Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare Patrick Chan presso il centro di Lau Wai Ming per Medicina riparativa, Karolinska Institutet, per il suo supporto tecnico. S. X. è grato per il sostegno del Consiglio di ricerca svedese (Grant No. 2017-06344).

1. preparazione del Gel
Nota: La dimostrazione segue un protocollo standard per preparare il gel per la colorazione poco dopo SDS-PAGE12. In breve, i passaggi seguenti descrivono la preparazione dei campioni e l'elettroforesi del gel.
<ol><li>Eseguire SDS-PAGE con gel di proteina 4% - 12% Bis-Tris (1 mm, 15-bene) usando un carro armato del gel mini riempiti di 2-(N -morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES).</li>
	<li>Diluire i campioni con una miscela ...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Presentato qui è un romanzo fluorescente argento che macchia il metodo per le proteine nel gel di poliacrilammide. Questa strategia integra le macchie d'argento convenzionale e la colorazione fluorescente. Le gesta di colorazione il legame selettivo di ioni d'argento per proteine come in altri argento macchie ma impiega un argento altamente sensibile fluorogenic sonda TPE-4TA per illuminare le proteine rilegate d'argento. Poiché la sonda fluorogenic TPE-4TA può percepire gli ioni d'ar...

Molti metodi di colorazione sono state usate per visualizzare proteine elettroforesi su gel in seguito, ad esempio utilizzando coloranti colorimetrici come Coomassie Brilliant Blue, macchia d'argento, fluorescenza, o radioattivo etichettatura1,2, 3 , 4. macchiatura d'argento è considerata una delle tecniche più sensibili per la rilevazione di proteine che richiedono reagenti semplici ed economici. Possono essere classificato in due famiglie principali: la macchia d'argento ammoniacale e il nitrato d'argento macchia5,6. Nel metodo d'argento ammoniacale alcalino, il complesso di argento-diammina è prodotta con idrossido di sodio e ammoniaca e ridotto ad argento metallico durante lo sviluppo utilizzando una soluzione di formaldeide acide. La macchia può ospitare in modo efficiente per proteine basiche ma mostra una prestazione compromessa per le proteine acide e neutre ed è, inoltre, limitata ai sistemi elettroforetiche della taurina e glicina classica. In confronto, le macchie di nitrato d'argento sfruttano l'alta bio-affinità degli ioni d'argento per proteine, principalmente la solfidrilico e carbossilico gruppi da catene laterali e tendono a macchiare le proteine acide in modo più efficiente7. Dopo agli ioni d'argento vincolante, una soluzione in via di sviluppo (in genere in una soluzione di carbonato di metallo contenente formaldeide e sodio tiosolfato) viene applicata per ridurre gli ioni d'argento a grani d'argento metallici, che costruire un colore marrone-scuro per visualizzare la fasce della proteina.
Sebbene macchiatura d'argento è stato ben nota per la sua versatilità e l'alta sensibilità dal suo sviluppo nel 1970s8, il metodo è spesso considerato come difficile. Metodi di colorazione argento hanno passaggi di tempo-limitato e mostrano scarsa riproducibilità. Poiché il colore della macchia d'argento non è solitamente uniforme e dipende il passo di riduzione, che è difficile da controllare, la macchia d'argento non è un metodo quantitativo e, quindi, non raccomandato per gel confronto studio e proteina quantificazione9. Metodi ottimizzati nella sensibilità possono utilizzare aldeidi che possono anche fornire un aspetto più uniforme colorazione10. Tuttavia, questo è a scapito di ulteriore analisi a valle a causa la reticolazione delle proteine di aldeidi. Protocolli di veloce principalmente combinano o accorciano alla seguente procedura per ridurre il tempo di compromettere la riproducibilità e l'uniformità della macchia5. Di conseguenza, ci sono numerosi argento colorazione varianti all'interno di gel di proteina che macchia, ciascuno ottimizzato per soddisfare determinati requisiti; ad esempio, semplicità, sensibilità o peptide tasso di recupero per analisi a valle. Questi attributi possono anche avere un impatto su ogni altro, e soddisfare tutte le esigenze in un protocollo può essere difficile.
In questo lavoro, vi presentiamo un nuovo fluorescente argento che macchia il metodo per la rilevazione di proteine nel gel di poliacrilammide. In questo metodo, utilizziamo una sonda fluorogenic per ioni d'argento, TPE-4TA (Figura 1), per visualizzare le proteine impregnato di argento11. TPE-4TA è stato progettato dal principio di emissione indotta da aggregazione (AIE). È non-emissivo quando disciolto in soluzione acquosa, ma è altamente emissivo in presenza di ioni d'argento. Sostituendo lo sviluppo cromogeno in tradizionali macchie d'argento con un fluorogenic sviluppando passo, il metodo d'argento fluorescente consente la macchiatura robusta delle proteine totali con uno sfondo ridotto.
Inoltre, la macchia d'argento fluorescente ha mostrato una buona gamma dinamica lineare per quantificazione della proteina, che è paragonabile con la macchia di SYPRO Ruby ampiamente utilizzato e non ottenibile con le macchie d'argento tradizionale. Il gel può essere ripreso il gel comunemente utilizzati sistemi di documentazione con lampada a raggi ultravioletti (lunghezza d'onda di eccitazione: canale di 302/365 nm; emissione: ~ 490-530 nm) presso molti laboratori biologici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

