Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
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この作品は、Siyuan 財団、国家自然科学基金、中国の (81671016、31471008、および 31661143030)、国立衛生研究所 (DC010012、DC015819) からの助成金によって支えられています。

マウスを含むすべての実験は、見直しされ、機関動物ケアおよび使用委員会の浙江大学によって承認されました。このプロトコルを実行する前に適切な保護具を着用をお勧めします。
1. マウスと DSS の準備
<ol><li>ノックアウト (α-gustducin-/-) マウスおよび年齢、性別 - と保つボディ重量をマッチさせた野生型制御 (α gustducin+/+) きれいなケージで個別に c57...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

このメソッドは、曲率を用いることができる IBD の DSS 誘発マウス モデルにおける炎症の特定の味覚遺伝子の突然変異の効果を決定します。フル活用するには、IBD の最適な誘導は重要なステップです。大腸炎の開発はマウス緊張、住環境、腸内細菌叢、興味の遺伝子などいくつかの要因の影響を受けます。少数の異なる投与量をテストするマウスと DSS 投与期間パイロット実験を実行するこ?...

潰瘍性大腸炎 (UC)、クローン病 (CD)、炎症性腸疾患 (IBD) の 2 つの主要な形式は多元的病因1,2 腸の弛張熱または進行性慢性炎症性条件によって特徴付けられます。.IBD の発達は遺伝的と同様、ある特定の環境要因食事療法、抗生物質の使用などに依存し、重要なは、病原性の感染症。しかし、病因と IBD の制御分子機構はまだ明らかではありません。したがって、多数の化学物質誘発 IBD 動物モデルが構築され適用された病因と規制メカニズムを表し、治療学3の有効性を評価します。
好みの受容器が G タンパク質共役受容体 (Gpcr) と 2 つの主要な種類に分類されます: タイプ I (T1Rs)、およびタイプ II (T2Rs) うま味、甘くて苦い化合物を検出します。味シグナル伝達カスケードは、G タンパク質 α gustducin と Gβγ の二量体で構成される、Gβγ のサブユニットのリリースにつながる T1Rs または、ヘテロ三量体のアクティブ化 T2Rs に伝達バインドによって開始されます。Gβγ 部分は、下流のエフェクター酵素ホスホリパーゼ C-β 2 (PLC β 2) を順番に刺激し。活性化 PLC β 2 が 2 つの細胞内二次メッセンジャー [イノシトール-1,4,5-三リン酸 (IP3) とジアシルグリセ ロール] に IP3バインド ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸を加水分解し、そのチャネル受容体 IP3 を開くR3、小胞体からのカルシウム イオンを放出します。これは最終的に一時的な受容器の潜在的なイオン チャネル Trpm5 の開口部と、味覚神経4,5,6,7に神経伝達物質 ATP の放出に します。まだ、塩辛い、酸っぱい味のシグナル伝達経路は、うま味、甘くて苦い味8から独立して別です。さらに、味 Gpcr のコンポーネントと下流蛋白質が様々 な口腔外組織に存在します。最近の研究では、その α gustducin を示されている、味がシグナル伝達の主成分が腸粘膜で表されることがわかった。シグナリングの口腔外組織9,10のコンポーネントこれらの好みの機能を理解するためにさらなる研究が必要です。
ここで説明したメソッドを使用して、口腔外組織で表される味覚シグナル伝達タンパク質の機能を特徴付けるため。味蕾化学物質誘発大腸炎モデルにおけるシグナル伝達カスケードの輪郭を描くために開発されたトランスジェニック マウスの線を組み合わせています。主に手続き型のシンプルさ、人間の潰瘍性大腸炎に病理組織学的類似性のため、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導の IBD モデルは様々 な化学物質誘発大腸炎モデル11本のうち最も広く使用されています。本研究で我々 は 1) 組織形態学的変化を分析し、2) の式の違いを試金によって腸粘膜免疫と炎症 α gustducin の新たな機能を明らかにするのに代表的なマウス線として α-gustducin-欠損マウスを使用大腸の炎症に関連するサイトカイン。このメソッドを使用して、遺伝子組み換えマウス ラインの遺伝子と量的そして質的を決定組織の損傷および腸の炎症に味覚シグナル蛋白 (および他のタンパク質が腸内で表現) の貢献できます。興味があります。この方法の利点は、化学の DSS の両方のアクションおよび興味の遺伝子の欠損の結果として統合されたデータを取得するユーザーを有効にします。このメソッドは、その感度を上げる、細胞・分子レベルで腸内の微妙な変化を明らかにするためさらに改善できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

