Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Эта работа поддерживается за счет субсидий из национального естественных наук фонд Китая (81671016, 31471008 и 31661143030) и национальных институтов здравоохранения (DC010012, DC015819) и Фондом Siyuan.

Все эксперименты с мышей были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование комитетов Чжэцзянский университет. Рекомендуется носить надлежащие средства личной защиты перед выполнением настоящего Протокола.
1. Подготовка мышей и DSS
<ol><li>Держат...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Этот метод может использоваться для quantitively определить влияние мутаций специфических генов вкусовые на воспаление в модели мыши DSS-индуцированной IBD. В полной мере воспользоваться, оптимальная индукция IBD является ключевым шагом. Разработка, колитов зависит от нескольких факторов, вклю...

Два основных форм воспалительных заболеваний кишечника (IBD), болезнь Крона (CD) и язвенного колита (UC) характеризуются хроническим проверят или прогрессивный воспалительных кишечника с многофакторной этиологии1,2 . Развитие IBD зависит от генетических, а также некоторых экологических факторов, таких как диетические, использование антибиотиков и главное, патогенных инфекций. Однако этиологии и молекулярные механизмы регулирования лежащих в основе IBD до сих пор неясны. Таким образом многочисленные химически индуцированных IBD Животные модели построены и применяется к разграничить патогенеза и механизмов регулирования и оценки эффективности человека терапии3.
Вкус рецепторы являются G белок рецепторы (GPCR) и классифицируются как два основных типа: тип I (T1Rs), и тип II (T2Rs), что обнаружить сладкий, умами и горькая соединений. Вкус сигнальные каскады инициируются tastant привязки к T1Rs или T2Rs, активация гетеротримерные Г белков, состоящий из α-gustducin и Gβγ димер и ведущих к выпуску Gβγ подразделения. Общие Gβγ в свою очередь стимулирует течению эффекторных фермента фосфолипаза C-β2 (PLC-β2). Активированные PLC-β2 затем гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-Бисфосфат в два посыльных внутриклеточных вторичных [инозит-1,4,5-trisphosphate (IP-3) и диацилглицерол] и3 IP связывается и открыть его источник рецептор IP3 R3, выпуская ионов кальция из эндоплазматического ретикулума. Это в конечном итоге приводит к открытию Переходный рецепторный потенциал ионного канала Trpm5 и освобождение нейромедиатора СПС на вкусовые нервы4,5,6,7. Тем не менее сигнальные пути соленым и кислым вкусы разные и независимого от сладкого, умами и горький вкус8. Кроме того компоненты вкуса GPCR и ниже по течению белки существуют в различных тканях экстра полости рта. Недавние исследования показали, что α-gustducin, главный компонент вкус сигнализации, найден выражаться в слизистой оболочке кишечника. Дальнейшие исследования необходимы для понимания функций этих вкус сигнализации компонентов в тканях экстра полости рта9,10.
Метод, описанный здесь используется для характеристики функции вкусовых сигнальных белков, выраженные в тканях экстра полости рта. Мы объединяем трансгенные мыши линии, разработанных для разграничения сигнальных каскадов в вкус почки с моделью химически индуцированных колит. Во многом благодаря его процедурных простоту и патологических сходство человека язвенный колит, декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированного IBD модель наиболее широко используется среди различных моделей химически индуцированных колит11. В этом исследовании мы использовали мышей α-gustducin недостаточным как представитель мыши линия выявить новые функции α-gustducin иммунитет слизистой кишечника и воспаления 1) анализа морфологических изменений в тканях и 2) опробование различия в выражении Цитокины, относящиеся к воспаления в толстой кишке. Этот метод может использоваться для количественно и качественно определить вклад вкусовые сигнальных белков (и другие белки, выраженные в кишечнике) повреждения тканей и кишечные воспаления, когда генетически модифицированные мыши линии для гены имеется интерес. Преимущества данного метода позволяя пользователям для получения комплексных данных в результате действия химических DSS и дефицит гена интереса. Этот метод можно усовершенствовать увеличить свою чувствительность и выявить тонкие кишечных изменения на клеточном и молекулярном уровнях.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является одним из связанных с иммунной желудочно-кишечные расстройства, включая язвенного колита и болезни Крона, которая влияет на качество жизни миллионов людей во всем мире. IBD симптомы включают боль в животе, понос и ректальное кровотечение, которые могут возникнуть в результате взаимодействия между кишка микробиоты, компонентов пищи, кишечные эпителиальных клеток и иммунных клеток. Это имеет особое значение для оценки влияние каждый ключевой ген, выраженная в кишечного эпителия и иммунных клеток воспаления в толстой кишке. G белка в сочетании вкус рецепторов, включая G белка Субблок α-gustducin и других сигнальных белков, были найдены в кишечнике. Здесь, мы используем α-gustducin в качестве представителя и описать декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной IBD модель для оценки влияние мутаций гена вкусовые на иммунитет слизистой кишечника и воспаления. Этот метод сочетает в себе технологии Нокаут гена с моделью химически индуцированных IBD и таким образом могут применяться для оценки результатов вкусовые гена аннулирование, а также других генов, которые могут exuberate или ослабить DSS-индуцированной иммунный ответ в толстой кишке. Мутантных мышей управляются с DSS за определенный период, в течение которого контролируется и Записанная их веса тела, стул и ректальное кровотечение. На разных timepoints во время администрации, умерщвлены некоторые мышей, затем измеряются размеры и вес их селезенки и двоеточия и кишечника ткани собираются и обрабатываются для гистологического и анализа выражения гена. Данные показывают, что результаты нокаут α-gustducin в чрезмерная потеря веса, понос, кишечное кровотечение, повреждение тканей и воспаления против мышей дикого типа. Так как выраженность воспалительных процессов индуцированных зависит от мыши штаммов, жилищных условий и диеты, оптимизация DSS концентрации и администрации продолжительность эксперимента является особенно важным. Настроив эти факторы, этот метод может применяться для оценки как анти - и про воспалительных последствия.