Macchiatura d'argento è una tecnica colorimetrica ampiamente utilizzata per visualizzare le bande proteiche in gel di poliacrilammide dopo elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Le macchie d'argento classiche hanno alcuni inconvenienti, come alta priorità bassa che macchia, recupero di proteina povera, scarsa riproducibilità, una gamma dinamica lineare stretta per la quantificazione e la limitata compatibilità con spettrometria di massa (MS). Ora, con l'uso di una sonda di fluorogenic Ag+ , TPE-4TA, abbiamo sviluppato un fluorescente argento che macchia il metodo per la visualizzazione di proteine totali in gel di poliacrilammide. Questa nuova macchia evita il passaggio di riduzione d'argento fastidioso in tradizionali macchie d'argento. Inoltre, la macchia d'argento fluorescente dimostra buona riproducibilità, sensibilità e quantificazione lineare nella rilevazione della proteina, rendendolo una macchia di gel di proteina utile e pratico.

Le bande proteiche macchiate dalla macchia d'argento fluorescente presentano una fluorescenza verde intensa sotto una lampada a UV 365 nm. Tutte le bande di proteina 14 (10-200 kDa), da cima a fondo, erano chiaramente visibili, che correlano bene con 14 quelli colore rosso macchiati dalla SYPRO Ruby tintura (Figura 2)10.
Per quanto riguarda la rilevazione quantitativa della p...

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag+-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.

Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Questo è un nuovo metodo di colorazione del gel che utilizza una sonda d'argento fluorogenica per convertire la colorazione tradizionale dell'argento in una colorazione fluorescente in argento. Questo metodo ha mostrato prestazioni migliorate rispetto alla colorazione convenzionale del nitrato d'argento e alla colorazione SYPRO Ruby durante l'utilizzo di un protocollo semplice e diretto senza aldeidi. A dimostrare la procedura sarà Alex Wong, un assistente di ricerca del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, diluire i campioni proteici con una soluzione contenente acqua distillata, tampone LDS e un agente riducente del campione. Impostare un mini serbatoio di gel riempito con buffer MES per eseguire SDS-PAGE con un gel proteico 4-12%Bis-Tris. Caricare i pozzi con il campione proteico preparato, quindi eseguire il gel a una tensione costante di 200 volt per 30 minuti.Dopo l'elettroforesi, immergere il gel in una soluzione da 100 millilitri contenente etanolo e acido acetico su uno shaker orbitale e incubare due volte per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente mentre si trema a 50 giri/min. Successivamente, lavare il gel tre volte con acqua ultrapura in un contenitore pulito con ogni lavaggio della durata di 10 minuti. In primo luogo, sciogliere 0,01 grammi di nitrato d'argento in 10 millilitri di acqua ultrapura per preparare una soluzione stock con una concentrazione dello 0,1%Aggiungere 100 microlitri della soluzione stock in 100 millilitri di acqua ultrapura per rendere la soluzione di lavoro del nitrato d'argento.In una cappa aspirante, immergere il gel in 100 millilitri della soluzione di lavorazione del nitrato d'argento in una camera di vetro sigillata. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggere il gel dalla luce durante l'impregnazione e incubare per un'ora mentre si trema a 50 giri/min su uno shaker orbitale. Successivamente, lavare il gel due volte con acqua ultrapura in un contenitore pulito, con ogni lavaggio utilizzando circa 100 millilitri di acqua e della durata di 60 secondi.È importante utilizzare acqua ultrapura per pulire il gel dopo la fase di impregnazione dell'argento per ridurre al minimo la colorazione dello sfondo. In primo luogo, aggiungere 50 millilitri di acqua ultrapura a tre milligrammi di colorante TPE-4TA. Sonicare la soluzione per tre minuti e aggiungere cinque microlitri di soluzione di idrossido di sodio un molare tra ogni sessione di sonicazione per aiutare a sciogliere il colorante, di solito fino a tre volte.Quindi controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada UV da 365 nanometri per assicurarsi che il colorante sia completamente sciolto. Solo soluzioni deboli o non emissive indicano la completa dissoluzione. Per preparare la soluzione di sviluppo fluorogenica, aggiungere 10 millilitri della soluzione stock TPE-4TA a 90 millilitri di acqua ultrapura.Utilizzare un misuratore di pH per controllare il pH della soluzione. Sintonizzare la soluzione su un pH compreso tra 7 e 9, utilizzando soluzione diluita di idrossido di sodio o acido acetico se il pH è fuori portata. Successivamente trasferire il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 millilitri della soluzione di sviluppo fluorogenica e assicurarsi che il gel sia completamente immerso.Sigillare il contenitore e coprirlo per proteggerlo dalla luce. Agitare il contenitore durante la notte su uno shaker orbitale a 50 giri/min e a temperatura ambiente. Trasferire il gel in un contenitore pulito e trattenerlo in 100 millilitri di 10%etanolo per 30 minuti.Quindi sciacquare il gel in acqua ultrapura per cinque minuti. Il gel può essere visualizzato su un transilluminatore da banco o immaginato su una macchina di documentazione in gel al canale di 365 nanometri o al canale di 302 nanometri. In questo studio, un nuovo metodo di colorazione fluorescente dell'argento viene utilizzato per macchiare le proteine nei gel di poliacrilammide.Le bande proteiche macchiate dalla macchia d'argento fluorescente mostrano un verde intenso sotto una lampada UV da 365 nanometri. Tutte le 14 bande proteiche sono chiaramente visibili e si correlano bene con le bande di colore rosso macchiate dal colorante SYPRO Ruby. Questo metodo di colorazione fluorescente dell'argento sembra avere un'alta risoluzione.Per alcune fasce proteiche, la sensibilità della macchia d'argento fluorescente è anche leggermente migliore di quella della macchia fluorescente SYPRO Ruby. In particolare, le prestazioni di questa macchia sono migliorate per le bande proteiche tra i 10 e i 40 kilodalton, il che indica che il nuovo metodo è particolarmente utile per l'individuazione di proteine a basso peso molecolare. Come si può vedere, i dati suggeriscono anche che la macchia d'argento fluorescente dà una linearità buona e uniforme per tutte le 14 proteine su una gamma relativamente ampia di quantificazione proteica.Mentre la macchia di nitrato d'argento dava un alto livello di segnale di fondo e picchi distorti, la macchia d'argento fluorescente rilevava le bande con un buon contrasto e una distribuzione uniforme dell'intensità paragonabile alla macchia di rubino SYPRO in tutte le 14 proteine. Le fasi di lavaggio sono importanti in quanto limitano la soluzione di fissazione residua dall'interruzione dell'impregnazione dell'argento o dallo sviluppo fluorogenico. Quando si utilizza nitrato d'argento, evitare il contatto con la pelle.Pulire immediatamente eventuali fuoriuscite. Indossare indumenti e guanti protettivi e smaltire come rifiuti chimici.

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