Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 og 31661143030) og National Institutes of Health (DC010012, DC015819) og Siyuan Foundation.

Alle forsøg med mus blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg af Zhejiang University. Det anbefales at bære passende personlige værnemidler før du udfører denne protokol.
1. forberedelse af mus og DSS
<ol><li>Holde den knockout (α-gustducin- / -) mus og alder-, køn- og vægt-matchede vildtype kropskontrol (α-gustducin+/ +) C57BL/6 mus individuelt i ren bure. Bemærk: Knockout mus har været backcrossed med C57BL/6 mus til over...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Denne metode kan anvendes til kvantitativt fastslå effekten af mutationer af specifikke gustatoriske gener på betændelse i en DSS-induceret IBD musemodel. For at drage fuld fordel, er optimal induktion af IBD et vigtigt skridt. Udviklingen af colitis er påvirket af flere faktorer, herunder mus stamme, boliger miljø, intestinal mikroflora, samt gener af interesse. Det anbefales at udføre et pilotprojekt med et lille antal mus til at teste forskellige doser og varigheder af DSS administration. Under pilot eksperiment...

De to vigtigste former for inflammatorisk tarmsygdom (IBD), Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC) er karakteriseret ved kronisk remittent eller progressive betændelsestilstande i tarmen med multifaktoriel ætiologi1,2 . Udviklingen af IBD afhænger af genetiske samt visse miljømæssige faktorer som kost, brug af antibiotika, og vigtigere, patogene infektioner. Ætiologi og regulerende molekylære mekanismer bag IBD er dog stadig uklart. Derfor, mange kemisk inducerede IBD dyremodeller er blevet konstrueret og anvendes for at afgrænse patogenese og reguleringsmekanismer og vurdere effektiviteten af menneskelige therapeutics3.
Smag receptorer er G protein koblede receptorer (GPCRs) og er klassificeret som to hovedtyper: type I (T1Rs), og type II (T2Rs), der registrerer sweet, umami og bitter forbindelser. Smag signaling cascades er initieret af tastant binding til T1Rs eller T2Rs, aktivering af heterotrimeric G proteiner består af α-gustducin og en Gβγ dimer og fører til frigivelse af Gβγ underenheder. Gβγ gruppe stimulerer igen downstream effektor enzym fosfolipase C-β2 (PLC-β2). Aktiveret PLC-β2 derefter hydrolyserer phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat i to intracellulære sekundære messengers [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol] og IP3 binder sig til og åbne sin kanal-receptor IP3 R3, frigivelse af calciumioner fra det endoplasmatiske reticulum. Dette fører i sidste ende til åbningen af forbigående receptor potentielle ion-kanal Trpm5 og udgivelse af neurotransmitteren ATP på gustatoriske nerver4,5,6,7. Den signaling veje af salt og Sure smag er dog forskellige og uafhængige fra sweet, umami og bitter smag8. Derudover findes komponenter af smag GPCRs og downstream proteiner i forskellige ekstra mundtlige væv. Nylige undersøgelser vist, at α-gustducin, er den vigtigste komponent i smag signalering, fundet skal udtrykkes i tarmslimhinden. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå funktionerne af disse smag signalerer komponenter i ekstra mundtlige væv9,10.
