Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Detta arbete stöds genom bidrag från de nationella naturvetenskap Foundation of China (81671016, 31471008 och 31661143030) och National Institutes of Health (DC010012, DC015819) och av stiftelsen Siyuan.

Alla försök med möss var granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning kommittéer av Zhejiang University. Det rekommenderas att bära lämplig personlig skyddsutrustning innan du utför detta protokoll.
1. beredning av möss och DSS
<ol><li>Hålla de knockoutmöss (α-gustducin- / -) och ålder-, genus- och vikt-matchade vildtyp kroppskontroll (α-gustducin+/ +) C57BL/6 möss individuellt i rena burar. Obs: Knockoutmöss har varit backcross...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Denna metod kan användas för att kvantitativt bestämma effekten av mutationer i specifika luktintrycket gener på inflammation i en musmodell för DSS-inducerad IBD. För att dra full nytta, är optimal induktion av IBD ett viktigt steg. Utvecklingen av kolit påverkas av flera faktorer, inklusive mus stam, boendemiljö, tarmflorans, samt generna av intresse. Det rekommenderas att utföra en pilot experiment med ett litet antal möss att testa olika doser och behandlingstider DSS administration. Under pilot experiment...

De två stora formerna av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC) kännetecknas av kronisk remitterande eller progressiv inflammatoriska tillstånd i tarmen med multifaktoriell etiologi1,2 . Utvecklingen av IBD beror på genetiska samt vissa miljöfaktorer som kost, användning av antibiotika, och ännu viktigare, patogena infektioner. De etiologi och reglerande molekylära mekanismer bakom IBD är dock fortfarande oklart. Talrika kemiskt inducerad IBD djurmodeller har därför konstruerats och tillämpas för att avgränsa den patogenes och reglerande mekanismer och utvärdera effektiviteten av mänskliga therapeutics3.
Smak receptorer är G-proteinkopplade receptorer (varandra) och klassificeras som två typer: typ I (T1Rs) och typ II (T2Rs) som upptäcker sweet, umami och bitter föreningar. Smak signalering cascades initieras av tastant binder till T1Rs eller T2Rs, aktivera heterotrimeric G proteiner bestående av α-gustducin och en Gβγ dimer och leder till frisättning av Gβγ subunitsna. Den Gβγ delen stimulerar i sin tur nedströms effektor enzymet fosfolipas C-β2 (PLC-β2). Aktiverade PLC-β2 sedan hydrolyserar fosfatidylinositol-4,5-bisphosphate i två intracellulära sekundära budbärare [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) och diglyceridolja] och IP-3 binder till och öppna dess kanal-receptor IP3 R3, släppa kalciumjoner från endoplasmatiska retiklet. Detta leder så småningom till öppnandet av transient receptor potential jonkanal Trpm5 och frisättning av signalsubstansen ATP på luktintrycket nerver4,5,6,7. Men är signalvägar som salt och syrlig smak olika och oberoende från sweet, umami och bittra smaker8. I tillägg finns de komponenter av smak varandra och nedströms proteiner i olika extra orala vävnader. Nyligen genomförda studier indikerade att α-gustducin, befinns huvudkomponenten i smak signalering, uttryckas i tarmslemhinnan. Ytterligare studier behövs för att förstå funktionerna i dessa smak signalering komponenter i extra orala vävnader9,10.