DSS-индуцированной IBD процедура была учреждена администрирование 3% DSS в питьевой воде α-gustducin нокаут (KO) и (WT) мышах одичал тип. По сравнению с WT мышей, мышей нокаут выставлены более острый колит, чрезмерная потеря веса, диареи и кишечных кровотечений (рис. 1)....

Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Здесь мы представляем протокол к исследовать эффект аннулирование дегустация связанных генов на иммунные реакции в декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной модель мыши воспалительных кишечника болезнь (IBD).

Эффекты вкуса, сигнализации Abolishment белка на кишки воспаление в модели мыши заболеваний воспалительных кишечника

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспалительных биодизазы о язвенный колит и болезнь Крона. Основным преимуществом этой методики является то, что она может быть использована для оценки первого анти- и проинфамматорного воздействия сигнальных белков. Смысл этого метода расширяет обследование газа в новых достижений и воспаления.Хотя этот метод может обеспечить понимание генетического воздействия на воспаление кишечника. Он также может быть применен к другим факторам, таким как диеты и микробиом. Как правило, лица, новые в этом семестре будет бороться, потому что обработка рубцовой ткани болезни сложно.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как вскрытие и шаги подготовки ткани трудно узнать, потому что мистика и структуры клеточной ткани могут быть изменены. Чтобы вызвать декстран сульфат натрия, или DDS колит, заменить обычную питьевую воду с 3%DSS раствор, добавить либидий в течение семи дней. Измерение массы тела каждой мыши, потребление раствора DSS и ежедневное производство стула.В конце семидневного лечения поместите мышь в положение на спине и используйте маленькие ножницы, чтобы сделать три сантиметра длиной среднего разреза в брюшной полости. Урожай селезенки и измерить ее размер. Затем используйте типсы, чтобы поднять толстую кишку, чтобы она была отделена от окружающей мезентерии.И извлекайте всю толстую кишку до тех пор, пока не будут видны цикум и прямая кишка. Переложить ткань на колонозное поле. И глубоко внутри таза, чтобы освободить проксимальной и дистальной толстой кишки, соответственно.Измерьте и замитьте длину изолированной толстой кишки. И использовать 10 миллилитров шприц оснащен иглой gavage промыть толстой кишки с 10 миллилитров ледяной PBS для удаления кала и крови, покаиллюат работает ясно. Для гистологической идентификации разделите образцы тканей на проксимальные, средние и дистальные секции одинакового размера.И исправить ткани в 4%paraformaldehyde ночь при 4 градусах по Цельсию. Для гематоксилина и эозина окрашивания изолированной ткани толстой кишки, на следующее утро, погрузить части ткани в 30% сахарозы и PBS ночь в отдельных 15 миллилитров труб для криозащиты образцов. На следующий день, встраиваемые ткани в оптимальной температуре резки или OCT соединения.И охладить ткани в минус 20 градусов по Цельсию до OCT затвердевает. Поместите блоки OCT в криостат и установите толщину циферблата до 12 микрометров. Затем нарежьте и соберите 12 микрометров толщиной замороженные секции на стеклянные слайды микроскопа.Когда все ткани были секционые, тепло слайды при 65 градусов по Цельсию на горячей тарелке в течение 20 минут. И мыть нагретые секции кратко в дистиллированной воде перед окрашивание с гематоксилином окрашивания раствора в течение пяти минут. Удалите избыток гематоксилина раствора и запустить в водопроводной воде в течение пяти минут.И дифференцировать разделы с 0,5%гидрохлорной кислоты в этаноле в течение 30 секунд, а затем одну минуту промыть под проточной водопроводной водой. Затем, мыть образцы в течение одной минуты в PBS. Затем еще пять минут мыть под проточной водопроводной водой.В конце стирки погрузим ткани в восходящую серию этанола в течение 10 секунд за погружение. Затем счетчики в эосине в течение двух минут. Для обезвоживания образцов, погрузить слайды в 95% этанола и два изменения 100% этанола в течение пяти минут за погружение.Затем очистка с двумя, пятью минутными изменениями в ксилене. Затем оценка повреждения тканей проксимальной, средней и дистальной толстой кишки каждой экспериментальной группы. Для иммуногистохимического анализа, после нагрева секций в течение 20 минут на горячей тарелке, мыть слайды три раза в PBS в течение 10 минут за стирку.