Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation de Sciences naturelles nationales de la Chine (81671016, 31471008 et 31661143030) et le National Institutes of Health (DC010012, DC015819) et par la Fondation d’éléments.

Toutes les expériences portant sur des souris ont été examinées et approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation comités de l’Université de Zhejiang. Il est conseillé de porter des équipements de protection individuelle appropriés avant d’effectuer ce protocole.
1. préparation des souris et DSS
<ol><li>Garder la souris (α-gustducin- / -) et âge, sexe et témoins de type sauvage de même poids de corps (α-gustducin+ / +) souris C57BL/6 indi...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement déterminer l’effet de mutations des gènes gustatives spécifiques sur l’inflammation dans un modèle murin d’EIA induite par le DSS. Pour tirer pleinement parti, induction optimale des MICI est une étape clé. Le développement de la colite est affecté par plusieurs facteurs, dont la souche de souris, habitat, la microflore intestinale, ainsi que les gènes d’intérêt. Il est recommandé d’effectuer une expérience pilote avec un petit nombre de sou...

Les deux principales formes de la maladie intestinale inflammatoire (MII), maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) sont caractérisés par rémittentes ou progressives inflammatoires chroniques de l’intestin avec étiologie multifactorielle1,2 . Le développement des MICI dépend de la génétiques ainsi que certains facteurs environnementaux comme l’alimentation, l’utilisation des antibiotiques et surtout, les infections pathogènes. Toutefois, l’étiologie et la réglementation mécanismes moléculaires de l’IBD sont encore peu claires. Par conséquent, nombreux modèles animaux induites chimiquement de DCI ont été construits et appliquées pour délimiter la pathogenèse et les mécanismes de régulation et d’évaluer l’efficacité de la thérapeutique humaine3.
Récepteurs gustatifs sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et sont classées dans deux grands types : type I (T1Rs), et type II (T2Rs) qui détectent les composés amers, sucrée et umami. Cascades de signalisation de goût sont initiées par tastant T1Rs ou T2Rs, activant la heterotrimeric G protéines liantes consistant α-gustducin et un dimère Gβγ et conduisant à la libération des sous-unités Gβγ. La portion Gβγ stimule à son tour l’effecteur enzyme phospholipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 activés puis hydrolyse le phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate en deux messagers secondaires intracellulaires [l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) et le diacylglycérol] et IP3 se lie à et ouvrir son canal-récepteur IP3 R3, libérant des ions de calcium du réticulum endoplasmique. Cela conduit finalement à l’ouverture du canal ionique potentiel de récepteur transitoire Trpm5 et la libération de l’ATP de neurotransmetteur sur les nerfs gustatifs4,5,6,7. Pourtant, les voies de signalisation de goût aigre et salé sont différentes et indépendantes du sucré, umami et amertume8. En outre, les composants du goût RCPG et aval protéines existent dans divers tissus extra-orale. Des études récentes ont indiqué que α-gustducin, la principale composante de la signalisation de goût, se trouve à s’exprimer dans la muqueuse intestinale. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les fonctions de ces goût signalisation composants en tissus extra-orale9,10.
La méthode décrite ici est utilisée pour caractériser les fonctions des protéines signalisation gustatives exprimées dans les tissus extra-orale. Nous combinons une lignée de souris transgéniques développée pour délimiter des cascades de signalisation dans les papilles avec le modèle de colite induite chimiquement. En grande partie en raison de sa simplicité procédurale et similitudes pathologiques à la colite ulcéreuse humaine, le dextran sulfate de sodium (DSS)-induite DCI modèle a été utilisé plus largement parmi les divers colite induite chimiquement modèles11. Dans cette étude, nous avons utilisé des α-gustducin-deficient mice comme une lignée de souris représentant pour révéler les nouvelles fonctions des α-gustducin en immunité mucosale intestinale et l’inflammation en 1) analysant les changements morphologiques dans les tissus et 2) analyse les différences dans l’expression de cytokines liées à l’inflammation du côlon. Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement et qualitativement déterminer la contribution des protéines de signalisation gustatifs (et autres protéines exprimées dans le tube digestif) à des lésions tissulaires et de l’inflammation intestinale, quand les lignes pour les gènes de souris génétiquement modifiée intérêt sont disponibles. Avantages de cette méthode permettent aux utilisateurs d’obtenir des données intégrées résultant d’actions de la DSS chimique et la déficience du gène d’intérêt. Cette méthode peut encore être améliorée pour augmenter sa sensibilité et de révéler des changements subtils intestinaux au niveau cellulaire et moléculaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

