Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
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यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७१०१६, ३१४७१००८, और ३१६६११४३०३०) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DC010012, DC015819) और Siyuan फाउंडेशन द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित है ।

सभी प्रयोगों चूहों शामिल की समीक्षा की और झेजियांग विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया । यह इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन से पहले उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक ...

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	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

इस विधि quantitively एक DSS प्रेरित आईबीडी माउस मॉडल में सूजन पर विशिष्ट gustatory जीन के उत्परिवर्तन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । पूरा लाभ लेने के लिए, आईबीडी की इष्टतम प्रेरण एक महत्वपू?...

सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), Crohn की बीमारी (सीडी), और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) के दो प्रमुख रूपों जीर्ण remittent या multifactorial एटियलजि1,2 के साथ आंत के प्रगतिशील भड़काऊ स्थितियों की विशेषता है . आईबीडी के विकास पर निर्भर करता है आनुवंशिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ पर्यावरणीय कारकों जैसे आहार, एंटीबायोटिक का उपयोग करें, और महत्वपूर्ण बात, रोगजनक संक्रमण । हालांकि, एटियलजि और विनियामक आणविक तंत्र अंतर्निहित आईबीडी अभी भी अस्पष्ट हैं । इसलिए, कई रासायनिक प्रेरित आईबीडी पशु मॉडल का निर्माण किया गया है और रोगजनन और विनियामक तंत्र चित्रित और मानव चिकित्सकीय3की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए लागू होता है ।
स्वाद रिसेप्टर्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) कर रहे हैं और दो प्रमुख प्रकार के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं: प्रकार मैं (T1Rs), और प्रकार द्वितीय (T2Rs) कि मिठाई, उमामी, और कड़वा यौगिकों का पता लगाने. स्वाद संकेतन कैस्केडिंग tastant बाइंडिंग से T1Rs या T2Rs के द्वारा आरंभ किए जाते हैं, जो α-gustducin और एक Gβγ डिमर से मिलकर heterotrimeric G प्रोटीन को सक्रिय करते हैं और Gβγ उपइकाईयों को रिलीज़ करने के लिए अग्रणी होते हैं । बारी में Gβγ moiety बहाव प्रभाव एंजाइम phospholipase सी-β2 (पीएलसी-β2) को उत्तेजित करता है । सक्रिय पीएलसी-β2 तो hydrolyzes phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate दो intracellular माध्यमिक दूतों में [inositol-1, 4, 5-trisphosphate (आईपी3) और diacylglycerol], और आईपी3 बांध और अपने चैनल रिसेप्टर आईपी3 खोलने R3, endoplasmic जालिका से कैल्शियम आयनों जारी. यह अंततः क्षणिक रिसेप्टर संभावित आयन चैनल Trpm5 और gustatory नसों4,5,6,7पर न्यूरोट्रांसमीटर एटीपी के रिलीज के उद्घाटन की ओर जाता है. फिर भी, नमकीन और खट्टे स्वाद के संकेत रास्ते अलग और मिठाई, उमामी, और कड़वा8स्वाद से स्वतंत्र हैं । इसके अलावा, स्वाद GPCRs और बहाव प्रोटीन के घटक विभिंन अतिरिक्त मौखिक ऊतकों में मौजूद हैं । हाल के अध्ययनों से संकेत दिया कि α-gustducin, स्वाद संकेतन के प्रमुख घटक, आंतों की श्लेष्मा झिल्ली में व्यक्त किया जा पाया है । आगे के अध्ययन के लिए अतिरिक्त मौखिक ऊतकों9,10में इन स्वाद संकेत घटक के कार्यों को समझने की जरूरत है ।
