Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Patrick Chan på Ming Wai Lau centrum for Reparative medicin, Karolinska Institutet, for hans teknisk support. S. X. er taknemmelig for støtten fra det svenske Forskningsråd (Grant No. 2017-06344).

1. forberedelse af Gel
Bemærk: Demonstrationen følger en standardprotokol for at forberede gel til farvning kort efter SDS-PAGE12. I korte træk følgende trin beskriver forberedelse af prøver og gel elektroforese.
<ol><li>Udføre SDS-PAGE med 4% - 12% Bis-Tris protein geler (1 mm, 15-godt) ved hjælp af en mini gel tank fyldt med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer.</li>
	<li>Fortynd prøver med en blanding af destilleret vand, lithium dode...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Præsenteres her er en roman fluorescerende sølv farvning metode til proteiner i polyacrylamidgeler. Denne strategi integreres konventionel sølv pletter og fluorescerende pletter. Farvning udnytter den selektive binding af sølv ion til proteiner som i andre sølv pletter men beskæftiger en yderst følsom fluorogenic sølv sonde TPE-4TA til at lyse op de sølv bundne proteiner. Da fluorogenic sonde TPE-4TA kan fornemme sølv ioner i en forholdsvis lav koncentration i nanomolar vifte<s...

Mange farvning metoder har været brugt til at visualisere proteiner efter gelelektroforese, for eksempel ved hjælp af kolorimetriske farvestoffer såsom Coomassie strålende blå, sølv plet, fluorescens, eller radioaktive mærkning1,2, 3 , 4. sølv farvning anses for at være en af de mest følsomme teknikker til protein registrering kræver enkle og billige reagenser. Det kan inddeles i to store familier: den ammoniakalsk sølv plet og sølv nitrat pletten5,6. I basisk ammoniakalsk sølv metode, er sølv-diamin komplekset produceret med ammoniak og natriumhydroxid og reduceret til metallisk sølv under udvikling ved hjælp af en sure formaldehyd løsning. Pletten rummer effektivt for grundlæggende proteiner, men viser en kompromitteret ydeevne for sure og neutral proteiner og er desuden begrænset til klassisk glycin og taurin elektroforese systemer. I sammenligning, sølv nitrat pletter udnytte det høje bio-affinitet af sølv ioner til protein, primært sulfhydryl og carboxyl grupper fra sidekæder, og har tendens til at plette sure proteiner mere effektivt7. Efter sølv ion bindende, en udviklende løsning (typisk lavet af en metal karbonat løsning som indeholder formaldehyd og natrium thiosulfat) er anvendt til at reducere sølv-ioner til metallisk sølv korn, som opbygger en brun til mørk farve til at visualisere den protein bands.
Selvom sølv farvning har været kendt for sin alsidighed og høj følsomhed siden sin udvikling i 1970s8, er metoden ofte betragtes som vanskelig. Sølv-farvning metoder har tid-begrænset trin og vise lav reproducerbarhed. Da farven på sølv plet ikke er normalt ensartede og afhængige af trinnet reduktion, som er svært at styre, den sølv plet er ikke en kvantitativ metode og således anbefales ikke til gel sammenligning undersøgelse og protein kvantificering9. Metoder optimeret i følsomhed kan udnytte aldehyder, som også kan give en mere ensartet farvning10. Dette er dog på bekostning af videre downstream analyse på grund af crosslinking af proteiner af aldehyder. Hurtig protokoller for det meste kombinere eller forkorte trin for at reducere tid, at kompromittere reproducerbarhed og ensartethed af pletten5. Som et resultat, er der talrige sølvfarvning varianter inden for protein gel farvning, hver optimeret passer til visse krav; for eksempel, enkelhed, følsomhed eller peptid genfindingsprocenten for downstream analyse. Disse attributter kan også have en indvirkning på hinanden, og opfylder alle krav i en protokol kan være svært.
I dette arbejde introducerer vi en ny fluorescerende sølvfarvning metode til påvisning af protein i polyacrylamid gel. I denne metode bruger vi en fluorogenic sonde til sølv ioner, TPE-4TA (figur 1), til at visualisere sølv-imprægneret proteiner11. TPE-4TA er designet af sammenlægning-induceret emission (Bjarne) princippet. Det er ikke-emissive når opløst i en vandig opløsning, men er meget emissive i nærværelse af sølv ioner. Ved at erstatte den kromogent udvikling i traditionelle sølv pletter med en fluorogenic udvikle skridt, giver den fluorescerende sølv metode robust farvning af samlede proteiner med en mindre baggrund.
Desuden, den fluorescerende sølv plet viste en god lineær dynamikområde for protein kvantificering, som er sammenlignelige med de udbredte SYPRO Ruby pletten og ikke kan opnås med traditionelle sølv pletter. Gelen kan være afbildet på almindeligt anvendte gel dokumentationssystemer med en ultraviolet lampe (excitation bølgelængde: 302/365 nm kanal; emission: ~ 490-530 nm) på mange biologiske laboratorier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

