Name: effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81671016, 31471008 ve 31661143030) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DC010012, DC015819) ve Siyuan Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Fareler içeren tüm deneylerin incelenmeli ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Zhejiang Üniversitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu iletişim kuralı kullanmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman giymek için tavsiye edilir.
1. fareler ve DSS hazırlık
<ol><li>Nakavt (α-gustducin- / -) fareler ve yaş-, cinsiyet ve vücut ağırlığı eşlemeli vahşi tipi kontrol tutmak (α-gustducin+ / +) C57BL/6 fareler temiz kafeslerde tek tek. Not: Na...

<ol>
	<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Bowel+Disease.">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li><li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS)-Induced+Colitis+in+Mice.">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li><li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat:+Advances+and+challenges.">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#947;13+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium.">G&#947;13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li><li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li><li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying.">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li><li>Bezen&#231;on, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells.">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li><li>Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease.">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li><li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)-induced+colitis+in+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+&#945;-gustducin.">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein &#945;-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li><li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system:+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells.">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).</li><li>Axelsson, L. -. G., Landstr&#246;m, E., Goldschmidt, T. J., Gr&#246;nberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+Effects+in+CD4+-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis:+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency.">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li></ol>

Bu yöntem quantitively için istihdam edilecek özel tat gen mutasyonlar etkisi iltihap DSS kaynaklı IBD fare modeli belirlemek. Tam olarak yararlanmak için en iyi indüksiyon IBD önemli bir adımdır. Kolit gelişimi fare zorlanma, konut çevre, barsak mikroflorası yanı sıra ilgi genler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından etkilenir. Bu fareler farklı dozlarda test etmek için az sayıda ve süreleri DSS yönetim ile bir pilot deneme gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Sırasında pilot den...

İltihabi bağırsak hastalığı (IBD), Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC) iki ana türde koşullarından kronik remittent ya da ilerici inflamatuar bağırsak multifaktöriyel etyoloji1,2 ile karakterizedir . IBD gelişimi diyet, antibiyotik kullanımı, genetik gibi belirli çevresel faktörlere bağlıdır ve önemlisi, patojenik enfeksiyonlar. Ancak, etyoloji ve IBD temel yasal moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal olarak indüklenen IBD hayvan modelleri inşa edilmiş ve patogenez ve düzenleyici mekanizmaları betimlemek ve insan tedavi3etkinliğini değerlendirmek için uygulanan.
Tat reseptörleri G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır ve iki önemli türü sınıflandırılır: tip ı (T1Rs) ve tatlı, umami ve acı bileşikleri algılayan II (T2Rs) yazın. Tat sinyal cascades tastant T1Rs veya T2Rs, heterotrimeric aktive α-gustducin ve Gβγ dimer oluşan ve Gβγ alt birimleri serbest bırakmak için önde gelen G protein bağlama tarafından başlatılır. Gβγ yan sırayla aşağı akım efektör enzim Fosfolifaz C-B2 (PLC-B2) uyarır. Aktif PLC-B2 sonra iki hücre içi ikincil haberci [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol] ve IP3 bağlanır içine phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate dag ve kanal-reseptör IP3 açmak R3, endoplazmik retikulum gelen kalsiyum iyonları serbest. Bu sonunda geçici reseptör potansiyel iyon kanal Trpm5 açılması ve serbest bırakmak-in nörotransmitter ATP tat sinirler4,5,6,7üzerine yol açar. Ancak, farklı ve bağımsız sinyal yollar tuzlu ve ekşi tadı tatlı, umami ve acı tadı8vardır. Buna ek olarak, tat GPCRs bileşenleri ve aşağı akım proteinler çeşitli ekstra oral dokularda mevcut. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu α-gustducin belirtilen, tat sinyal, asıl bileşen bulunan bağırsak mukoza ifade edilecek. Daha fazla çalışmaları ekstra oral doku9,10bileşenlerinde sinyal bu tadı işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.
Burada açıklanan yöntemi tat sinyal proteinlerin ekstra oral dokularda işlevleri tanımlamak için kullanılır. Biz kimyasal olarak bağlı kolit modeli ile damak tadınızı sinyal Cascade'lerde operasyona için geliştirilen bir transgenik fare çizgi birleştirmek. Yordam sadeliği ve insan ülseratif kolit patolojik benzerlikler nedeniyle büyük ölçüde, dextran (DSS) sodyum sülfat-indüklenen IBD modeli en yaygın olarak kullanılan çeşitli kimyasal olarak bağlı kolit modelleri11arasında. Bu çalışmada, α-gustducin-eksik fareler bir temsilcisi fare çizgi olarak α-gustducin roman fonksiyonları gut mukozal bağışıklık ve iltihap 1) morfolojik değişiklikler doku analiz ve 2) raporlaması ifade farklılıkları ortaya çıkarmak için kullandığımız sitokinler kolon iltihabı ile ilgili. Bu yöntem genler için genetik olarak değiştirilmiş fare hatları ne zaman nicelik ve nitelik tat sinyal proteinleri (ve diğer proteinlerin gut) doku hasarı ve bağırsak iltihabı, belirlemek için kullanılabilir faiz mevcuttur. Bu yöntemin avantajları, olanaklı kılmak kullanıcı-eylemleri hem kimyasal DSS ve gen ilgi eksikliği kaynaklanan entegre verileri elde etmek. Bu yöntem, hassasiyeti artırmak ve ince bağırsak değişiklikler, hücresel ve moleküler düzeyde ortaya çıkarmak için daha fazla geliştirilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="558">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Antibody</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B220</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly6G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-HRP complex</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>E607318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913850001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td>
			<td>Clontech,TaKaRa</td>
			<td>639574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instruments and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scissors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">staining jars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imag-Pro Plus&#160;</td>
			<td colspan="2">Media Cybernetics, Inc.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of taste signaling protein abolishment on gut inflammation in an inflammatory bowel disease mouse model