И устранить эндогенной пероксиды с 10 минут 3%перекиси перекиси инкубации. В конце инкубации, мыть образцы три раза в PBS, как попродемонстрировано, и блокировать любые неспецифические связывания с блокирующим буфером, по крайней мере один час при комнатной температуре. Затем замените блокирующий буфер основным коктейлем, представляющим интерес для антител.Для ночной инкубации при 4 градусах по Цельсию. На следующее утро, аспирировать избыток первичного раствора антител и мыть слайды три раза в PBS. После последней стирки инкубировать слайды с соответствующим биотинилированным вторичным антителом коктейль.Затем маркировка стрептавидином хрена пероксидазы комплекса при комнатной температуре. Чтобы визуализировать иммунореактивные клетки, маркировать образцы с DAB до тех пор, пока светлый или темно-коричневый цвет развивается. А счетчики с гематоксилином и 0,3%разбавляют аммиаком.Когда слайды высохли, используйте световой микроскоп, чтобы получить яркие полевые изображения секций тканей под 10-х увеличением. И использовать программу обработки изображений для выявления и количественной оценки популяции отмеченных иммунных клеток как в эпителии, так и в ламина проприи. Для анализа экспрессии генов в обработанных DSS двоеточиях, извлекайте РНК из минус 80 градусов по Цельсию оттаяли образцы тканей толстой кишки в соответствии со стандартными протоколами извлечения РНК.И смешать один микрограмм с общей РНК с 2,5 микролитров 20 миллимолярный олиго деокситимидин 12 до 18 грунтовки и один микролитр молони мурин лейкемии вирус обратной транскриптазы. После 60-минутной инкубации при 42 градусах Цельсия смешайте один микролитр cDNA с 0,5%microliters соответствующих вперед и обратного количественных праймеров ПЦР для цитокинов интереса и 2x флуоресцентного зеленого красителя. Затем запустите количественный ПЦР по соответствующим параметрам и вычислите относительную экспрессию генов в соответствии со стандартными протоколами.По сравнению с дикими мышами, альфа-густдуцин нокаутом мышей проявляют более тяжелый колит с чрезмерной потерей веса, диарея и кишечные кровотечения. После семи дней DSS администрации, гистологический анализ толстой кишки разделы выявить более отягчающих повреждений тканей в проксимальной, средней и дистальной толстой кишки нокаут мышей, по сравнению с их коллегами дикого типа. Эта чрезмерная иммунная активация приводит к индукции колита с надежной инфильтрацией различных воспалительных клеток в толстой кишке животных, как это наблюдается иммуногистохимическим анализом.Кроме того, количественный анализ ПЦР демонстрирует более высокие уровни альфа-и вывода гамма-экспрессии TNF, но более низкое выражение IL-5, 10 и 13, в нокауте по сравнению с дикорастучей мышей толстой кишки без разницы в TGF бета одно выражение наблюдается. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы оптимизировать текстурные Southvater натрия дозировка и продолжительность демонстрации. Переасыв эту процедуру, другой метод, как получение культуры может быть выполнена для того, чтобы понять дополнительные вопросы, такие как эффект воспаления в кишечных тканях происхождения.После его развития, этот метод прокладывает путь для исследователей в области воспаления кишечника, чтобы исследовать вклад генных мутаций в тяжесть эрозии биодизазы и других позвоночных. Не забывайте, что работа с болезнью кишечника ткани и ее содержание может быть чрезвычайно опасным и последствия, такие как ношение вещей, которые являются целесообразными, личная защита постоянной всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Инфекция: Модель Тип 2 иммунитет и воспаление в кишечнике

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Мышь Модель для патогенных микроорганизмов, вызванной хроническим воспалением на локальном и системном сайтов

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Точность резки Мышь легких Кусочки визуализировать в прямом легочная дендритные клетки

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Модель переходной трансгенерации IL-8 для<em&gt; В Виво</em&gt; Долгосрочный мониторинг воспалительных реакций

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...