炎症性腸疾患 (IBD) は、潰瘍性大腸炎、クローン病、世界中の人々 の何百万人の生活の質に影響を与えるなど、免疫関連消化器疾患のひとつです。IBD の症状は腹痛, 下痢, と直腸出血を含む腸内細菌、食品成分、腸上皮細胞と免疫細胞間の相互作用から生じる。各キー遺伝子の腸上皮性および免疫細胞で発現が大腸の炎症をどのように影響するかを評価するために特に重要なのです。G タンパク質共役型味覚受容体は、G タンパク質サブユニット α-gustducin と他のシグナル伝達タンパク質を含むは、腸の中に発見されています。ここでは、代表として α-gustducin を使用、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) を記述-IBD 腸管粘膜免疫と炎症の味覚遺伝子の突然変異の効果を評価するモデルを誘発。このメソッドでは、化学的に誘導される IBD モデル遺伝子ノックアウト技術を組み合わせたもの、したがって味覚遺伝子が無効になるだけでなく、可能性があります exuberate またはコロンの DSS 誘発性免疫応答を抑制する他の遺伝子の結果を評価するために適用できます。変異マウスにより管理される DSS の体重や便、直腸出血が監視され、記録される中に、一定の期間。管理中に異なる縦長で一部のマウスは安楽死させて、サイズとコロン、脾臓の重量を測定し、腸組織を収集し、処理組織学的および遺伝子発現解析。データは過度の体重減少、下痢、腸出血、組織の損傷、炎症と野生型マウスの α gustducin ノックアウト結果を示します。誘発した炎症の重症度はいるマウス系統、住環境、食生活の影響、パイロット実験における DSS 濃度と投与期間の最適化は特に重要です。これらの要因を調整して、両方のアンチと炎症の影響を評価するためにこのメソッドを適用できます。

DSS 誘発 IBD プロシージャは 3% の管理によって設立された α-gustducin-ノックアウト (KO) と野生型 (WT) マウスに飲料水中の DSS。ノックアウト マウスは WT マウスと比較して、過度の体重減少、下痢、消化管出血 (図 1) とより重症の大腸炎を出展しました。7 日 DSS 投与後組織学的方法として H & E 染色を使用して組織の整合性の違いを分析し、ノック?...

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Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model (Video) | JoVE

味覚関連遺伝子の無効のデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) の免疫反応に及ぼす影響を調査するためのプロトコルの紹介-炎症性腸疾患 (IBD) マウス モデルを誘発します。