Sølv farvning er en kolorimetrisk teknik udbredt at visualisere protein bands i polyacrylamidgeler efter sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). De klassiske silver pletter har visse ulemper, såsom høj baggrund farvning, dårlig protein opsving, lave reproducerbarhed, et smalt lineære dynamikområde til kvantificering og begrænset kompatibilitet med massespektrometri (MS). Nu, med brug af en fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, vi udviklet en fluorescerende sølvfarvning metode for total protein visualisering i polyacrylamidgeler. Denne nye pletten undgår besværlige sølv reduktion trin i traditionelle sølv pletter. Desuden, den fluorescerende sølv plet viser god reproducerbarhed, følsomhed og lineær kvantificering dobbel­ protein, hvilket gør det en nyttig og praktisk protein gel pletten.

Protein bands plettet af fluorescerende sølv pletten udviser en intens grøn fluorescens under en 365 nm UV-lampe. Alle 14 protein bands (10-200 kDa), var fra top til bund, klart synlige, korrelerede godt med 14 rød-farvede dem farves af SYPRO Ruby farvestof (figur 2)10.
Med hensyn til kvantitativ protein påvisning, geler blev afbildet af en gel imaging system ved hjælp a...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Her beskriver vi en detaljeret protokol skitserer en ny fluorescerende farvning teknik til påvisning af total protein i polyacrylamidgeler. Protokollen udnytter en sølv ion-specifikke fluorescens turn-on sonde, som registrerer Ag+-proteinkomplekser, og fjerner visse begrænsninger af traditionelle kromogent sølv pletter.

