Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra nasjonale naturvitenskap Foundation of China (81671016, 31471008 og 31661143030) og National Institutes of Health (DC010012, DC015819) og av Siyuan Foundation.

Alle eksperimenter som involverer mus ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer av Zhejiang University. Det anbefales å bruke riktig personlig verneutstyr før du utfører denne protokollen.
1. forberedelse av mus og DSS
<ol><li>Holde den knockout (α-gustducin- / -) mus og alder, kjønn og kroppen vekt-matchet vill-type kontroll (α-gustducin/ +) C57BL/6 mus individuelt i ren bur. Merk: Knockout mus har vært backcrossed med C57BL...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Denne metoden kan brukes til å quantitively fastslå effekten av mutasjoner av bestemte gustatory gener på betennelse i en DSS-indusert IBD musemodell. For å utnytte, er optimal induksjon av IBD avgjørende. Utviklingen av kolitt påvirkes av flere faktorer, inkludert mus belastning, bolig miljø, tarm mikroflora, samt gener av interesse. Det anbefales å utføre et pilotprosjekt med et lite antall mus å teste ulike doser og varighet for DSS administrasjon. Under pilotprosjekt, brutto symptomer som vekttap, diaré, i...

De to store formene for inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC) er preget av kronisk remittent eller progressiv inflammatoriske tilstander i tarmen med multifaktoriell etiologi1,2 . Utviklingen av IBD avhenger av genetisk samt visse miljømessige faktorer som kosthold, antibiotikumet use, og viktigst, sykdomsfremkallende infeksjoner. Men er etiologien og regulatoriske molekylære mekanismer underliggende IBD fortsatt uklart. Derfor er mange kjemisk indusert IBD dyremodeller bygget og brukt for å avgrense patogenesen og regulatoriske mekanismer og evaluere effektiviteten av menneskelig therapeutics3.
Smak reseptorer er G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) og er klassifisert som to hovedtyper: Skriv inn jeg (T1Rs) og II (T2Rs) oppdage søt umami og bitre stoffene. Smak signalnettverk kaskader er initiert av tastant binding til T1Rs eller T2Rs, aktivere heterotrimeric G proteiner α-gustducin og en Gβγ dimer og fører til utgivelsen av Gβγ underenheter. Gβγ moiety stimulerer igjen nedstrøms effektor enzymet fosfolipase C-β2 (PLC-β2). Aktivert PLC-β2 så hydrolyzes phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate i to intracellulær sekundære budbringere [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol] og IP3 binder seg til og åpne kanalen-reseptor IP3 R3, slippe kalsiumioner fra det endoplasmatiske retikulum. Dette fører til slutt til åpningen av forbigående reseptor potensielle ion kanal Trpm5 og utgivelsen av nevrotransmitter ATP til gustatory nerver4,5,6,7. Likevel, signalveier av salte og sure smaker er forskjellige fra og uavhengige fra søt og umami bitter smak8. I tillegg finnes komponentene smak GPCRs og nedstrøms proteiner i ulike ekstra muntlig vev. Studier vist at α-gustducin, er den viktigste komponenten smak signalnettverk, funnet å bli uttrykt i tarmen. Videre studier er nødvendig for å forstå funksjonene til disse smak signalering komponenter i ekstra muntlig vev9,10.
Metoden beskrevet her brukes til å beskrive funksjonene til gustatory signalnettverk proteiner i ekstra muntlig vev. Vi kombinerer en transgene musen linje utviklet for skildre signalnettverk kaskader i smaksløkene med kjemisk indusert kolitt modellen. Hovedsakelig på grunn av sin fremgangsmåter for enkelhet og patologisk likheter med menneskelige ulcerøs kolitt, dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert IBD modellen har vært mest brukt blant de ulike kjemisk indusert kolitt modeller11. I denne studien brukte vi α-gustducin-mangelfull mus som en representant musen linje for å avsløre romanen funksjoner α-gustducin i tarmen mucosal immunitet og betennelse av 1) analyserer morfologiske endringer i vevet og 2) assaying forskjeller i uttrykk for cytokiner relatert til betennelse i tykktarmen. Denne metoden kan brukes til kvalitativt og kvantitativt bidrag av gustatory signalnettverk proteiner (og andre proteiner i tarmen) skade på vev og tarm betennelse, når genmodifiserte musen linjer for genene for interesse er tilgjengelig. Fordelene ved denne metoden gjør det mulig for brukere å få integrerte data som følge av både den kjemiske DSS og mangel på genet av interesse. Denne metoden kan forbedres ytterligere å øke sin sensitivitet og avsløre subtile intestinal endringer på mobilnettet og molekylære.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en av de immun-relaterte gastrointestinale lidelser, inkludert ulcerøs kolitt og Crohns sykdom, som påvirker livet kvalitet av millioner av mennesker over hele verden. IBD symptomer inkluderer magesmerter, diaré og endetarms blødning, som kan skyldes samhandlingene tarmen bakterieflora, mat komponenter, intestinal epitelceller og immunceller. Det er spesielt viktig å vurdere hvordan hver nøkkel gen uttrykt i intestinal epitel og immunsystemet cellene påvirker betennelse i tykktarmen. G protein-kombinert smak reseptorer, inkludert G protein delenhet α-gustducin og andre signalnettverk proteiner, har blitt funnet i tarmen. Her bruker vi α-gustducin som en representant og beskriver en dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert IBD modell å evaluere effekten av gustatory genet mutasjoner på gut mucosal immunitet og betennelse. Denne metoden kombinerer knockout genteknologi med kjemisk indusert IBD modellen, og dermed kan brukes for å vurdere utfallet av gustatory genet annullering samt andre gener som kan exuberate eller dempe immunrespons DSS-indusert i tykktarmen. Mutant mus administreres med DSS for en bestemt periode der deres kroppsvekt krakk og endetarms blødning overvåkes og registrert. På ulike timepoints under administrasjon, noen mus er euthanized, da størrelser og tykkelser av deres spleens og kolon måles og gut vev er samlet inn og behandlet for histologiske og gene expression analyser. Dataene viser at α-gustducin knockout resultatene i overdreven vekttap, diaré, intestinal blødning, vevsskade og betennelse vs vill-type mus. Siden alvorlighetsgraden av indusert inflammasjon påvirkes av musen stammer, bolig miljø og kosthold, er optimalisering av DSS konsentrasjon og administrasjon varighet i et pilotprosjekt spesielt viktig. Ved å justere disse faktorene, kan denne metoden brukes til å vurdere både anti - og pro-inflammatoriske effekter.

