼠模型<em&gt;体内</em&gt;长期监测炎症反应

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...