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Dette er en ny gel-farvning metode, der udnytter en fluorogen sølv sonde til at konvertere den traditionelle sølv farvning i en fluorescerende sølv farvning. Denne metode viste forbedret ydeevne sammenlignet med konventionel sølv nitrat farvning og SYPRO Ruby farvning, mens du bruger en enkel og ligetil protokol uden aldehyder. Demonstration af proceduren vil være Alex Wong, en forskningsassistent fra mit laboratorium.For at begynde denne procedure fortyndes proteinprøverne med en opløsning, der indeholder destilleret vand, LDS-buffer og et prøvereducerende middel. Opret en mini gel tank fyldt med MES buffer til at udføre SDS-PAGE med en 4-12% Bis-Tris protein gel. Læg brøndene med den forberedte proteinprøve, og kør derefter gelen ved en konstant spænding på 200 volt i 30 minutter.Efter elektroforese nedsænkes gelen i en 100-milliliteropløsning indeholdende ethanol og eddikesyre på en orbitalshasker, og inkuberes to gange i 30 minutter hver ved stuetemperatur, mens den ryster ved 50 omdrejninger i minuttet. Dernæst vaskes gelen tre gange med ultrarent vand i en ren beholder med hver vask, der varer 10 minutter. Først opløses 0,01 gram sølvnitrat i 10 milliliter ultrarent vand for at forberede en stockopløsning med en koncentration på 0,1%Tilsæt 100 mikroliter af stockopløsningen i 100 milliliter ultrarent vand for at gøre sølvnitratarbejdsopløsningen.I en røghætte nedsænkes gelen i 100 milliliter af sølvnitratarbejdsopløsningen i et forseglet glaskammer. Brug aluminiumsfolie til at beskytte gelen mod lys under imprægnering og inkubere i en time, mens du ryster ved 50 omdrejninger i minuttet på en orbital shaker. Herefter vaskes gelen to gange med ultrarent vand i en ren beholder, hvor hver vask vaskes med ca. 100 milliliter vand og varer 60 sekunder.Det er vigtigt at bruge ultrarent vand til at rense gelen efter sølvimprægnationstrinnet for at minimere baggrundsfarvning. Først tilsættes 50 milliliter ultrarent vand til tre milligram TPE-4TA farvestof. Sonikere opløsningen i tre minutter og tilsæt fem mikroliter af en-molar natriumhydroxidopløsning mellem hver sonikeringssession for at hjælpe med at opløse farvestoffet, normalt op til tre gange.Kontroller derefter fluorescensen af opløsningen under en 365-nanometer UV-lampe for at sikre, at farvestoffet er helt opløst. Kun svage eller ikke-emissive opløsninger indikerer fuld opløsning. For at forberede den fluorogene udviklingsopløsning tilsættes 10 milliliter TPE-4TA-lageropløsningen til 90 milliliter ultrarent vand.Brug en pH-måler til at kontrollere opløsningens pH-3D.H. Opløsningen indstilles til en pH-værdi mellem 7 og 9 ved hjælp af fortyndet natriumhydroxidopløsning eller eddikesyre, hvis pH-chlor. Dernæst overføre gelen til en ren og forseglelig beholder med 100 milliliter af fluorogene udviklende opløsning og sikre, at gelen er helt nedsænket.Forsegle beholderen og dække den for at beskytte den mod lys. Ryst beholderen natten over på en orbital shaker ved 50 omdrejninger i minuttet og ved stuetemperatur. Overfør gelen til en ren beholder og destain det i 100 milliliter 10% ethanol i 30 minutter.Skyl derefter gelen i ultrarent vand i fem minutter. Gelen kan visualiseres på en benchtop transilluminator eller afbildet på en gel dokumentation maskine på 365-nanometer kanal eller 302-nanometer kanal. I denne undersøgelse, en roman fluorescerende sølv farvning metode bruges til at plette proteiner i polyacryamid geler.Proteinet bands farves af fluorescerende sølv pletten udviser en intens grøn under en 365-nanometer UV-lampe. Alle 14 proteinbånd er tydeligt synlige og korrelerer godt med de rødfarvede bånd, der farves af SYPRO Ruby-farvestoffet. Denne fluorescerende sølv farvning metode synes at have en høj opløsning.For nogle proteinbånd er følsomheden af fluorescerende sølvplet også lidt bedre end fluorescerende SYPRO Ruby pletten. Især er ydeevnen af denne plet forbedret for proteinbåndene mellem 10 og 40 kilodalton, hvilket indikerer, at den nye metode er særlig nyttig til påvisning af proteiner med lav molekylvægt. Som det fremgår, tyder dataene også på, at fluorescerende sølvplet giver en god og ensartet linearitet for alle 14 proteiner over en relativt bred vifte af protein kvantificering.Mens sølvnitratpletten gav et højt niveau af baggrundssignal og forvrængede toppe, opdagede den fluorescerende sølvplet båndene med god kontrast og ensartet intensitetsfordeling, der kan sammenlignes med SYPRO Ruby-pletten på tværs af alle 14 proteiner. Vasketrin er vigtige, da de begrænser restfikseringsopløsningen fra forstyrrende sølvimprægnation eller fluorogen udvikling. Undgå hudkontakt ved brug af sølvnitrat.Rengør straks eventuelle spild. Bær beskyttelsesbeklædning og handsker, og bortskaf som kemisk affald.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering af Multi-subunit proteinkomplekser af menneskelig MxA Brug ikke-denaturering Polyacrylamid Gel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spændingsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjælp af fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur løsning af fluorescerende proteiner Cerulean ved hjælp af MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerende visualisering af mango-Tagged RNA i polyacrylamid gels via en Poststaining metode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakteriserecellulære proteiner med in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support