Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
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作者感谢卡洛林斯卡研究所明围流康复医学中心的陈嘉诚的技术支持。S. X. 感谢瑞典研究理事会的支持 (2017-06344 号批准)。

1. 凝胶的制备
注: 演示遵循标准协议, 在 SDS-PAGE12之后不久准备凝胶染色。简单地说, 下面的步骤描述了样品的制备和凝胶电泳。
<ol><li>使用含有 2-(n-吗啡) 乙醇磺酸 (mes) 缓冲液 (mes) 的微型凝胶罐, 使用 4%-12% 的 bis-tris蛋白凝胶 (1 毫米, 15 孔) 进行 SDS-PAGE。</li>
	<li>用蒸馏水、硫酸锂 (LDS) 缓冲液和样品还原剂混合稀释样品。</li>
	<li>加载第一车道的库存?...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

本文介绍了一种新的聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质荧光银染色方法。这种策略集成了传统的银渍和荧光污渍。染色利用银离子与其他银渍中的蛋白质的选择性结合, 但采用了高度敏感的荧光银探针Tpe-4ta 来点燃银结合蛋白。由于荧光探针Tpe-4ta 可以在纳米摩尔范围11中以相当低的浓度检测银离子, 因此它能够进行高度敏感的检测, 而无需进一步要求传统中需要的...

许多染色方法已被用来可视化蛋白质凝胶电泳后, 例如使用比色染料, 如铜丝明亮蓝, 银染色, 荧光, 或放射性标记1,2,3 个,4. 银染色被认为是蛋白质检测最敏感的技术之一, 需要简单和廉价的试剂。它可分为两个主要的家庭: 氨银染色和硝酸银染色5,6。在碱性氨基银法中, 用氨和氢氧化钠生产银-二胺复合物, 并在开发过程中使用酸性甲醛溶液还原为金属银。该染色可有效地适应基本蛋白质, 但对酸性和中性蛋白表现出的性能受到损害, 而且仅限于经典的甘氨酸和牛磺酸电泳系统。相比之下, 硝酸银污渍利用了银离子对蛋白质的高生物亲和力, 主要是侧链中的磺基和羧基, 并倾向于更有效地染色酸性蛋白质 7.银离子结合后, 开发中的溶液 (通常由含有甲醛和硫代硫酸钠的金属碳酸盐溶液制成) 被用来减少银离子对金属银粒, 这就建立了一个棕色到深色的可视化蛋白带。
虽然银染色自1970年代8以来一直以其多功能性和高灵敏度而闻名, 但这种方法经常被认为是棘手的。银染法具有时间限制的步骤, 重现性低。由于银染色的颜色通常不均匀, 依赖于还原步骤, 这是很难控制的, 银染色不是一个定量的方法, 因此, 不建议用于凝胶比较研究和蛋白质定量9。在灵敏度上优化的方法可以利用醛, 这也可以提供更均匀的染色10。然而, 这是以牺牲进一步的下游分析为代价的, 因为蛋白质通过醛的交联。快速协议大多结合或缩短步骤, 以减少时间, 损害了染色的重现性和均匀性5。因此, 在蛋白质凝胶染色中有许多银染色变种, 每一种都经过优化, 以满足某些要求;例如, 用于下游分析的简单性、灵敏度或肽回收率。这些属性也可能对彼此产生影响, 在一个协议中满足所有要求可能会很困难。
本文介绍了一种新的聚丙烯酰胺凝胶蛋白质检测荧光银染色方法。在这种方法中, 我们使用了银离子的荧光探针Tpe-4ta (图 1), 以可视化浸银的蛋白质11。Tpe-4ta是根据聚合诱导发射 (aie) 原理设计的。它在水溶液中溶解时不具有发射性, 但在银离子存在的情况下具有高度的发射性。荧光银方法取代了传统银污渍中的显色发育, 从而使总蛋白质在减少背景的情况下进行了鲁棒染色。
此外, 荧光银染色在蛋白质定量方面表现出良好的动态线性范围, 与广泛使用的 SYPRO 红宝石染色相当, 与传统的银染色无法实现。这种凝胶可以在许多生物实验室的常用凝胶文档系统上成像 (激发波长: 302165nm 通道; 发射: ~ 490-530 nm)。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

银染色是一种比色技术, 广泛用于可视化聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质带, 遵循十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。经典的银渍有一定的缺点, 如背景染色高、蛋白质恢复不良、重现性差、定量线性动态范围窄、与质谱 (MS) 的相容性有限。现在, 利用氟生成银 + 探针 Tpe-4ta ,我们开发了一种荧光银染色方法, 用于聚丙烯酰胺凝胶中的总蛋白可视化。这种新的污渍避免了传统银渍中麻烦的银还原步骤。此外, 荧光银染色在蛋白质检测中具有良好的重现性、灵敏度和线性定量性, 是一种实用的蛋白质凝胶染色。

荧光银染色所染色的蛋白质带在365纳米紫外线灯下表现出强烈的绿色荧光。所有14个蛋白质带 (10-200 kDa), 从上到下, 都是清晰可见的, 与 SYPRO 红宝石染料染色的14个红色蛋白带 (图 2)10有很好的相关性。
在定量蛋白质检测方面, 利用全自动程序对凝胶进行了凝胶成像系统的成像, 并利用商业...

