Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni da parte del National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 e 31661143030) e il National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e dalla Fondazione Siyuan.

Tutti gli esperimenti coinvolgenti topi sono stati esaminati e approvati dal istituzionale Animal Care e comitati di uso dell'Università di Zhejiang. Si consiglia di indossare adeguati dispositivi di protezione personali prima di eseguire questo protocollo.
1. preparazione di topi e DSS
<ol><li>Tenere i topi knockout (α-gustducin- / -) ed età - sesso- e controllo di selvaggio-tipo di pari peso di corpo (α-gustducin+ +) topi C57BL/6 singolarmente in gabbie pulite.<br...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Questo metodo può essere impiegato per quantità determinare l'effetto delle mutazioni di specifici geni gustativi su infiammazione in un modello murino IBD indotta da DSS. Per sfruttare al meglio, induzione ottimale di IBD è un passo fondamentale. Lo sviluppo di colite è influenzato da diversi fattori, tra cui topo, housing ambiente, microflora intestinale, così come i geni di interesse. Si consiglia di eseguire un esperimento pilota con un piccolo numero di topi per testare diversi dosaggi e durate di amministrazio...

Le due forme principali di malattia infiammatoria intestinale (IBD), morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) sono caratterizzate da condizioni infiammatorie croniche remittente o progressive dell'intestino con eziologia multifattoriale1,2 . Lo sviluppo delle IBD dipende dalla genetici, nonché determinati fattori ambientali quali dieta, uso di antibiotici e soprattutto, infezioni da patogeni. Tuttavia, l'eziologia e la regolamentazione dei meccanismi molecolari implicati IBD sono ancora poco chiari. Da qui, numerosi modelli animali chimicamente indotte di IBD sono stati costruiti e applicati per delineare la patogenesi e meccanismi di regolamentazione e valutare l'efficacia terapeutica umana3.
Recettori del gusto sono recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e sono classificati come due tipi principali: (T1Rs), tipo I e II (T2Rs) che consentono di rilevare composti amari, dolce e umami. Cascate di segnalazione del gusto vengono avviate da tastant T1Rs o T2Rs, attivando l'eterotrimerica G proteine leganti composto α-gustducin e un dimero Gβγ e che porta al rilascio delle subunità Gβγ. La frazione Gβγ a sua volta stimola l'effettore a valle dell'enzima fosfolipasi C-β2 (PLC-β2). Attivato PLC-β2 quindi idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisphosphate in due messaggeri intracellulari secondarie [inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo] e IP3 si lega a e aprire il suo canale-ricevitore IP3 R3, rilasciando ioni calcio dal reticolo endoplasmatico. Questo conduce infine all'apertura del canale di ioni potenziale transitorio del ricevitore Trpm5 e rilascio del neurotrasmettitore ATP sui nervi gustativo4,5,6,7. Ancora, le vie di segnalazione del gusto salato ed acido sono diversi e indipendenti da sapori amari8, dolce e umami. Inoltre, i componenti di gusto GPCR e proteine a valle esistono in vari tessuti extra-orali. Recenti studi hanno indicato quello α-gustducin, il componente principale del gusto di segnalazione, è trovato per essere espresso nella mucosa intestinale. Ulteriori studi sono necessari per comprendere le funzioni di questi gusto segnalazione componenti in tessuti extra-orali9,10.
Il metodo qui descritto è usato per caratterizzare le funzioni delle proteine di segnalazione gustative espresse in tessuti extra-orali. Uniamo una linea di topi transgenici sviluppata per la delineazione di Cascate di segnalazione in papille gustative con il modello di colite indotta chimicamente. In gran parte grazie alla sua semplicità procedurale e patologiche somiglianze alla colite ulcerosa umana, il Destrano solfato di sodio (DSS)-indotto IBD modello è stato più ampiamente utilizzato tra i vari modelli colite indotta chimicamente11. In questo studio, abbiamo usato i topi α-gustducin-carente come una linea di rappresentante del mouse per rivelare nuove funzioni di α-gustducin immunità mucosa dell'intestino e infiammazione 1) analizzando i cambiamenti morfologici nel tessuto e 2) analizzando le differenze nell'espressione di citochine legate alla infiammazione del colon. Questo metodo può essere utilizzato per determinare quantitativamente e qualitativamente i contributi di proteine di segnalazione gustativi (e altre proteine espresse nell'intestino), a danno di tessuto e l'infiammazione intestinale, quando topi geneticamente modificati per linee per i geni di interesse sono disponibili. Vantaggi di questo metodo sono consentendo agli utenti di ottenere integrata dei dati derivanti dalle azioni del DSS chimica e deficit del gene di interesse. Questo metodo può essere ulteriormente migliorato per aumentare la sua sensibilità e rivelare i cambiamenti sottili intestinali a livello cellulare e molecolare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