Maladies inflammatoires de l’intestin (MII) est l’un des troubles gastro-intestinaux liées, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, qui affecte la qualité de vie de millions de personnes dans le monde. Les symptômes de l’IBD comprennent des douleurs abdominales, la diarrhée et des saignements rectaux, pouvant résulter de l’interaction entre microbiote intestinal, des composants alimentaires, les cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Il est particulièrement important d’évaluer comment chaque gène clé exprimé dans les cellules épithéliales et immunitaires intestinales affecte l’inflammation du côlon. Les récepteurs de goût couplés aux protéines G, y compris G protéine sous-unité α-gustducin et autres protéines de signalisation, ont été trouvés dans les intestins. Ici, nous utilisons des α-gustducin en tant que représentant et décrire un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induite par le modèle DCI pour évaluer l’effet des mutations du gène gustatif sur immunité mucosale intestinale et l’inflammation. Cette méthode combine la technologie génique knockout avec le modèle DCI induit chimiquement et ainsi peut être appliquée pour évaluer le résultat de l’annulation par le gène gustatif, mais aussi les autres gènes qui peuvent exuberate ou humidifier la réponse immunitaire induite par le DSS dans le côlon. Des souris mutantes sont administrés avec DSS pendant une certaine période au cours de laquelle leur poids corporel, selles et saignements rectaux sont surveillés et enregistrés. À différents intervalles au cours de l’administration, certaines souris sont euthanasiés, puis les dimensions et le poids de leurs spleens et deux-points sont mesurés et les tissus de l’intestin sont collectées et traitées pour histologique et analyses d’expression génique. Les données montrent que les résultats de knockout α-gustducin en perte de poids excessive, diarrhée, hémorragies intestinales, des lésions tissulaires et inflammation vs sauvage souris. Puisque la gravité de l’inflammation induite est affectée par les souches de souris, habitat et l’alimentation, l’optimisation de la durée de concentration et de l’administration DSS dans une expérience pilote est particulièrement importante. En réglant ces facteurs, cette méthode peut être appliquée afin d’évaluer les effets anti - et pro-inflammatoires.

Une procédure IBD induite par le DSS a été créée par administrer 3 % DSS dans l’eau potable à le α-gustducin-knockout (KO) et les souris de type sauvage (WT). Par rapport aux souris WT, les souris génétiquement déficientes exposé plus des colites avec perte de poids excessive, diarrhée et des saignements intestinaux (Figure 1). Après une administration de DSS de 7 jours, les différences dans l’intégrité des tissus ont été analysés en ut...

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Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Nous présentons ici un protocole pour étudier l’effet de l’invalidation des gènes reliés à la gustation sur les réponses immunitaires dans un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induit le modèle de souris de maladie inflammatoire de l’intestin.

Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine inflammatoire de la biodisease au sujet de la colite ulcéreuse et de la maladie de Crohn. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour évaluer les premiers effets anti et proinfammatoires des protéines de signalisation. L’implication de cette technique prolonge l’étude du gaz dans de nouvelles avancées et l’inflammation.Bien que cette méthode peut fournir un aperçu de l’effet génétique sur l’inflammation intestinale. Il peut également être appliqué à d’autres facteurs tels que les régimes alimentaires et le microbiome. En général, les personnes nouvelles à ce semestre auront du mal parce que le traitement des tissus cicatriciels de la maladie est délicat.La démonstration visuelle de cette méthode est critique car la dissection et les étapes de préparation de tissu sont difficiles à apprendre parce que mystalia et les structures de tissu cellulaire peuvent être modifiées. Pour induire le sodium de sulfate de dextran, ou colite de DDS, remplacez l’eau potable régulière par la solution de 3%DSS, ajoutez le libidium pendant sept jours. Mesurer le poids corporel de chaque souris, la consommation de solutions DSS et la production quotidienne de selles.À la fin du traitement de sept jours, placez la souris dans la position supine et utilisez de petits ciseaux pour faire une incision médiane de trois centimètres de long dans l’abdomen. Récoltez la rate et mesurez sa taille. Ensuite, utilisez des forceps pour soulever le côlon pour lui permettre d’être séparé de la mesenterie environnante.Et extraire le côlon entier jusqu’à ce que le cecum et le rectum soient visibles. Transecter le tissu à la marge colonosque. Et profondément dans le bassin pour libérer le côlon proximal et distal, respectivement.Mesurer et enregistrer la longueur du côlon isolé. Et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de gavage pour rincer le côlon avec 10 millilitres de PBS glacé pour enlever les excréments et le sang jusqu’à ce que l’illuate s’éclaircisse. Pour l’identification histologique, divisez les échantillons de tissu en sections proximales, moyennes et distales de taille égale.Et fixer les tissus en 4%paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine du tissu du côlon isolé, le lendemain matin, submergez les morceaux de tissu dans 30% saccharose et PBS pendant la nuit dans des tubes individuels de 15 millilitres pour la protection cryo des échantillons. Le lendemain, intégrer les tissus dans une température optimale de coupe ou composé OCT.Et refroidir les tissus en moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que l’OCT durcit. Placez les blocs OCT dans le cryostat et réglez le cadran d’épaisseur à 12 micromètres. Tranchez et recueillez ensuite 12 sections gelées épaisses de micromètre sur des glissières de microscope en verre.Lorsque tous les tissus ont été sectionnés, réchauffer les toboggans à 65 degrés Celsius sur une plaque chaude pendant 20 minutes. Et laver brièvement les sections chauffées dans de l’eau distillée avant de les souiner avec une solution de coloration à l’hématoxyline pendant cinq minutes. Retirer l’excès de solution d’hématoxyline et courir dans l’eau du robinet pendant cinq minutes.Et différencier les sections avec 0,5% d’acide chlorhydrique dans l’éthanol pendant 30 secondes, suivie d’un rinçage d’une minute sous l’eau courante du robinet. Ensuite, lavez les échantillons pendant une minute dans PBS. Suivi d’un autre lavage de cinq minutes sous l’eau courante du robinet.À la fin du lavage, submerger les tissus dans une série ascendante d’éthanol pendant 10 secondes par immersion. Suivi d’une contre-tache dans l’éosine pendant deux minutes. Pour la déshydratation des échantillons, submergez les glissières dans 95 % d’éthanol et deux changements de 100 % d’éthanol pendant cinq minutes par immersion.Suivi d’une compensation avec deux changements de cinq minutes en xylène. Ensuite, marquer les lésions tissulaires aux colons proximaux, moyens et distals de chaque groupe expérimental. Pour l’analyse immunohistochimique, après avoir réchauffé les sections pendant 20 minutes sur la plaque chauffante, lavez les glissières trois fois en PBS pendant 10 minutes par lavage.Et éliminer la peroxyde endogène avec une incubation de peroxyde d’hydrogène de 10 minutes 3%. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons trois fois dans PBS comme démontré et bloquez toute liaison non spécifique avec tampon de blocage pendant au moins une heure à température ambiante. Ensuite, remplacez le tampon de blocage par le cocktail d’anticorps primaire d’intérêt.Pour une incubation d’une nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain matin, aspirez la solution d’anticorps primaire excédentaire et lavez les glissières trois fois dans PBS. Après le dernier lavage, incuber les toboggans avec le cocktail d’anticorps secondaire biotinylé approprié.Suivi de l’étiquetage avec streptavidin horseradish peroxidase complexe à température ambiante. Pour visualiser les cellules immunoréactives, étiquetez les échantillons avec DAB jusqu’à ce qu’une couleur brun clair ou foncé se développe. Et contrestain les sections avec de l’hématoxyline et de l’ammoniac dilué à 0,3%.Lorsque les glissières ont séché, utilisez un microscope léger pour obtenir des images de champ lumineux des sections tissulaires sous un grossissement de 10 x. Et utiliser un programme de traitement d’image pour identifier et quantifier la population des cellules immunitaires marquées à la fois dans l’épithélium et le propria lamina. Pour l’analyse de l’expression génétique dans les colons traités par le DSS, extraire l’ARN de moins 80 degrés Celsius a décongelé des échantillons de tissus du côlon selon les protocoles standard d’extraction de l’ARN.Et mélanger un microgramme avec l’ARN total avec 2,5 microlitres de 20 millimolaire oligo deoxythymidine 12 à 18 amorces et un microlitre de moloney murine virus inverse transcriptase. Après une incubation de 60 minutes à 42 degrés Celsius, mélanger un microlitre de l’ADNC avec 0,5 % de microlitres des amorces PCR quantitatives appropriées et inversées pour les cytokines d’intérêt et le colorant vert fluorescent 2x. Exécutez ensuite le PCR quantitatif sous les paramètres appropriés et calculez l’expression relative du gène selon les protocoles standard.Comparées aux souris de wildtype, les souris de KO d’alpha gustducin montrent une colite plus grave avec la perte excessive de poids, la diarrhée et le saignement intestinal. Après sept jours de l’administration de DSS, l’analyse histologique des sections de deux points révèlent des dommages plus aggravés de tissu dans les colons proximaux, moyens, et distal des souris de KO, comparées à leurs pendants de wildtype. Cette activation immunitaire excessive conduit à l’induction de la colite avec une infiltration robuste de diverses cellules inflammatoires dans le côlon animal à élimination directe comme observé par l’analyse immunohistochimique.En outre, l’analyse quantitative de PCR démontre des niveaux plus élevés de TNF alpha et d’expression gamma d’inférence mais expression inférieure d’IL-5, 10, et 13, dans ko comparé aux colons de souris de wildtype sans différence dans TGF bêta une expression observée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser la dose textoreuse de sodium southvater et la durée de démonstration. Transmettre cette procédure, d’autres méthodes comme l’obtention de la culture peuvent être effectuées afin de comprendre des questions supplémentaires comme l’effet de l’inflammation dans l’origine des tissus intestinaux.Après son développement, cette technique ouvre la voie à des chercheurs dans le domaine de l’inflammation intestinale pour explorer les contributions des mutations génétiques à la gravité des érosions de biodisease et d’autres vertébrés. N’oubliez pas que travailler avec les tissus intestinaux de la maladie et son contenu peut être extrêmement dangereux et les répercussions telles que le port de choses qui sont appropriées, la protection personnelle permanente doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.

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