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

在这里, 我们描述了一个详细的协议, 概述了一种新的荧光染色技术的总蛋白检测在聚丙烯酰胺凝胶。该协议采用了银离子特异性荧光开启探针, 可检测银+蛋白复合物, 并消除了传统的铬性银渍的某些限制。

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的荧光银染色

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

这是一种新型的凝胶染色方法，利用氟化银探针将传统的银染色转化为荧光银染色。与传统的硝酸银染色和SYPRO Ruby染色相比，该方法的性能有所提高，同时使用简单明了的不无醛化剂的协议。演示这个程序的将是AlexWong，一个来自我实验室的研究助理。要开始此过程，请用含有蒸馏水、LDS 缓冲液和样品还原剂的溶液稀释蛋白质样品。设置一个装满 MES 缓冲液的迷你凝胶罐，使用 4-12% 的 Bis-Tris 蛋白凝胶执行 SDS-PAGE。用准备好的蛋白质样品装载油井，然后以200伏的恒定电压运行凝胶30分钟。电泳后，将凝胶淹没在含有乙醇和醋酸的100毫升溶液中，在轨道摇床上孵育两次，每次在室温下孵育30分钟，同时在50转/时摇动。接下来，用超纯水在干净的容器中清洗凝胶三次，每次洗涤持续10分钟。首先，将0.01克硝酸银溶解在10毫升的超纯水中，以准备浓度为0.1%的库存溶液，将100微升的库存溶液加入100毫升的超纯水中，使硝酸银成为工作溶液。在烟罩中，将凝胶淹没在 100 毫升的硝酸银工作溶液中，放在密封的玻璃室中。使用铝箔保护凝胶在浸渍期间免受光线影响，并在轨道摇床上以 50 rpm 转速摇晃时孵育一小时。之后，用超纯水在干净的容器中清洗凝胶两次，每次洗涤使用约100毫升的水，持续60秒。在银浸渍步骤后，使用超纯水清洁凝胶非常重要，以尽量减少背景染色。首先，在3毫克TPE-4TA染料中加入50毫升的超纯水。在每次声波处理会话之间对溶液进行三分钟的声波化，并添加五升一摩尔氢氧化钠溶液，以帮助溶解染料，通常多达三次。然后在 365 纳米紫外线灯下检查溶液的荧光，确保染料完全溶解。只有弱或非发射解决方案才表示完全溶解。为了准备氟原化开发溶液，在90毫升超纯水中加入10毫升的TPE-4TA库存溶液。使用 pH 计检查溶液的 pH 值。使用稀释的氢氧化钠溶液或醋酸（如果pH值超过范围）将溶液调整为7至9之间的pH值。接下来，将凝胶转移到一个清洁和密封的容器中，其含 100 毫升的氟化开发溶液，并确保凝胶完全浸入。密封容器并盖住容器，防止其发光。在转速为 50 rpm 且室温下在轨道摇床上摇动容器过夜。将凝胶转移到一个干净的容器中，在100毫升10毫升的10%乙醇中脱盐30分钟。然后在超纯水中冲洗凝胶五分钟。凝胶可以在台式透光器上可视化，或在 365 纳米通道或 302 纳米通道的凝胶文档机器上成像。本研究采用一种新型荧光银染色方法染色聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。荧光银污渍染色的蛋白质带在365纳米的紫外线灯下呈现出强烈的绿色。所有 14 个蛋白波段都清晰可见，并且与 SYPRO Ruby 染料染色的红颜色带关联良好。这种荧光银染色方法似乎有高分辨率。对于某些蛋白带，荧光银染色的灵敏度也略好于荧光SYPRO Ruby染色的灵敏度。特别是这种染色的性能在10至40千吨之间的蛋白质带得到了改善，这表明新方法对于检测分子量低的蛋白质特别有用。从可以看到，数据还表明，荧光银染色在相对广泛的蛋白质定量范围内，为所有14种蛋白质提供了良好和均匀的线性度。虽然硝酸银染色提供了高水平的背景信号和扭曲的峰值，但荧光银染色检测到的带子具有良好的对比度和均匀的强度分布，可在所有 14 种蛋白质上与 SYPRO Ruby 染色相媲美。洗涤步骤很重要，因为它们限制了残留固定溶液，扰乱了银浸渍或氟原源发育。使用硝酸银时，避免皮肤接触。立即清除任何溢出物。穿防护服和手套，作为化学废物处理。

Research

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