Malattia infiammatoria intestinale (IBD) è uno dei disturbi gastrointestinali immuno-correlati, tra cui la colite ulcerosa e morbo di Crohn, che incide sulla qualità di vita di milioni di persone in tutto il mondo. IBD sintomi includono dolore addominale, diarrea e sanguinamento rettale, che possono derivare da interazioni tra microbiota dell'intestino, componenti alimentari, cellule epiteliali intestinali e le cellule immunitarie. È di particolare importanza per valutare come ogni gene chiave espressa in cellule epiteliali ed immune intestinale colpisce l'infiammazione del colon. Recettori del gusto accoppiati a proteine G, tra cui G proteina subunità α-gustducin e altre proteine di segnalazione, sono stati trovati nell'intestino. Qui, usiamo α-gustducin come rappresentante e descrivere un sodio del solfato del dextrano (DSS)-modello IBD per valutare l'effetto delle mutazioni del gene gustativo su immunità mucosa dell'intestino e infiammazione indotto. Questo metodo combina la tecnologia di knockout del gene con il modello IBD chimicamente indotto e quindi può essere applicato per valutare l'esito della nullificazione gene gustativo come pure altri geni che possono exuberate o smorzare la risposta immunitaria indotta da DSS nel colon. Topi mutanti vengono somministrati con DSS per un certo periodo durante il quale loro peso corporeo, sgabello e sanguinamento rettale sono monitorati e registrati. Presso diversi punti temporali durante l'amministrazione, alcuni topi sono euthanized, quindi le dimensioni e i pesi dei loro milze e i due punti sono misurati e tessuti dell'intestino sono raccolti e trattati per istologico e analisi dell'espressione genica. I dati mostrano che i risultati di knockout di α-gustducin in eccessiva perdita di peso, diarrea, sanguinamento intestinale, danno tissutale e topi infiammazione vs wild-type. Poiché la gravità dell'infiammazione indotta è influenzata da diversi ceppi di topi, habitat e dieta, ottimizzazione della durata di concentrazione e amministrazione di DSS in un esperimento pilota è particolarmente importante. Regolando questi fattori, questo metodo può essere applicato per valutare sia gli effetti anti - e pro-infiammatorie.

È stata stabilita una procedura IBD DSS indotta attraverso la somministrazione di 3% DSS in acqua potabile per α-gustducin-knockout (KO) e topi wild-type (WT). Rispetto ai topi WT, i topi knockout ha esibito più grave colite con eccessiva perdita di peso, diarrea e sanguinamento intestinale (Figura 1). Dopo una somministrazione di DSS di 7 giorni, le differenze nell'integrità del tessuto sono state analizzate usando la macchiatura di H & E come il metodo ...

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Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Qui presentiamo un protocollo per studiare l'effetto di annullamento dei geni legati al gustazione sulle risposte immunitarie in un sodio del solfato del dextrano (DSS)-infiammatorie intestinali (IBD) la malattia del mouse modello indotto.

Effetti del gusto segnalazione proteina Abolishment su infiammazione dell'intestino in un modello murino di malattia infiammatoria intestinale

