Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Patrick Chan au Ming Wai Lau Centre pour la médecine réparatrice, Karolinska Institutet, pour son soutien technique. S. X. est reconnaissante pour le soutien du Conseil de recherche suédois (Grant No. 2017-06344).

1. préparation du Gel
Remarque : La démonstration suit un protocole standard utilisé pour préparer le gel pour une coloration peu après SDS-PAGE12. En bref, les étapes suivantes décrivent la préparation des échantillons et électrophorèse sur gel.
<ol><li>Effectuer des SDS-PAGE avec des gels de protéines de Bis-Tris (1 mm, 15 puits) 4-12 % à l’aide d’un gel mini réservoir rempli de 2-(N -morpholino) tampon d’ethanesulfonic acide (MES).</li...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Présenté ici est un roman d’argent fluorescent coloration PROCEDE de protéines dans les gels de polyacrylamide. Cette stratégie intègre les taches argent classiques et taches fluorescentes. Les exploits de coloration la liaison sélective d’ions d’argent aux protéines comme dans l’autre argent taches mais emploie un argent fluorogène hautement sensible sonde TPE-4TA pour éclairer les protéines liées argent. Étant donné que la sonde fluorogène TPE-4TA peut détecter d...

Plusieurs méthodes de coloration ont été utilisées pour visualiser les protéines après électrophorèse sur gel, par exemple à l’aide de colorants colorimétriques tels que le bleu de Coomassie brillant bleu, tache argentée, fluorescence, ou radioactifs étiquetage1,2, 3 , 4. coloration à l’argent est considérée comme une des techniques plus sensibles pour la détection de protéines nécessitant des réactifs simples et bon marchés. Il peut être classé en deux grandes familles : la tache d’argent ammoniacale et le nitrate d’argent tachent5,6. Dans la méthode argentée ammoniacale alcaline, le complexe de l’argent-diamine est produit avec l’ammoniac et de l’hydroxyde de sodium et réduit à argent métallique au cours du développement à l’aide d’une solution de formaldéhyde acides. La tache peut accueillir efficacement pour les protéines basiques mais montre un compromis performances pour les protéines acides et neutres et est en outre limité à classique glycine et taurine systèmes électrophorétiques. En comparaison, les taches de nitrate d’argent a exploiter la bio-affinité élevée d’ions d’argent aux protéines, principalement les sulfhydryles carboxyle groupes de chaînes latérales et ont tendance à tacher les protéines acides plus efficacement7. Après ion argent contraignant, une solution en développement (généralement en une solution de carbonate de métal contenant du thiosulfate de sodium et de formaldéhyde) est appliquée afin de réduire les ions d’argent aux grains d’argent métalliques, qui s’accumulent d’une couleur brun-foncé à visualiser la bandes de protéines.
Bien que la coloration à l’argent est bien connue pour sa polyvalence et sa sensibilité élevée depuis son développement dans les années 19708, la méthode est souvent considérée comme difficile. Méthodes de coloration à l’argent ont des mesures limitées dans le temps et montrent faible reproductibilité. Étant donné que la couleur de la tache argentée n’est généralement pas uniforme et dépend de l’étape de réduction, ce qui est difficile à contrôler, la tache argentée n’est pas une méthode quantitative et, ainsi, pas recommandé pour gel comparaison étude et protéine quantification9. Méthodes optimisées de sensibilité peuvent utiliser des aldéhydes peuvent également indiquer un uniforme plus coloration10. Cependant, c’est au détriment d’une analyse plus poussée en aval en raison de la réticulation des protéines par des aldéhydes. Protocoles rapides surtout combinent ou raccourcir des étapes pour réduire le temps, compromettre la reproductibilité et l’uniformité de la tache5. En conséquence, il y a nombreux argent souillant des variantes à l’intérieur de gel de protéine, coloration, chacun optimisé pour répondre à certaines exigences ; par exemple, simplicité, sensibilité ou peptide taux de récupération pour l’analyse en aval. Ces attributs peuvent également avoir une incidence sur l’autre, et satisfaire toutes les exigences dans un seul protocole peut s’avérer difficile.
Dans ce travail, nous introduisons une nouvelle méthode pour la détection des protéines en gel de polyacrylamide de coloration à l’argent fluorescent. Dans cette méthode, nous utilisons une sonde fluorogène d’ions d’argent, TPE-4TA (Figure 1), pour visualiser les protéines imprégnées d’argent11. TPE-4TA est conçu selon le principe de l’émission induite par l’agrégation (AIE). Il est non-émissif dissous dans une solution aqueuse, mais est fortement émissif en présence d’ions d’argent. En remplaçant le développement chromogène en taches argent traditionnels par un fluorogène développer étape, la méthode argentée fluorescente permet la coloration robuste des protéines totales avec une formation réduite.
En outre, la tache argentée fluorescente a montré une bonne gamme dynamique linéaire pour la quantification des protéines, qui est comparable avec la tache de SYPRO Ruby largement utilisé et non réalisable avec des taches argent traditionnels. Le gel peut être photographié sur les systèmes de documentation gel couramment utilisés avec une lampe ultraviolette (longueur d’onde excitation : canal de 302/365 nm ; émission : ~ 490-530 nm) à plusieurs laboratoires de biologie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