En DSS-indusert IBD prosedyre ble etablert av administrere 3% DSS i drikkevann α-gustducin-knockout (KO) og vill-type (WT) mus. Sammenlignet med WT mus, utstilt knockout musene mer alvorlig kolitt med overdreven vekttap, diaré og intestinal blødning (figur 1). Etter en 7 dagers DSS administrasjon, forskjellene i vev integritet ble analysert med H & E flekker som histologiske metode og mer forverret vevsskade ble funnet i det proksimale, midtre og distale k...

Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke effekten av opphør av gustation-relaterte gener på immunreaksjoner i en dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert inflammatorisk tarm sykdom (IBD) musemodell.

Effekter av smak signalering Protein oppløsning på Gut betennelse i en inflammatorisk tarm sykdom musemodell

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i det inflammatoriske biodiseasefeltet om ulcerøs kolitt og Crohns sykdom. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan brukes til å evaluere første anti- og proinfammatoriske effekter av signalproteiner. Implikasjonen av denne teknikken utvider undersøkelsen av gass i nye fremskritt og betennelse.Selv om denne metoden kan gi innsikt i genetisk effekt på tarmbetennelse. Det kan også brukes på andre faktorer som dietter og mikrobiome. Generelt vil personer som er nye i dette semesteret slite fordi behandling av sykdomsarrvev er vanskelig.Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk som disseksjon og vev forberedelse trinnene er vanskelig å lære fordi mystalia og cellevev strukturer kan endres. For å indusere dekstransulfatnatrium, eller DDS-kolitt, erstatt det vanlige drikkevannet med 3% DSS-løsning, tilsett libidium i syv dager. Måling av hver muss kroppsvekt, DSS løsning forbruk, og avføring produksjon daglig.På slutten av syv dagers behandling, plasser musen i liggende stilling og bruk liten saks for å lage et tre centimeter langt mellomlinje snitt i magen. Høst milten og mål størrelsen. Bruk deretter tang til å løfte tykktarmen slik at det kan skilles fra det omkringliggende mesenteriet.Og trekk ut hele tykktarmen til cecum og endetarmen er synlige. Transect vevet på colonosecal margin. Og dypt inne i bekkenet for å frigjøre proksimal og distal kolon, henholdsvis.Mål og registrer lengden på det isolerte tykktarmen. Og bruk en 10 milliliter sprøyte utstyrt med en gavage nål for å skylle tykktarmen med 10 milliliter iskald PBS for å fjerne avføring og blod til illuatet går klart. For histologisk identifikasjon, del vevsprøvene i like store proksimale, midtre og distale seksjoner.Og fikse vevet i 4% paraformaldehyd over natten ved 4 grader Celsius. For hematoksylin og eosinfarging av det isolerte kolonvevet, neste morgen, senk vevsbitene i 30% sukrose og PBS over natten i individuelle 15 milliliter rør for kryobeskyttelse av prøvene. Neste dag, innebygging vev i optimal skjæretemperatur eller OCT sammensatte.Og avkjøl vevet i minus 20 grader Celsius til OCT stivner. Plasser OCT-blokkene i kryostaten og sett tykkelseshjulet til 12 mikrometer. Skjær deretter og samle 12 mikrometer tykke frosne seksjoner på glassmikroskop lysbilder.Når alle vevene er seksjonert, varm lysbildene ved 65 grader Celsius på en kokeplate i 20 minutter. Og vask de oppvarmede seksjonene kort i destillert vann før farging med hematoksylinfargingsløsning i fem minutter. Fjern overflødig hematoksylinløsning og kjør i vann fra springen i fem minutter.Og differensier seksjonene med 0,5% saltsyre i etanol i 30 sekunder, etterfulgt av ett minutt skyll under rennende vann fra springen. Deretter vasker du prøvene i ett minutt i PBS. Etterfulgt av ytterligere fem minutters vask under rennende vann fra springen.På slutten av vasken, senk vevet i en stigende etanolserie i 10 sekunder per nedsenking. Etterfulgt av konstring i eosin i to minutter. For dehydrering av prøvene, senk lysbildene i 95% etanol og to endringer på 100% etanol i fem minutter per nedsenking.Etterfulgt av clearing med to, fem minutters endringer i xylen. Deretter scorer vevsskaden på proksimale, midtre