Den metod som beskrivs här används för att karakterisera funktioner av luktintrycket signalering proteinerna uttrycks i extra orala vävnader. Vi kombinerar en transgen mus linje utvecklats för avgränsar signalering cascades i smaklökar med kemiskt inducerad kolit modellen. Till stor del på grund av dess processuella enkelhet och patologiska likheter med människans ulcerös kolit, dextran sulfat natrium (DSS)-inducerad IBD modell har använts mest bland olika kemiskt inducerad kolit modeller11. I denna studie använde vi α-gustducin-brist möss som en representativ mus linje för att avslöja nya funktioner av α-gustducin i tarmen slemhinnor immunitet och inflammation genom att 1) analysera morfologiska förändringar i vävnaden och 2) testmetoder skillnader i uttrycket av cytokiner som relaterade till inflammation i tjocktarmen. Denna metod kan användas för att kvantitativt och kvalitativt bestämma luktintrycket signalering proteiner (och andra proteiner som uttrycks i tarmen) bidrag till vävnadsskador och tarminflammation, när genetiskt modifierade mus linjer för gener intresse finns. Fördelarna med denna metod möjliggör användare att få integrerade data som härrör från åtgärder i både kemiska DSS och brist av genen av intresse. Denna metod kan förbättras ytterligare för att öka dess känslighet och avslöjar subtila intestinal förändringar på cellulär och molekylär nivå.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en av de immunrelaterade gastrointestinala störningar, inklusive ulcerös kolit och Crohns sjukdom, som påverkar livskvaliteten för miljontals människor världen över. IBD symtom är buksmärtor, diarré och rektal blödning, vilket kan resultera från interaktioner mellan tarmfloran, matdelar, tarmepitelceller och immunceller. Det är särskilt viktigt att bedöma hur varje nyckel gen uttryckt i tarmens epitelceller och immun cellerna påverkar inflammation i tjocktarmen. G-proteinkopplade smak receptorer, inklusive G protein subenhet α-gustducin och andra signalering proteiner, har hittats i tarmen. Här, vi använder α-gustducin som representant och beskriva en dextran sulfat natrium (DSS)-inducerad IBD-modell för att utvärdera effekten av luktintrycket genmutationer på gut slemhinnor immunitet och inflammation. Denna metod kombinerar genteknik knockout med kemiskt inducerad IBD-modellen och därmed kan användas för att bedöma resultatet av luktintrycket gen upphävda samt andra gener som kan andas eller dämpa immunsvaret DSS-inducerad i tjocktarmen. Muterade möss administreras med DSS för en viss period under vilken deras kroppsvikt, pall och rektal blödning övervakas och registreras. Vid olika tidpunkter under administration, vissa möss är euthanized, sedan de storlekar och vikter för sin mjälte och kolon mäts och gut vävnader samlas in och bearbetas för histologiska och gen uttryck analyser. Data visar att α-gustducin knockout resultaten i överdriven viktminskning, diarré, intestinal blödning, vävnadsskada och inflammation vs. vildtyps-möss. Eftersom svårighetsgraden av inducerad inflammation påverkas av mus stammar, boendemiljö och kost, är optimering av DSS koncentration och administration varaktighet i en pilot experiment särskilt viktigt. Genom att justera dessa faktorer, kan denna metod användas för att bedöma både anti - och pro-inflammatoriska effekter.

En DSS-inducerad IBD förfarande inrättades genom administrera 3% DSS i dricksvatten till α-gustducin-knockout (KO) och vildtyp (WT) möss. Jämfört med WT möss, uppvisade knockoutmöss mer svår kolit med överdriven viktminskning, diarré och intestinal blödning (figur 1). Efter en 7-dagars DSS administration, skillnaderna i vävnad integritet analyserades med H & E färgning som metoden histologiska och mer grovt vävnadsskada hittades i den proximala...

Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model (Video) | JoVE

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka effekten av upphävandet av gustation-relaterade gener på immunsvaret hos en dextran sulfat natrium (DSS)-inducerad musmodell för inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom (IBD).