Metoden beskrevet her bruges til at karakterisere funktioner af gustatoriske signaling proteinerne udtrykt i ekstra mundtlige væv. Vi kombinerer en Transgene mus linje udviklet til skildrer signaling cascades i smagsløg med kemisk inducerede colitis model. I vid udstrækning skyldes dens proceduremæssige enkelhed og patologiske ligheder med menneskelige colitis ulcerosa, dextran sulfat natrium (DSS)-induceret IBD model har været mest udbredt blandt de forskellige kemisk inducerede colitis modeller11. I denne undersøgelse brugte vi α-gustducin-mangelfuld mus som en repræsentativ mus linje til at afsløre nye funktioner af α-gustducin i tarmen mucosal immunitet og betændelse af 1) analyserer morfologiske forandringer i væv og 2) boltpistoler forskelle i udtryk for cytokiner relateret til betændelse i tyktarmen. Denne metode kan bruges til kvantitativt og kvalitativt bestemme gustatoriske signaling proteiner (og andre proteiner, udtrykt i tarmen) bidrag til vævsskader og tarmbetændelse, når genetisk modificerede mus linjer for gener interesse er tilgængelige. Fordelene ved denne metode muliggører brugernes hen til opnå integrerede data som følge af handlinger af både den kemiske DSS og mangel på gen af interesse. Denne metode kan forbedres yderligere for at øge sin følsomhed og afslører subtile intestinal ændringer på cellulære og molekylære niveau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en af de immun-relaterede gastrointestinale lidelser, herunder colitis ulcerosa og Crohns sygdom, der påvirker livskvalitet for millioner af mennesker verden over. IBD symptomer omfatter smerter i underlivet, diarré, og rektal blødning, som kan følge af samspillet mellem gut mikrobiota, LEVNEDSMIDDELBESTANDDELE, intestinal epitelceller og immunceller. Det er særligt vigtigt at vurdere, hvordan hver nøglen gen udtrykt i tarm epitel og immun celler påvirker betændelse i tyktarmen. G protein koblede smag receptorer, herunder G protein-underenheder α-gustducin og andre signaling proteiner, er blevet fundet i tarmene. Her bruger vi α-gustducin som en repræsentant og beskrive en dextran sulfat natrium (DSS)-induceret IBD model til at vurdere effekten af gustatoriske genmutationer på gut mucosal immunitet og betændelse. Denne metode kombinerer genteknologi knockout med de kemisk inducerede IBD model, og dermed kan anvendes til at vurdere resultaterne af gustatoriske gen annulleringen samt andre gener, der kan exuberate eller dæmpe den DSS-induceret immunrespons i tyktarmen. Mutant-mus administreres med DSS i en vis periode, hvor deres kropsvægt, taburet og rektal blødning er overvåget og registreret. Ved forskellige timepoints under administration, nogle mus er euthanized, derefter størrelser og vægte af deres milt og koloner måles og gut væv er indsamlet og behandlet histologiske og gen expression analyser. Dataene viser, at α-gustducin knockout resultater i overdreven vægttab, diarré, intestinal blødning, vævsskader og betændelse vs. wild-type mus. Da sværhedsgraden af induceret inflammation er ramt af musen stammer, boliger miljø og kost, er optimering af DSS koncentration og administration varighed i et pilotprojekt særlig vigtig. Ved at justere disse faktorer, kan denne metode anvendes til at vurdere både anti - og pro-inflammatoriske effekter.

En DSS-induceret IBD procedure blev etableret af administration af 3% DSS i drikkevand til α-gustducin-knockout (KO) og wild-type (WT) mus. I forhold til WT mus, udstillet knockout mus mere svær colitis med overdreven vægttab, diarré, og intestinal blødning (figur 1). Efter en 7-dages DSS administration, forskelle i væv integritet blev analyseret ved hjælp af H & E farvning som metoden histologiske og mere grov vævsskader blev fundet i den proksimale,...

Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model (Video) | JoVE

Her præsenterer vi en protokol for at undersøge effekten af annulleringen af gustation-relaterede gener på immunrespons i en dextran sulfat natrium (DSS)-induceret inflammatoriske tarm sygdom (IBD) musemodel.