İltihabi bağırsak hastalığı (IBD) ülseratif kolit ve Crohn hastalığı, dünyanın her yerinden insanlar milyonlarca yaşam kalitesini etkileyen dahil bağışıklık ile ilgili gastrointestinal bozukluklar biridir. IBD belirtileri karın ağrısı, ishal ve rektal kanama, hangi gut microbiota, gıda bileşenleri, Bağırsak epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler neden olabilir içerir. Bağırsak epitel ve bağışıklık hücreleri ifade her anahtar gen kolon iltihabı nasıl etkileyeceğini değerlendirmek için önem taşımaktadır. G protein birleştiğinde tat reseptörleri G protein alt birimi α-gustducin ve sinyal diğer proteinler de dahil olmak üzere, bağırsaklarında bulduk. Burada, bir temsilcisi olarak α-gustducin kullanırız ve dextran sülfat sodyum (DSS) tarif-tat gen mutasyonlarının gut mukozal bağışıklık ve iltihap üzerindeki etkisini değerlendirmek için IBD modeli indüklenen. Bu yöntem gen nakavt teknoloji kimyasal olarak indüklenen IBD modeli ile birleştirir ve böylece yanı sıra exuberate ya da kolon DSS kaynaklı bağışıklık yanıtı nemlendirin diğer genler tat gen düşmesi sonucu değerlendirmek için uygulanabilir. Mutasyona uğramış fareler DSS ile hangi sırasında kendi vücut ağırlığı, dışkı ve rektal kanama izlenen kaydedildi ve belirli bir süre için uygulanmaktadır. Yönetimi sırasında farklı timepoints are euthanized bazı fareler, daha sonra boyutları ve ağırlıkları dalağı ve iki nokta üst üste ölçülür ve gut doku toplanan ve için işlenen histolojik ve gen ifade analizleri. Verileri bu aşırı kilo kaybı, ishal, bağırsak kanaması, doku hasarı ve iltihap vs. wild-tipi fareler α-gustducin nakavt sonuçları göster. İndüklenen enflamasyonu şiddeti fare suşları, konut çevre ve diyet tarafından etkilenir, DSS konsantrasyon ve yönetim süresi bir pilot deneyinde duruma getirilmesi özellikle önemlidir. Bu faktörler ayarlayarak, bu yöntem her iki anti - ve pro-inflamatuar etkileri değerlendirmek için uygulanabilir.

DSS kaynaklı IBD yordamı % 3 yöneten tarafından kurulmuştur DSS α-gustducin-nakavt (KO) ve vahşi-tipi (WT) fareler için içme suyu. WT fareler için karşılaştırıldığında, nakavt fareler daha şiddetli kolit aşırı kilo kaybı, ishal ve bağırsak (Şekil 1) kanama ile sergiledi. 7 gün DSS yönetim sonra doku bütünlüğü farklılıkları H & E histolojik yöntemi olarak boyama kullanarak analiz edildi ve daha ağırlaştırılmış doku h...