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della biodisosi infiammatoria sulla colite ulcerosa e sulla malattia di Crohn. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzato per valutare i primi effetti anti e proinfammatori delle proteine di segnalazione. L'implicazione di questa tecnica estende l'indagine del gas in nuovi progressi e infiammazione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'effetto genetico sull'infiammazione intestinale. Può anche essere applicato ad altri fattori come diete e microbioma. Generalmente, gli individui nuovi a questo semestre faranno fatica perché elaborare il tessuto cicatriziale della malattia è complicato.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione e le fasi di preparazione dei tessuti sono difficili da imparare perché la mistalia e le strutture del tessuto cellulare possono essere alterate. Per indurre il sodio solfato di dextran, o colite DDS, sostituire l'acqua potabile regolare con una soluzione 3%DSS, aggiungere libidio per sette giorni. Misurazione quotidiana del peso corporeo di ogni mouse, del consumo di soluzioni DSS e della produzione di feci.Alla fine del trattamento di sette giorni, posizionare il mouse in posizione supina e utilizzare piccole forbici per fare un'incisione della linea mediana lunga tre centimetri nell'addome. Raccogliere la milza e misurarne le dimensioni. Quindi utilizzare le forcep per sollevare i due punti per consentirgli di separarlo dal mesenterio circostante.Ed estrarre l'intero colon fino a quando il cieco e il retto sono visibili. Traslittare il tessuto al margine colonsecale. E nel profondo del bacino per liberare rispettivamente il colon prossimale e distale.Misurare e registrare la lunghezza dei due punti isolati. E utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago di gavage per lavare il colon con 10 millilitri di PBS ghiacciato per rimuovere le feci e il sangue fino a quando l'illuato non si sgombra. Per l'identificazione istologica, dividere i campioni di tessuto in sezioni prossimali, medie e distali di pari dimensioni.E fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 gradi Celsius. Per la colorazione ematossilina ed eosina del tessuto colon isolato, la mattina successiva, immergere i pezzi di tessuto nel 30% di saccarosio e PBS durante la notte in singoli tubi da 15 millilitri per la protezione criogenica dei campioni. Il giorno dopo, incorporare i tessuti in una temperatura di taglio ottimale o composto OCT.E raffreddare i tessuti in meno 20 gradi Celsius fino a quando lo OCT non si indurisce. Posizionare i blocchi dello Strumento di personalizzazione di Office nel criostato e impostare il quadrante dello spessore su 12 micrometri. Quindi affettare e raccogliere sezioni congelate spesse 12 micrometri su vetrini al microscopio.Quando tutti i tessuti sono stati sescati, riscaldare gli scivoli a 65 gradi Celsius su una piastra calda per 20 minuti. E lavare brevemente le sezioni riscaldate in acqua distillata prima di macchiare con soluzione di colorazione dell'ematossilina per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di ematossilina in eccesso e correre in acqua del rubinetto per cinque minuti.E differenziare le sezioni con lo 0,5% di acido cloridrico in etanolo per 30 secondi, seguite da un risciacquo di un minuto sotto l'acqua corrente del rubinetto. Quindi, lavare i campioni per un minuto in PBS. Seguito da altri cinque minuti di lavaggio sotto l'acqua corrente del rubinetto.Alla fine del lavaggio, immergere i tessuti in una serie crescente di etanolo per 10 secondi per immersione. Seguito da controsottenimenti in eosin per due minuti. Per la disidratazione dei campioni, immergere le diapositive nel 95% di etanolo e due cambi di etanolo al 100% per cinque minuti per immersione.Seguito da una cancellazione con due, cinque minuti di modifiche in xilene. Quindi segnare il danno tissutale ai colon prossimali, medi e distale di ogni gruppo sperimentale. Per l'analisi immunoistochimica, dopo aver riscaldato le sezioni per 20 minuti sulla piastra calda, lavare gli scivoli tre volte in PBS per 10 minuti per lavaggio.Ed eliminare la perossidasi endogena con un'incubazione di perossido di idrogeno del 3% di 10 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBS come dimostrato e bloccare qualsiasi legame non specifico con tampone di blocco per almeno un'ora a temperatura ambiente. Quindi, sostituire il buffer di blocco con il cocktail di anticorpi primari di interesse.Per un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius. La mattina seguente, aspirare la soluzione di anticorpi primari in eccesso e lavare le diapositive tre volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare gli scivoli con l'appropriato cocktail di anticorpi secondari biotinilati.Seguito dall'etichettatura con complesso di perossidasi di rafano streptavidina a temperatura ambiente. Per visualizzare le cellule immunoreattive, etichettare i campioni con DAB fino a quando non si sviluppa un colore marrone chiaro o scuro. E controsostenere le sezioni con ematossilina e ammoniaca diluita allo 0,3%.Quando le diapositive si sono asciugate, utilizzare un microscopio luminoso per ottenere immagini a campo luminoso delle sezioni tissutali con un ingrandimento di 10x. E utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per identificare e quantificare la popolazione delle cellule immunitarie marcate sia nell'epitelio che nella lamina propria. Per l'analisi dell'espressione genica nei colon trattati con DSS, estrarre l'RNA da meno 80 gradi Celsius scongelato campioni di tessuto colonico secondo protocolli standard di estrazione dell'RNA.E mescolare un microgrammo con l'RNA totale con 2,5 microlitri di 20 millimolare oligo deossitimidina da 12 a 18 primer e un microlitro di moloney murine leucemia virus invertire transcriptasi. Dopo un'incubazione di 60 minuti a 42 gradi Celsius, mescolare un microlitro del cDNA con microlitri allo 0,5% dei primer PCR quantitativi appropriati in avanti e in retromarcia per le citochine di interesse e 2x colorante verde fluorescente. Quindi eseguire la PCR quantitativa sotto i parametri appropriati e calcolare l'espressione genica relativa secondo protocolli standard.Rispetto ai topi di tipo selvatico, i topi knockout alfa gustducina presentano una colite più grave con eccessiva perdita di peso, diarrea e sanguinamento intestinale. Dopo sette giorni di somministrazione della DSS, l'analisi istologica delle sezioni del colon rivela un danno tissutale più aggravato all'interno dei colon prossimali, medi e distale dei topi knockout, rispetto alle loro controparti di tipo selvatico. Questa eccessiva attivazione immunitaria porta all'induzione della colite con una robusta infiltrazione di varie cellule infiammatorie nel colon animale knockout come osservato dall'analisi immunoistochimica.Inoltre, l'analisi quantitativa pcr mostra livelli più elevati di espressione gamma TNF alfa e inferon ma minore espressione di IL-5, 10 e 13, in knockout rispetto ai due punti del topo del tipo selvatico senza alcuna differenza nell'espressione beta di TGF osservata. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare il dosaggio di sodio sudvatro testore e la durata della dimostrazione. Inoltrando questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come ottenere la coltura per comprendere ulteriori domande come l'effetto dell'infiammazione nell'origine del tessuto intestinale.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre un modo per i ricercatori nel campo dell'infiammazione intestinale di esplorare i contributi delle mutazioni geniche alla gravità degli erosi biodisease e di altri vertebrati. Non dimenticare che lavorare con il tessuto intestinale della malattia e il suo contenuto può essere estremamente pericoloso e le ripercussioni come indossare cose appropriate, la protezione personale permanente dovrebbe sempre essere presa durante l'esecuzione di questa procedura.

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