विधि यहां वर्णित gustatory संकेत प्रोटीन अतिरिक्त मौखिक ऊतकों में व्यक्त की कार्यों की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है । हम रासायनिक प्रेरित कोलाइटिस मॉडल के साथ स्वाद कलियों में delineating संकेतन झरने के लिए विकसित एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन गठबंधन । मोटे तौर पर मानव अल्सरेटिव कोलाइटिस के लिए अपनी प्रक्रियात्मक सादगी और रोग समानता के कारण, dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित आईबीडी मॉडल सबसे व्यापक रूप से विभिन्न रासायनिक प्रेरित कोलाइटिस मॉडल11के बीच किया गया है । इस अध्ययन में, हम α-gustducin की कमी चूहों एक प्रतिनिधि माउस लाइन α के उपंयास कार्य-gustducin आंत श्लैष्मिक प्रतिरक्षा और सूजन में 1 से प्रकट करने के रूप में इस्तेमाल किया) ऊतक और 2 में रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण) की अभिव्यक्ति में मतभेदों को परख साइटोकिंस बृहदांत्र में सूजन से संबंधित है । इस विधि को मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से gustatory संकेतन प्रोटीन के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (और अंय प्रोटीन आंत में व्यक्त) ऊतक क्षति और आंत्र सूजन के लिए, जब आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के जीन के लिए ब्याज उपलब्ध हैं । इस विधि के लाभ उपयोगकर्ताओं को एकीकृत दोनों रासायनिक DSS और ब्याज की जीन की कमी की क्रियाओं से जिसके परिणामस्वरूप डेटा प्राप्त करने के लिए सक्षम हैं । इस विधि को अपनी संवेदनशीलता बढ़ाने और सेलुलर और आणविक स्तर पर सूक्ष्म आंत्र परिवर्तन प्रकट करने के लिए आगे सुधार किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) अल्सरेटिव कोलाइटिस और Crohn रोग, कि दुनिया भर में लाखों लोगों के जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करता है सहित प्रतिरक्षा संबंधी जठरांत्र विकारों में से एक है । आईबीडी लक्षण पेट में दर्द, दस्त, और मलाशय से खून बह रहा है, जो आंत microbiota, खाद्य घटकों, आंत्र उपकला कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत से परिणाम हो सकता शामिल हैं । यह विशेष महत्व का आकलन करने के लिए कैसे प्रत्येक कुंजी जीन आंतों उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त की बृहदांत्र में सूजन को प्रभावित करता है । जी प्रोटीन-युग्मित स्वाद रिसेप्टर्स, सहित जी प्रोटीन उपइकाई α-gustducin और अन्य संकेतन प्रोटीन, आंतों में पाया गया है. यहां, हम एक प्रतिनिधि के रूप में α-gustducin का उपयोग करें और एक dextran सल्फेट सोडियम का वर्णन (DSS)-प्रेरित आईबीडी मॉडल आंत gustatory प्रतिरक्षा और सूजन पर श्लैष्मिक जीन उत्परिवर्तनों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए । इस विधि रासायनिक प्रेरित आईबीडी मॉडल के साथ जीन नॉकआउट प्रौद्योगिकी को जोड़ती है, और इस प्रकार के लिए gustatory जीन nsa के परिणाम का आकलन के रूप में अच्छी तरह से अंय जीन है कि exuberate या DSS-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पेट में गीला हो सकता है लागू किया जा सकता है । उत्परिवर्ती चूहों के दौरान एक निश्चित अवधि के लिए DSS के साथ प्रशासित कर रहे हैं, जो उनके शरीर के वजन, मल, और मलाशय से खून बह रहा निगरानी और दर्ज की गई. प्रशासन के दौरान अलग timepoints पर, कुछ चूहों euthanized हैं, तो आकार और उनकी तिल्ली और बृहदांत्र के वजन मापा जाता है और आंत के ऊतकों को एकत्र कर रहे हैं और ऊतकवैज्ञानिक और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए संसाधित. डेटा दिखाने के लिए कि α-gustducin नॉकआउट परिणाम अत्यधिक वजन घटाने, दस्त, आंत्र रक्तस्राव, ऊतक क्षति, और सूजन बनाम जंगली प्रकार चूहों । के बाद से प्रेरित सूजन की गंभीरता माउस उपभेदों, आवास पर्यावरण, और आहार, एक प्रायोगिक प्रयोग में DSS एकाग्रता और प्रशासन की अवधि के अनुकूलन से प्रभावित है विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इन कारकों का समायोजन करके, इस विधि दोनों विरोधी और समर्थक भड़काऊ प्रभाव का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