Watch this Scientific Journal Video about Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model at JoVE.com

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Burada dextran sülfat sodyum (DSS) bağışıklık yanıtı düşmesi tadına bakma ilgili genlerin etkisini araştırmak için bir protokol mevcut-inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) fare modeli indüklenen.

Protein Halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Bu yöntem ülseratif kolit ve Crohn hastalığı hakkında inflamatuar biyohastalık alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinyal proteinlerinin ilk anti ve proinfamtory etkilerini değerlendirmek için kullanılabilmesidir. Bu tekniğin etkisi yeni gelişmeler ve inflamasyon gaz anketi uzanır.Bu yöntem bağırsak iltihabı üzerinde genetik etkisi içine anlayışlar sağlayabilir rağmen. Ayrıca diyetler ve mikrobiyom gibi diğer faktörlere uygulanabilir. Genellikle, bu dönem için yeni bireyler hastalık skar dokusu işleme zor olduğu için mücadele edecek.Diseksiyon ve doku hazırlama adımları öğrenmek zor çünkü mistalia ve hücre dokusu yapıları değiştirilebilir bu yöntemin görsel gösteri önemlidir. Dekstran sülfat sodyum veya DDS kolit indüklemek için, düzenli içme suyu yerine 3%DSS çözeltisi, yedi gün boyunca lityum ekleyin. Her farenin gövde ağırlığının ölçülmesi, DSS çözüm tüketimi ve günlük dışkı üretimi.Yedi günlük tedavinin sonunda, fareyi supine pozisyonuna yerleştirin ve karında üç santimetre uzunluğunda orta hat kesisi yapmak için küçük makas kullanın. Hasat dalak ve boyutunu ölçmek. Sonra çevreleyen mezenter ayrılmasıiçin kolon kaldırmak için forseps kullanın.Ve çekum ve rektum görünür olana kadar tüm kolon ayıklayın. Kolonya kenarboşluğundaki dokuyu taşın. Ve proksimal ve distal kolon serbest pelvis içinde derin, sırasıyla.İzole edilmiş kolon uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Ve illuate temize kadar dışkı ve kan kaldırmak için buz soğuk PBS 10 mililitre ile kolon floş bir gavaj iğnesi ile donatılmış bir 10 mililitreşli şırınga kullanın. Histolojik tanımlama için doku örneklerini eşit büyüklükte proksimal, orta ve distal kesitlere bölün.Ve bir gecede 4 derece paraformaldehitteki dokuları 4 dereceye kadar düzeltin. İzole kolon dokusunun hematoksilin ve eozin boyama için, ertesi sabah, örneklerin kriyo koruması için tek tek 15 mililitretüplerde bir gecede% 30 sakaroz ve PBS doku parçaları batırın. Ertesi gün, en iyi kesme sıcaklığı veya OCT bileşik dokuları gömmek.Ve OKT sertleşene kadar eksi 20 santigrat derecede dokuları soğutun. OCT bloklarını kriyostat'a yerleştirin ve kalınlık kadranını 12 mikrometreye ayarlayın. Daha sonra cam mikroskop slaytlar üzerine 12 mikrometre kalınlığında dondurulmuş bölümleri dilimleyin ve toplayın.Tüm dokular kesitli olduğunda, 20 dakika boyunca bir sıcak tabakta 65 santigrat derece slaytlar ısıtın. Isıtılan bölümleri hematoksilin boyama solüsyonu ile beş dakika boyamadan önce distile suda kısa bir süre yıkayın. Fazla hematoksilin çözeltisini çıkarın ve musluk suyunda beş dakika çalıştırın.Ve 30 saniye boyunca etanol% 0.5 hidroklorik asit ile bölümleri ayırt, çalışan musluk suyu altında bir dakika durulayın takip. Ardından, pbs bir dakika boyunca örnekleri yıkayın. Ardından, akan musluk suyunun altında beş dakika daha yıkanır.Yıkamanın sonunda, dokuları artan bir etanol serisinde daldırma başına 10 saniye batırın. Ardından iki dakika boyunca eozinle lekelenme. Örneklerin dehidratasyonu için, slaytları %95 etanol ve iki değişiklik %100 etanolde daldırma başına beş dakika batırın.Ardından iki, beş dakikalık ksilen