Effekterna av smak signalering Protein Abolishment på Gut Inflammation i en musmodell för inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i det inflammatoriska biodiseasfältet om ulcerös kolit och Crohns sjukdom. Den största fördelen med denna teknik är att den kan användas för att utvärdera första anti och proinfammatory effekter av signalering proteiner. Innebörden av denna teknik utökar undersökningen av gas i nya framsteg och inflammation.Även om denna metod kan ge insikter i genetisk effekt på tarminflammation. Det kan också tillämpas på andra faktorer såsom kost och mikrobiomet. Generellt, individer nya till denna termin kommer att kämpa eftersom bearbetning sjukdom ärrvävnad är knepigt.Visuell demonstration av denna metod är kritisk som dissektion och vävnaden förberedelsen stegen är svåra att lära eftersom mystalia och cellvävnaden strukturer kan ändras. För att inducera dextran sulfat natrium, eller DDS kolit, ersätta det ordinarie dricksvatten med 3%DSS lösning, tillsätt libidium i sju dagar. Mäta varje mouses'body vikt, DSS lösning konsumtion, och avföring produktion dagligen.I slutet av sju dagars behandling, placera musen i ryggläge och använd små saxar för att göra en tre centimeter lång mittlinjen snitt i buken. Skörda mjälten och mät dess storlek. Använd sedan tes för att lyfta tjocktarmen för att tillåta att den separeras från den omgivande mesenteri.Och extrahera hela tjocktarmen tills cecum och ändtarmen är synliga. Transect vävnaden vid den colonosecal marginalen. Och djupt inne i bäckenet för att frigöra den proximala och distala kolon, respektive.Mät och registrera längden på det isolerade kolonet. Och använd en 10 milliliter spruta utrustad med en sondmatning nål för att spola tjocktarmen med 10 milliliter iskall PBS för att ta bort avföring och blod tills illuat rinner klart. För histologisk identifiering, dela vävnadsproverna i lika stora proximala, mellersta och distala sektioner.Och fixa vävnaderna i 4%paraformaldehyd över natten vid 4 grader Celsius. För hematoxylin och eosinfärgning av den isolerade kolonvävnaden, nästa morgon, dränka vävnadsbitarna i 30%sackaros och PBS över natten i enskilda 15 milliliter rör för kryoskydd av proverna. Nästa dag, bädda in vävnaderna i optimal skärtemperatur eller OCT förening.Och kyl vävnaderna i minus 20 grader Celsius tills ULT hårdnar. Placera OCT-blocken i kryostaten och ställ in tjockleksratten på 12 mikrometer. Skiva sedan och samla 12 mikrometer tjocka frysta sektioner på glasmikroskop diabilder.När alla vävnader har varit sektionerade, värm diabilderna vid 65 grader Celsius på en värmeplatta i 20 minuter. Och tvätta de uppvärmda sektionerna kort i destillerat vatten innan färgning med hematoxylin färgningslösning i fem minuter. Ta bort den överflödiga hematoxylinlösningen och kör i kranvatten i fem minuter.Och differentiera sektionerna med 0,5%saltsyra i etanol i 30 sekunder, följt av en minut skölj under rinnande kranvatten. Därefter tvättar du proverna i en minut i PBS. Följt av ytterligare fem minuters tvätt under rinnande kranvatten.I slutet av tvätten, dränka vävnaderna i en stigande etanolserie i 10 sekunder per nedsänkning. Följt av counterstaining i eosin i två minuter. För uttorkning av proverna, dränka objektglasen i 95%etanol och två förändringar av 100%etanol i fem minuter per nedsänkning.Följt av clearing med två, fem minuters förändringar i xylen. Poäng sedan vävnadsskadan på de proximala, mellersta och distala kolonen i varje experimentell grupp. För immunohistochemical analys, efter uppvärmningen av sektionerna i 20 minuter på värmeplattan, tvätta diabilder tre gånger i PBS i 10 minuter per tvätt.Och eliminera den endogena peroxidas med en 10 minuters 3%väteperoxid inkubation. Vid inkubationens tvätta proverna tre gånger i PBS som påvisats och blockera eventuell ospecifik bindning med blockerande buffert under minst en timme i rumstemperatur. Byt sedan ut den blockerande bufferten mot den primära antikroppscocktailen av intresse.För en övernattning inkubation vid 4 grader Celsius. Nästa morgon aspirerar du den överflödiga primära