Virkningerne af smag signalerer Protein afskaffelse på Gut betændelse i en inflammatorisk tarm sygdom musen Model

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i den inflammatoriske biodisease felt om colitis ulcerosa og Crohns sygdom. Den største fordel ved denne teknik er, at det kan bruges til at evaluere første anti og proinfammatoriske virkninger af signalering proteiner. Konsekvenserne af denne teknik udvider undersøgelsen af gas i nye fremskridt og betændelse.Selv om denne metode kan give indsigt i genetisk effekt på tarmbetændelse. Det kan også anvendes til andre faktorer såsom kost og mikrobiom. Generelt, personer nye til dette semester vil kæmpe, fordi behandlingen sygdom arvæv er vanskelig.Visuel demonstration af denne metode er kritisk som dissektion og vævspræparat trin er vanskelige at lære, fordi mystalia og cellevæv strukturer kan ændres. For at fremkalde dextransulfatnatrium eller DDS colitis skal du udskifte det almindelige drikkevand med 3% DSS-opløsning, tilsættes libidium i syv dage. Måling af hver mus kropsvægt, DSS løsning forbrug, og afføring produktion dagligt.I slutningen af de syv dages behandling, placere musen i liggende position og bruge små saks til at gøre en tre centimeter lang midterlinjen snit i maven. Høst milten og måle dens størrelse. Brug derefter kraftbånd til at løfte tyktarmen, så det kan adskilles fra det omgivende mesenteri.Og uddrag hele tyktarmen, indtil cecum og endetarmen er synlige. Transect vævet på koloskale margin. Og dybt inde i bækkenet for at befri den proksimale og distale kolon, henholdsvis.Mål og optag længden af det isolerede kolon. Og brug en 10 milliliter sprøjte udstyret med en sonde nål til at skylle tyktarmen med 10 milliliter iskold PBS at fjerne afføring og blod, indtil illuate løber klar. For histologisk identifikation, opdele vævsprøver i lige store proksimale, midterste og distale sektioner.Og fastsætte væv i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 grader Celsius. For hæmatoxylin og eosin farvning af det isolerede tyktarmsvæv, næste morgen, nedsænkes væv stykker i 30% saccharose og PBS natten over i individuelle 15 milliliter rør til kryobeskyttelse af prøverne. Den næste dag, indlejret væv i optimal skæretemperatur eller OCT sammensatte.Og afkøle væv i minus 20 grader Celsius, indtil OKT hærder. Placer OCT blokke i kryostat og indstille tykkelsen dial til 12 mikrometer. Skær derefter og opsam 12 mikrometer tykke frosne sektioner på glasmikroskopdias.Når alle væv er blevet snittet, varm dias ved 65 grader Celsius på en varmeplade i 20 minutter. Og vask de opvarmede sektioner kortvarigt i destilleret vand, før farvning med hæmatoxylin farvning løsning i fem minutter. Fjern den overskydende hæmatoxylin opløsning og køre i postevand i fem minutter.Og differentiere sektionerne med 0,5% saltsyre i ethanol i 30 sekunder, efterfulgt af en et minut skylning under rindende vand fra hanen. Dernæst vaskes prøverne i et minut i PBS. Efterfulgt af yderligere fem minutters vask under rindende vand fra hanen.Ved afslutningen af vasken nedsænkes vævet i en stigende ethanolserie i 10 sekunder pr. nedsænkning. Efterfulgt af kontravægt i eosin i to minutter. Ved dehydrering af prøverne nedsænkes objektglassene i 95 % ethanol og to ændringer på 100 % ethanol i fem minutter pr. nedsænkning.Efterfulgt af clearing med to, fem minutter ændringer i xylen. Derefter score vævsskader på proksimale, midterste, og distale koloner af hver eksperimentel gruppe. For immunhisemisk analyse vaskes rutsjebanerne tre gange i PBS i 10 minutter pr. vask efter opvarmning af sektionerne i 20 minutter på kogepladen.Og fjerne den endogene peroxidase med en 10 minutters 3% hydrogenperoxid inkubation. Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne tre gange i PBS som påvist, og enhver uspecifik binding med blokerende buffer blokeres i mindst en time ved stuetemperatur. Derefter erstatte blokering buffer med den primære antistof cocktail af interesse.For en overnatning inkubation på 4 grader Celsius. Næste morgen aspirere den overskydende primære antistofopløsning og vask rutsjebanerne tre gange i PBS. Efter den sidste vask inkuberes objektglassene med den relevante biotinylerede sekundære antistofcocktail.Efterfulgt af mærkning med streptavidin peberrod peroxidase kompleks ved stuetemperatur. For at visualisere de immunoraktive celler, mærke prøverne med DAB, indtil en lys eller mørk brun farve udvikler. Og kontrastain sektionerne med hæmatoxylin og 0,3% fortyndet ammoniak.Når objektglassene er tørret, skal du bruge et lysmikroskop til at opnå lyse feltbilleder af vævssektionerne under en 10x forstørrelse. Og bruge et billedbehandlingsprogram til at identificere og kvantificere populationen af de markerede immunceller i både epitel og lamina propria. Til genekspressionsanalyse i DSS-behandlede koloner skal RNA fra minus 80 grader Celsius optøede kolonvævsprøver i henhold til standard RNA-ekstraktionsprotokoller.Og bland et mikrogram med det samlede RNA med 2,5 mikroliter på 20 millimolar oligo deoxythymidin 12 til 18 primere og en mikroliter af molony murine leukæmi virus omvendt transskription. Efter en 60 minutters inkubation ved 42 grader Celsius blandes en mikroliter af cDNA med 0,5 % mikroliter af passende frem- og tilbage kvantitative PCR-primere til cytokiner af interesse og 2x fluorescerende grønt farvestof. Kør derefter den kvantitative PCR under de relevante parametre, og beregn det relative genekspression i henhold til standardprotokoller.Sammenlignet med wildtype mus, alpha gustducin knockout mus udviser en mere alvorlig colitis med overdreven vægttab, diarré og tarmblødning. Efter syv dage med DSS administration, histologisk analyse af tyktarmen sektioner afslører en mere forværret vævsskader inden for proksimale, midterste og distale koloner af knockout mus, i forhold til deres wildtype kolleger. Denne overdreven immunaktivering fører til induktion af colitis med en robust infiltration af forskellige inflammatoriske celler i knockout dyrekolonien som observeret ved immunohistokemisk analyse.Yderligere, kvantitativ PCR analyse viser højere niveauer af TNF alpha og inferon gamma udtryk, men lavere udtryk for IL-5, 10, og 13, i knockout sammenlignet med wildtype mus kolon uden forskel i TGF beta et udtryk observeret. Mens du forsøger denne procedure, Det er vigtigt at huske at optimere tekstoret southvater natrium dosering og demonstration varighed. Videresendelse af denne procedure, anden metode som at opnå kultur kan udføres for at forstå yderligere spørgsmål som effekten af betændelse i tarmvæv originering.Efter det udvikling, denne teknik baner en måde for forskere inden for tarmbetændelse at udforske bidrag af genmutationer til sværhedsgraden af biodisease eroderer og andre hvirveldyr. Glem ikke, at arbejde med sygdom tarmvæv og dens indhold kan være yderst farligt, og konsekvenserne såsom iført ting, der er passende, personlig beskyttelse permanent bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut (Video) | JoVE

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation (Video) | JoVE

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites (Video) | JoVE

En mus Model for Patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein (Video) | JoVE

Co-immunoudfældning af musen Mx1 Protein med influenza A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen (Video) | JoVE

En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data (Video) | JoVE

Kortikal Actin Flow i T-celler kvantificeret ved Spatio-temporale billede Korrelation spektroskopi af Struktureret Illumination Microscopy data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model (Video) | JoVE

Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells (Video) | JoVE

Præcision-cut muselunge Skiver at visualisere Levende Pulmonal dendritiske celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses (Video) | JoVE

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsigtet overvågning af inflammatoriske reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...