değişiklikleri ile takas. Daha sonra her deney grubunun proksimal, orta ve distal kolon doku hasarı puan. İmmünohistokimyasal analiz için, bölümleri sıcak tabakta 20 dakika ısıttınca, slaytları PBS'de üç kez yıkama başına 10 dakika yıkayın.Ve 10 dakika% 3 hidrojen peroksit kuluçka ile endojen peroksidaz ortadan kaldırmak. Kuluçka sonunda, numuneleri gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında en az bir saat boyunca tamponu bloke ederek spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Ardından, engelleme tamponu ile birincil antikor kokteylini değiştirin.4 santigrat derecede bir gecede kuluçka için. Ertesi sabah, aşırı primer antikor çözeltisi aspire ve PBS üç kez slaytlar yıkayın. Son yıkamadan sonra, uygun biyotinylated ikincil antikor kokteyli ile slaytlar inkübün.Oda sıcaklığında streptavidin horseradish peroksidaz kompleksi ile etiketleme izledi. İmmünoreaktif hücreleri görselleştirmek için, açık veya koyu kahverengi renk gelişene kadar örnekleri DAB ile etiketleyin. Ve hematoksilin ve% 0.3 seyreltilmiş amonya ile kesitler karşı leke.Slaytlar kuruduğunda, 10x büyütme altında doku bölümlerinin parlak alan görüntülerini elde etmek için bir ışık mikroskobu kullanın. Ve epitel ve lamina propria hem de işaretli bağışıklık hücrelerinin popülasyonu tanımlamak ve ölçmek için bir görüntü işleme programı kullanın. DSS tedavi kolonlarda gen ekspresyonu analizi için, standart RNA ekstraksiyon protokollerine göre eksi 80 santigrat derece çözülmüş kolon doku örneklerinden RNA ayıklayın.Ve 20 milimolar oligo deoksitimidin 12 ile 18 astar ve moloney murine lösemi virüsü ters transkriptaz bir mikrolitre 2.5 mikrolitre ile toplam RNA ile bir mikrogram karıştırın. 42 santigrat derecede 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, cDNA'nın bir mikrolitresini, ilgi nin sitokineleri ve 2x floresan yeşil boya için uygun ileri ve ters nicel PCR astarlarının %0,5 mikrolitresiyle karıştırın. Daha sonra nicel PCR'yi uygun parametreler altında çalıştırın ve göreli gen ekspresyonunu standart protokollere göre hesaplayın.Wildtype fareler ile karşılaştırıldığında, alfa gustducin nakavt fareler aşırı kilo kaybı ile daha şiddetli bir kolit sergilemek, ishal ve bağırsak kanaması. DSS uygulamasından yedi gün sonra, kolon bölümlerinin histolojik analizi nakavt farelerin proksimal, orta ve distal kolonlarında yabani tip benzerlerine göre daha ağırlaştırılmış doku hasarı ortaya koymaktadır. Bu aşırı immün aktivasyon immünohistokimyasal analiz ile gözlenen nakavt hayvan kolon çeşitli inflamatuar hücrelerin sağlam bir infiltrasyon ile kolit indüksiyon yol açar.Ayrıca, kantitatif PCR analizi TGF beta bir ekspresyon hiçbir fark ile wildtype fare kolonları ile karşılaştırıldığında, eleme de, TNF alfa ve inferon gama ekspresyonu daha yüksek düzeyde gösterir ama IL-5, 10 ve 13 daha düşük ifade gösterir. Bu prosedürü çalışırken, bu metin southvater sodyum dozajı ve gösteri süresi optimize etmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü niçin iletme, bağırsak dokusu kaynaklı iltihabın etkisi gibi ek soruları anlamak için kültür edinme gibi başka bir yöntem de uygulanabilmekte.Bu teknik, geliştirilmeden sonra, bağırsak iltihabı alanında araştırmacılar ın gen mutasyonlarının biyohastalık erozyonlarının ve diğer omurgalıların şiddetine olan katkılarını keşfetmelerinin bir yolunu aramaktadır. Hastalık bağırsak dokusu ve içeriği ile çalışan son derece tehlikeli olabilir ve uygun şeyler giyen gibi yankıları unutmayın, kişisel koruma kalıcı bu işlemi yaparken her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...