antikroppslösningen och tvättar objektglasen tre gånger i PBS. Efter den sista tvätten, inkubera objektglasen med lämplig biotinylerad sekundär antikroppscocktail.Följt av märkning med streptavidin pepparrot peroxidas komplex vid rumstemperatur. För att visualisera de immunoreaktiva cellerna, märk proverna med DAB tills en ljus eller mörkbrun färg utvecklas. Och counterstain sektionerna med hematoxylin och 0,3%utspädd ammoniak.När objektglasen har torkat, använd ett ljusmikroskop för att få ljusa fältbilder av vävnadssektionerna under en 10x förstoring. Och använda ett bildbehandlingsprogram för att identifiera och kvantifiera populationen av de markerade immuncellerna i både epitelet och lamina-propria. För analys av genuttryck i DSS-behandlade kolon, extraherar RNA från minus 80 grader Celsius tinade koloniska vävnadsprover enligt standardprotokoll för RNA-extraktion.Och blanda ett mikrogram med den totala RNA med 2,5 mikroliter av 20 millimolar oligo deoxythymidine 12 till 18 primers och en mikroliter moloney murine leukemi virus omvänd transkriptas. Efter en 60 minuters inkubation vid 42 grader Celsius, blanda en mikroliter av cDNA med 0,5%mikroliter av lämpliga framåt och omvänd kvantitativa PCR primers för cytokiner av intresse och 2x fluorescerande grönt färgämne. Kör sedan den kvantitativa PCR under lämpliga parametrar och beräkna den relativa genuttrycket enligt standardprotokoll.Jämfört med vildtypsmöss uppvisar alfa-gustducin-knockoutmöss en allvarligare kolit med överdriven viktminskning, diarré och tarmblödning. Efter sju dagar av DSS administration, histologisk analys av kolon avsnitten avslöjar en mer förvärrad vävnad skador inom proximala, mellersta och distala kolon av knockout möss, jämfört med deras wildtype motsvarigheter. Denna överdrivna immunaktivering leder till induktion av kolit med en robust infiltration av olika inflammatoriska celler i knockout djurkolon som observerats av immunohistochemical analys.Ytterligare, kvantitativa PCR analys visar högre nivåer av TNF alfa och inferon gamma uttryck men lägre uttryck för IL-5, 10 och 13, i knockout jämfört med vilda typ mus kolon med ingen skillnad i TGF beta ett uttryck observerats. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att optimera textorous southvater natrium dosering och demonstration varaktighet. Vidarebefordra detta förfarande, andra metod som erhålla kultur kan utföras för att förstå ytterligare frågor som effekten av inflammation i tarmvävnad originering.Efter det utveckling, denna teknik banar ett sätt för forskare inom tarminflammation att utforska bidragen från genmutationer till svårighetsgraden av biodisease erodings och andra ryggradsdjur. Glöm inte att arbeta med sjukdom tarmvävnad och dess innehåll kan vara extremt farligt och återverkningar såsom bär saker som är lämpliga, personligt skydd permanent bör alltid tas när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut (Video) | JoVE

Trichuris Muris Infektion: En modell av typ 2 Immunitet och inflammation i tarmen

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation (Video) | JoVE

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites (Video) | JoVE

En musmodell för patogen-inducerad Kronisk inflammation vid lokala och system webbplatser

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein (Video) | JoVE

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen (Video) | JoVE

En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data (Video) | JoVE

Kortikal Actin Flow i T-celler kvantifieras genom Spatio-temporal bild korrelationsspektroskopi av Structured belysning mikroskopi Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model (Video) | JoVE

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells (Video) | JoVE

Precision-cut Mouse Lung skivor att visualisera Live Pulmonary dendritiska celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses (Video) | JoVE

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model för<em&gt; In vivo</em&gt; Långvarig övervakning av inflammatoriska reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...