एक DSS प्रेरित आईबीडी प्रक्रिया एडमिनिस्ट्रेटिंग 3% DSS पीने के पानी में α-gustducin-पीटकर (KO) और जंगली प्रकार (WT) चूहों द्वारा स्थापित किया गया था । WT चूहों की तुलना में, नॉकआउट चूहों अत्यधिक वजन घटाने, द?...

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Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

यहां हम एक dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) माउस मॉडल में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर झोंका संबंधित जीन के nsa के प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

एक भड़काऊ आंत्र रोग माउस मॉडल में आंत सूजन पर संकेत प्रोटीन समाप्त होने के स्वाद के प्रभाव

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

यह विधि अल्सर कोलाइटिस और क्रोन की बीमारी के बारे में भड़काऊ बायोडाइजीज क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग प्रोटीन को संकेत देने के पहले विरोधी और प्रोइनफेमेटरी प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का निहितार्थ नई प्रगति और सूजन में गैस के सर्वेक्षण का विस्तार करता है।हालांकि इस विधि आंत सूजन पर आनुवंशिक प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इसे आहार और माइक्रोबायोम जैसे अन्य कारकों पर भी लागू किया जा सकता है। आम तौर पर, इस सेमेस्टर के लिए नए व्यक्तियों संघर्ष क्योंकि प्रसंस्करण रोग निशान ऊतक मुश्किल है संघर्ष करेंगे ।विच्छेदन के रूप में इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है और ऊतक तैयारी के कदम सीखना मुश्किल है क्योंकि मास्टालिया और सेल ऊतक संरचनाओं को बदला जा सकता है। डेक्सट्रान सल्फेट सोडियम, या डीडीएस कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए, नियमित पेयजल को 3% डीएसएस समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें, सात दिनों के लिए लिबिडियम जोड़ें। प्रत्येक माउस के शरीर के वजन, डीएसएस समाधान खपत, और मल उत्पादन को मापने दैनिक।सात दिन के उपचार के अंत में, माउस को रीढ़ की स्थिति में रखें और पेट में तीन सेंटीमीटर लंबे मिडलाइन चीरा लगाने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें। तिल्ली की कटाई करें और इसके आकार को मापें। फिर पेट को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि इसे आसपास के मेसेंट्री से अलग किया जा सके।और पूरे कोलन को तब तक निकालें जब तक कि सीकम और मलाशय दिखाई न दे। कोलोनोसेकल मार्जिन पर ऊतक को पार करें। और श्रोणि के भीतर गहरी क्रमशः समीपस्थ और डिस्टल कोलन को मुक्त करने के लिए।पृथक पेट की लंबाई को मापें और रिकॉर्ड करें। और एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें एक gavage सुई से लैस बर्फ ठंड PBS के 10 मिलीलीटर के साथ पेट फ्लश करने के लिए मल और रक्त को हटाने के लिए जब तक illuate स्पष्ट चलाता है । हिस्टोलॉजिकल पहचान के लिए, ऊतक के नमूनों को समान रूप से आकार के समीपस्थ, मध्य और डिस्टल वर्गों में विभाजित करें।और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतकों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। अलग पेट के ऊतकों के हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन धुंधला के लिए, अगली सुबह, नमूनों के क्रायो संरक्षण के लिए व्यक्तिगत 15 मिलीलीटर ट्यूबों में रात भर 30% सुक्रोज और पीबीएस में ऊतक के टुकड़ों को जलमग्न कर देते हैं। अगले दिन, ऊतकों को इष्टतम काटने के तापमान या OCT यौगिक में एम्बेड करें।और शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस में ऊतकों को ठंडा करें जब तक कि अक्टूबर कठोर न हो जाए। रोयोस्टेट में अक्टूबर ब्लॉक रखें और मोटाई डायल को 12 माइक्रोमीटर पर सेट करें। फिर कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 12 माइक्रोमीटर मोटी जमे हुए वर्गों को टुकड़ा और एकत्र करें।जब सभी ऊतकों को खंडित किया गया है, तो स्लाइड को 20 मिनट के लिए गर्म प्लेट पर 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। और पांच मिनट के लिए हेमटॉक्सीलिन धुंधला समाधान के साथ धुंधला करने से पहले आसुत पानी में गर्म वर्गों संक्षेप में धो लें। अतिरिक्त हेमेटॉक्सीलिन समाधान निकालें और पांच मिनट के लिए नल के पानी में चलाएं।और 30 सेकंड के लिए इथेनॉल में 0.5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ वर्गों में अंतर करें, इसके बाद चलने वाले नल के पानी के नीचे एक मिनट कुल्ला करें। इसके बाद, पीबीएस में एक मिनट के लिए नमूनों को धोएं। इसके बाद चल रहे नल के पानी के नीचे एक और पांच मिनट की धुलाई की ।धोने के अंत में, विसर्जन प्रति 10 सेकंड के लिए एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला में ऊतकों को जलमग्न करें। इसके बाद दो मिनट तक ईओसिन में काउंटरटेनिंग की। नमूनों के निर्जलीकरण के लिए, 95% इथेनॉल में स्लाइड जलमग्न और प्रति विसर्जन पांच मिनट के लिए 100% इथेनॉल के दो परिवर्तन।जाइलीन में दो, पांच मिनट के बदलाव के साथ समाशोधन के बाद । फिर प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के समीपस्थ, मध्य और डिस्टल कोलन के ऊतक क्षति को स्कोर करें। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए, गर्म प्लेट पर 20 मिनट के लिए वर्गों वार्मिंग के बाद, प्रति धोने 10 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड धोएं ।