Coloration à l’argent est une technique colorimétrique largement utilisée pour visualiser les bandes de protéines dans les gels de polyacrylamide après électrophorèse sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE). Les taches argent classiques ont certains inconvénients, comme le haut fond de coloration, de recouvrement de mauvaises protéines, faible reproductibilité, une gamme dynamique linéaire étroite pour la quantification et une compatibilité limitée avec la spectrométrie de masse (MS). Maintenant, avec l’utilisation d’une sonde de fluorogène Ag+ , TPE-4TA, nous avons développé une coloration méthode pour la visualisation de protéines totales dans les gels de polyacrylamide fluorescent à l’argent. Cette nouvelle tache évite l’étape pénible réduction argent en taches argent traditionnels. En outre, la tache argentée fluorescente montre bonne reproductibilité, une sensibilité et une quantification linéaire dans la détection de protéines, ce qui en fait une tache de gel de protéines utiles et pratiques.

Les bandes de protéines colorées par la tache argentée fluorescente présentent une fluorescence vert intense sous une lampe à UV 365 nm. Toutes les bandes de protéines 14 (10-200 kDa), de haut en bas, étaient clairement visibles, en corrélant bien avec 14 ceux rouge taché par le SYPRO Ruby colorant (Figure 2)10.
Concernant la détection de protéines quantitative, le...

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Nous décrivons ici un protocole détaillé décrivant un fluorescent nouvelle coloration pour la détection de protéines totales dans les gels de polyacrylamide. Le protocole utilise une sonde de turn-on argent ionique spécifique fluorescence, qui permet de détecter Ag+-complexes de protéine et élimine certaines limitations des taches argent chromogène traditionnels.

Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Il s’agit d’une nouvelle méthode de coloration du gel qui utilise une sonde fluorogène en argent pour convertir la coloration traditionnelle en argent en colorant en argent fluorescent. Cette méthode a montré des performances améliorées par rapport à la coloration conventionnelle de nitrate d’argent et la coloration rubis SYPRO tout en utilisant un protocole simple et simple sans aldéhydes. Alex Wong, assistant de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer cette procédure, diluer les échantillons de protéines avec une solution contenant de l’eau distillée, tampon LDS, et un agent réducteur d’échantillons. Installez un mini réservoir de gel rempli de tampon MES pour effectuer SDS-PAGE avec un gel protéique Bis-Tris de 4 à 12 %. Chargez les puits avec l’échantillon de protéines préparé, puis exécutez le gel à une tension constante de 200 volts pendant 30 minutes.Après l’électrophoresis, submerger le gel dans une solution de 100 millilitres contenant de l’éthanol et de l’acide acétique sur un shaker orbital et incuber deux fois pendant 30 minutes chacun à température ambiante tout en secouant à 50 rpm. Ensuite, lavez le gel trois fois avec de l’eau ultrapure dans un récipient propre avec chaque lavage d’une durée de 10 minutes. Tout d’abord, dissoudre 0,01 grammes de nitrate d’argent dans 10 millilitres d’eau ultrapure pour préparer une solution de stock avec une concentration de 0,1%Ajouter 100 microlitres de la solution de stock en 100 millilitres d’eau ultrapure pour faire la solution de travail nitrate d’argent.Dans une hotte à vapeur, submerger le gel en 100 millilitres de la solution de travail au nitrate d’argent dans une chambre en verre scellé. Utilisez du papier d’aluminium pour protéger le gel de la lumière pendant l’imprégnation et incuber pendant une heure tout en secouant à 50 rpm sur un shaker orbital. Après cela, laver le gel deux fois avec de l’eau ultrapure dans un récipient propre, chaque lavage utilisant environ 100 millilitres d’eau et d’une durée de 60 secondes.Il est important d’utiliser de l’eau ultrapure pour nettoyer le gel après l’étape d’imprégnation d’argent afin de minimiser les taches de fond. Tout d’abord, ajouter 50 millilitres d’eau ultrapure à trois milligrammes de teinture TPE-4TA. Sonicate la solution pendant trois minutes et ajouter cinq microlitres de solution hydroxyde de sodium une molaire entre chaque séance de sonication pour aider à dissoudre le colorant, généralement jusqu’à trois fois.Vérifiez ensuite la fluorescence de la solution sous une lampe UV de 365 nanomètres pour vous assurer que le colorant est complètement dissous. Seules les solutions faibles ou non emissives indiquent une dissolution complète. Pour préparer la solution de développement fluorogène, ajoutez 10 millilitres de la solution de stock TPE-4TA à 90 millilitres d’eau ultrapure.Utilisez un compteur de pH pour vérifier le pH de la solution. Accordez la solution à un pH entre 7 et 9, à l’aide d’une solution diluée d’hydroxyde de sodium ou d’acide acétique si le pH est hors de portée. Ensuite, transférez le gel dans un récipient propre et étanche avec 100 millilitres de la solution de développement fluorogène et assurez-vous que le gel est complètement immergé.Scellez le récipient et couvrez-le pour le protéger de la lumière. Secouez le récipient pendant la nuit sur un shaker orbital à 50 rpm et à température ambiante. Transférer le gel dans un récipient propre et le détenir en 100 millilitres de 10% d’éthanol pendant 30 minutes.Rincez ensuite le gel à l’eau ultrapure pendant cinq minutes. Le gel peut être visualisé sur un transilluminateur benchtop ou photographié sur une machine de documentation de gel au canal de 365 nanomètres ou au canal de 302 nanomètres. Dans cette étude, une nouvelle méthode fluorescente de coloration d’argent est employée pour tacher des protéines dans des gels de polyacrylamide.Les bandes protéiques tachées par la tache d’argent fluorescent présentent un vert intense sous une lampe UV de 365 nanomètres. Les 14 bandes protéiques sont clairement visibles et sont bien corrélées avec les bandes de couleur rouge tachées par le colorant Rubis SYPRO. Cette méthode de coloration d’argent fluorescent semble avoir une haute résolution.Pour certaines bandes protéiques, la sensibilité de la tache d’argent fluorescent est également légèrement meilleure que celle de la tache fluorescente SYPRO Ruby. En particulier, les performances de cette tache sont améliorées pour les bandes protéiques comprises entre 10 et 40 kilodaltons, ce qui indique que la nouvelle méthode est particulièrement utile pour la détection de protéines à faible poids moléculaire. Comme on peut le voir, les données suggèrent également que la tache d’argent fluorescent donne une bonne et uniforme linéarité pour les 14 protéines sur un éventail relativement large de quantification des protéines.Tandis que la tache de nitrate d’argent a donné un niveau élevé de signal de fond et des crêtes déformées, la tache fluorescente d’argent a détecté les bandes avec le bon contraste et la distribution uniforme d’intensité comparable à la tache rubis de SYPRO dans les 14 protéines. Les étapes de lavage sont importantes car elles limitent la solution de fixation résiduelle de perturber l’imprégnation de l’argent ou le développement fluorogène. Lorsque vous utilisez du nitrate d’argent, évitez tout contact avec la peau.Nettoyez immédiatement les déversements. Portez des vêtements et des gants de protection et éliminez-les sous forme de déchets chimiques.

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