シグナリング蛋白質の廃止、炎症性腸病気のマウスモデルで腸の炎症に味の効果

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

この方法は、潰瘍性大腸炎およびクローン病に関する炎症性バイオ疾患分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、シグナルタンパク質の最初の抗およびプロインファマトリー効果を評価するために使用できることです。この技術の意味は、新しい進歩と炎症におけるガスの調査を拡張します。この方法は、腸の炎症に遺伝的影響に関する洞察を提供することができますが.また、食事やマイクロバイオームなどの他の要因に適用することができます。一般的に、今学期に新しい個人は、病気の瘢痕組織を処理することは難しいので苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは解剖として重要であり、菌体および細胞組織構造が変化する可能性があるため、組織調製ステップは学習が困難である。デキストラン硫酸ナトリウム、またはDDS大腸炎を誘導するには、通常の飲料水を3%DSS溶液に置き換え、7日間リビジウムを添加する。各マウスの体重、DSS溶液の消費量、およびスツールの毎日の生産を測定します。7日間の治療の終わりに、マウスを上の位置に置き、小さいはさみを使って腹部に3センチの長い正中線切開を行います。脾臓を収穫し、そのサイズを測定します。その後、鉗子を使用して結腸を持ち上げ、周囲の腸間腸から分離できるようにします。そして、盲腸と直腸が見えるまで結腸全体を抽出します。コロノーゼカルマージンで組織をトランセクトする。そして、骨盤内の深い、それぞれ近位および遠位結腸を解放する。分離されたコロンの長さを測定し、記録します。そして、ガベージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、10ミリリットルの氷冷PBSで結腸を洗い流し、消火物が透明になるまでフェースと血液を取り除きます。組織学的同定のために、組織サンプルを同じ大きさの近位、中間、遠位のセクションに分割します。そして、摂氏4度で一晩4%パラホルムアルデヒドで組織を固定します。分離された結腸組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色の場合、翌朝、サンプルのクライオ保護のために個々の15ミリリットルのチューブに一晩30%スクロースおよびPBSに組織片を水没させる。翌日、最適な切断温度またはOCT化合物に組織を埋め込んだ。そして、OCTが硬化するまでマイナス20度で組織を冷却します。OCT ブロックをクライオスタットに入れ、厚みダイヤルを 12 マイクロメートルに設定します。その後、ガラス顕微鏡スライドに12マイクロメートルの厚さの凍結切片をスライスして収集します。すべての組織が切り離されたら、ホットプレートで摂氏65度でスライドを20分間温めます。そして、ヘマトキシリン染色液で5分間染色する前に、加熱されたセクションを蒸留水で短時間洗います。余分なヘマトキシリン溶液を取り除き、水道水で5分間実行します。そして、エタノール中の0.5%塩酸で30秒間分化し、続いて水道水の下で1分間リンスを行います。次に、PBSでサンプルを1分間洗浄します。続いて水道水の下でさらに5分間の洗浄。洗浄の終わりに、浸漬ごとに10秒間上昇エタノール系列に組織を沈めます。続いて2分間エオシンで対抗する。サンプルの脱水のために、95%エタノールにスライドを沈め、浸漬ごとに5分間100%エタノールの2つの変更を浸漬します。その後、キシレンの2、5分の変更でクリア。次に、各実験群の近位、中間、および遠位結腸に対する組織損傷をスコア付けする。免疫ヒストケミカル分析のために、ホットプレート上で20分間セクションを温めた後、PBSで3回、洗浄1回10分間洗浄する。そして、10分間3%過酸化水素インキュベーションで内因性ペルオキシダーゼを除去します。インキュベーションの終了時に、サンプルをPBSで3回洗浄し、室温で少なくとも1時間ブロッキングバッファーを用いた非特異的結合を遮断します。次いで、ブロッキングバッファーを目的の一次抗体カクテルに交換します。摂氏4度で一晩インキュベーションを行う場合。翌朝、過剰な一次抗体溶液を吸引し、スライドをPBSで3回洗浄した。最後の洗浄後、適切なビオチン化二次抗体カクテルでスライドをインキュベートします。続いて、レンサビジンワサビペルオキシダーゼ複合体を室温で標識する。免疫反応性細胞を可視化するには、明るい色または暗褐色が現れるまで、DAB でサンプルにラベルを付けます。そして、ヘマトキシリンと0.3%希釈アンモニアとのセクションに対抗する。スライドが乾燥したら、光顕微鏡を使用して、10倍の拡大率で組織切片の明るいフィールド画像を得る。そして、画像処理プログラムを使用して、上皮と層状層の両方でマークされた免疫細胞の集団を同定し、定量化する。DSS処理された結腸での遺伝子発現解析では、標準のRNA抽出プロトコルに従ってマイナス80°Cの大腸組織サンプルからRNAを抽出します。そして、20ミリモルオリゴデオキシチミジン12〜18プライマーの2.5マイクロリットルとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の1マイクロリットルと1マイクログラムを混合します。摂氏42度で60分間のインキュベーションを行った後、cDNAの1マイクロリットルを0.5%マイクロリットルの適切なフォワードおよび逆定量PCRプライマーで、目的のサイトカインおよび2x蛍光グリーン染料に混ぜます。次に、適切なパラメータで定量PCRを実行し、標準的なプロトコルに従って相対遺伝子発現を計算します。野生型マウスと比較して、α突結ノックアウトマウスは、過度の体重減少、下痢および腸出血を伴うより重度の大腸炎を示す。DSS投与の7日後、結腸セクションの組織学的分析は、ノックアウトマウスの近位、中部、および遠位結腸内のより悪化した組織損傷を、野生型のマウスと比較して明らかにする。この過剰な免疫活性化は、免疫物質化学的分析によって観察されるノックアウト動物結腸における様々な炎症性細胞の強い浸潤を伴う大腸炎の誘導をもたらす。また、定量PCR分析は、より高いレベルのTNFアルファおよびインフェロンガンマ発現を示すが、IL-5、10、および13の低い発現は、TGFβ1発現に差のない野生型マウスの結腸と比較してノックアウトで認められる。この手順を試みる間, テキストサウスバターナトリウムの投与量とデモンストレーション期間を最適化することを覚えておくことが重要です。.この手順を転送すると、培養を得るような他の方法は、腸組織発生における炎症の影響などの追加の質問を理解するために行うことができる。開発後、この技術は、腸の炎症分野の研究者がバイオ疾患浸食および他の脊椎動物の重症度に対する遺伝子変異の寄与を探求する道を開く。病気の腸組織とその内容物を扱うことは非常に危険であり、適切なものを身に着けているなどの反響は、常にこの手順を実行している間に永久的な個人的な保護を取るべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut (Video) | JoVE

ネズミ鞭虫感染症：腸内のタイプ2免疫と炎症のモデル

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation (Video) | JoVE

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites (Video) | JoVE

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein (Video) | JoVE

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen (Video) | JoVE

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data (Video) | JoVE

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model (Video) | JoVE

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells (Video) | JoVE

精密カットライブ肺樹状細胞を可視化するために、マウスの肺スライスを

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses (Video) | JoVE

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...