और 10 मिनट 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड इनक्यूबेशन के साथ अंतर्जात पेरोक्सिडेस को खत्म करें। इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस में तीन बार नमूनों को धोएं और कमरे के तापमान पर कम से कम एक घंटे के लिए बफर को अवरुद्ध करने के साथ किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करें। फिर, ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ अवरुद्ध बफर की जगह।एक रात के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन । अगली सुबह, अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस में तीन बार स्लाइड धोएं। अंतिम धोने के बाद, उपयुक्त बायोटिनेलेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें।कमरे के तापमान पर स्ट्रेप्टाविडिन सहिजन पेरोक्सिडेस परिसर के साथ लेबलिंग के बाद। इम्यूनोरेएक्टिव कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, नमूनों को डीएबी के साथ तब तक लेबल करें जब तक कि हल्का या गहरा भूरा रंग विकसित न हो जाए। और हेमेटॉक्सीलिन और 0.3% पतला अमोनिया के साथ वर्गों को काउंटर्स करें।जब स्लाइड सूख गए हैं, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए एक 10x आवर्धन के तहत ऊतक वर्गों के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को प्राप्त करने के लिए । और एपिथेलियम और लैमिना प्रोप्रिया दोनों में चिह्नित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आबादी की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करें। डीएसएस इलाज कोलन में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, मानक आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुसार शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस गल कोलोनिक ऊतक नमूनों से आरएनए निकालें।और 20 मिलीमोलर ओलिगो डिऑक्सिथिमिडीन 12 के माध्यम से 18 प्राइमर और मोलोनी मुरीन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस के एक माइक्रोलीटर के २.५ माइक्रोलीटर के साथ कुल आरएनए के साथ एक माइक्रोग्राम मिलाएं । 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 60 मिनट के बाद, ब्याज और 2x फ्लोरोसेंट ग्रीन डाई के साइटोकिन्स के लिए उपयुक्त फॉरवर्ड और रिवर्स मात्रात्मक पीसीआर प्राइमर के 0.5% माइक्रोलीटर के साथ सीडीएनए के एक माइक्रोलीटर मिलाएं। फिर उचित मापदंडों के तहत मात्रात्मक पीसीआर चलाएं और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना करें।वाइल्डटाइप चूहों की तुलना में, अल्फा गुस्डसिन नॉकआउट चूहों अत्यधिक वजन घटाने, दस्त और आंतों के रक्तस्राव के साथ एक अधिक गंभीर कोलाइटिस का प्रदर्शन करते हैं। डीएसएस प्रशासन के सात दिनों के बाद, पेट के वर्गों के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से उनके वाइल्डटाइप समकक्षों की तुलना में नॉकआउट चूहों के समीपस्थ, मध्य और डिस्टल कोलन के भीतर अधिक बढ़ रहे ऊतक क्षति का पता चलता है। यह अत्यधिक प्रतिरक्षा सक्रियण नॉकआउट पशु पेट में विभिन्न भड़काऊ कोशिकाओं की मजबूत घुसपैठ के साथ कोलाइटिस को शामिल करने की ओर जाता है जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा मनाया जाता है।इसके अलावा, मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण टीएनएफ अल्फा और इनफेरन गामा अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को दर्शाता है, लेकिन टीजीएफ बीटा एक अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं होने के साथ वाइल्डटाइप माउस कोलन की तुलना में नॉकआउट में आईएल-5, 10 और 13 की कम अभिव्यक्ति। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, टेक्स्टरस साउवेटर सोडियम खुराक और प्रदर्शन अवधि को अनुकूलित करना याद रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया को अग्रेषित करना, आंतों के ऊतक उत्पत्ति में सूजन के प्रभाव जैसे अतिरिक्त प्रश्नों को समझने के लिए संस्कृति प्राप्त करने जैसी अन्य विधि का प्रदर्शन किया जा सकता है।इसके विकास के बाद, यह तकनीक आंत सूजन के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए बायोडाइजीज खिसक और अन्य कशेरुकी की गंभीरता के लिए जीन म्यूटेशन के योगदान का पता लगाने के लिए एक रास्ता प्रशस्त करती है। यह न भूलें कि रोग आंत ऊतक और इसकी सामग्री के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को पूरा करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा स्थायी चीजें पहनने जैसे दुष्परिणाम हमेशा लिए जाने चाहिए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

माउस बृहदांत्रशोथ में इम्यून और गैर प्रतिरक्षा कोशिकाओं से अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण द्वारा जीन एक्सप्रेशन के कार्यात्मक भूमिका फर्क

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छोटे अणुओं मिलाना सी-di-जीएमपी में संकेत है कि जांच के लिए एक उच्च throughput सेटअप की स्थापना<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

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Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

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Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

प्रेसिजन कटौती माउस फेफड़े स्लाइस लाइव फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं कल्पना करने के लिए

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An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

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Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...