og distale kolon av hver eksperimentell gruppe. For immunohistokjemisk analyse, etter oppvarming av seksjonene i 20 minutter på kokeplaten, vask lysbildene tre ganger i PBS i 10 minutter per vask.Og eliminere endogene peroksidase med en 10 minutt 3% hydrogenperoksid inkubasjon. På slutten av inkubasjonen vask prøvene tre ganger i PBS som demonstrert og blokker eventuelle uspesifikke bindinger med blokkerende buffer i minst en time ved romtemperatur. Deretter erstatter du blokkeringsbufferen med den primære antistoffcocktailen av interesse.For en overnatting inkubasjon ved 4 grader Celsius. Neste morgen, aspirere overflødig primær antistoff løsning og vaske lysbildene tre ganger i PBS. Etter siste vask, inkuber lysbildene med riktig biotinylert sekundær antistoffcocktail.Etterfulgt av merking med streptavidin pepperrot peroxidase kompleks ved romtemperatur. For å visualisere de immunoraktive cellene, merk prøvene med DAB til en lys eller mørk brun farge utvikler seg. Og motvirke seksjonene med hematoksylin og 0,3% fortynnet ammoniakk.Når lysbildene har tørket, bruk et lett mikroskop for å få lyse feltbilder av vevsseksjonene under en 10x forstørrelse. Og bruk et bildebehandlingsprogram for å identifisere og kvantifisere befolkningen i de merkede immuncellene i både epitelet og laminapropria. For genuttrykksanalyse i DSS-behandlede koloner, ekstrakt RNA fra minus 80 grader Celsius tint kolonvevsprøver i henhold til standard RNA-ekstraksjonsprotokoller.Og bland ett mikrogram med den totale RNA med 2,5 mikroliter på 20 millimolar oligo deoksytymidin 12 til 18 primere og en mikroliter moloney murine leukemi virus omvendt transcriptase. Etter en 60 minutters inkubasjon ved 42 grader Celsius, bland en mikroliter av cDNA med 0,5% mikroliter av passende fremover og omvendt kvantitative PCR-primere for cytokiner av interesse og 2x fluorescerende grønt fargestoff. Kjør deretter den kvantitative PCR under de riktige parameterne og beregner det relative genuttrykket i henhold til standardprotokoller.Sammenlignet med wildtype mus, alfa gustducin knockout mus viser en mer alvorlig kolitt med overdreven vekttap, diaré og tarmblødning. Etter syv dager med DSS-administrasjon avslører histologisk analyse av kolonseksjonene en mer forverret vevsskade i proksimale, midtre og distale kolon av knockoutmusene, sammenlignet med deres wildtype kolleger. Denne overdreven immunaktivering fører til induksjon av kolitt med en robust infiltrasjon av ulike inflammatoriske celler i knockout dyrekolonet som observert av immunohistokjemisk analyse.Videre viser kvantitativ PCR-analyse høyere nivåer av TNF alfa og inferon gamma uttrykk, men lavere uttrykk for IL-5, 10 og 13, i knockout sammenlignet med wildtype mus kolon uten forskjell i TGF beta ett uttrykk observert. Mens du prøver denne prosedyren, Det er viktig å huske å optimalisere textorous southvater natrium dosering og demonstrasjon varighet. Videresending av denne prosedyren, kan annen metode som å skaffe kultur utføres for å forstå flere spørsmål som effekten av betennelse i tarmvevopprinnelse.Etter utviklingen baner denne teknikken en måte for forskere innen tarmbetennelse å utforske bidragene fra genmutasjoner til alvorlighetsgraden av biodisease erodering og andre virveldyr. Ikke glem at arbeid med sykdom tarmvev og innholdet kan være ekstremt farlig og konsekvensene som iført ting som er hensiktsmessig, personlig beskyttelse permanent bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

A Mouse Modell for Patogen Utløst kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av musen Mx1 Protein med influensa A virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikal Actin Flow i T-celler kvantifisert ved Spatio-temp Bilde korrelasjon spektroskopi av Strukturert Illumination Mikros data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-kutt Mouse Lung Slices å visualisere Live-lunge dendrittiske celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsiktig overvåking av inflammatoriske responser

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...