Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
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著者は、彼のサポートのため、修復医学教育研究、カロリンスカ研究所明カーウァイ ・ ラウ センターでパトリック ・ チャンを感謝したいです。S. x. はスウェーデン研究評議会 (グラント号 2017年-06344) からのサポートに感謝します。

1. ゲルの調製
注: デモ SDS ページ12後まもなく染色ゲルを準備する標準プロトコルに従います。簡単に言えば、次の手順は、サンプルの準備を記述する、ゲルの電気泳動。
<ol><li>4-12% ビス トリス タンパク質ゲル (1 mm、15 ウェル) と SDS ページの実行 2-(n-morpholino) 満ちてミニ ゲル槽を用いた ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー。</li>
	<li>蒸留水、リチウ?...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

ここで紹介は新規蛍光銀製の汚損ポリアクリルアミドゲルの蛋白質のためのメソッド。この戦略は、従来の銀汚れと蛍光汚れを統合します。染色攻撃他の銀のように蛋白質に銀イオンの選択的バインド汚れが高感度蛍光シルバーを採用してプローブTPE 4TA銀のバインドされた蛋白質を点灯します。それにより従来の必要に応じて還元的視覚化のステップの任意のさらなる需要がな?...

多くの染色法がされている蛋白質ゲルの電気泳動、たとえば Coomassie 鮮やかな青、銀染色、蛍光など色の染料を使用して視覚化するために使用または放射性1,2,を表示3,4. 簡易かつ安価な試薬を必要とする蛋白質の検出のための最も敏感なテクニックの一つである銀製の汚損します。2 つの主要な家族に分類できます: 銀製硝酸塩、アンモニア銀染色染色5,6。アルカリのアンモニア銀法で銀ジアミン複合体はアンモニア、水酸化ナトリウムの生産、酸性ホルムアルデヒド溶液を用いた開発中に金属銀に減少します。汚れは、基本的な蛋白質に効率的に対応できる酸性および中性蛋白質のためパフォーマンスの低下を示していますは、さらに、古典的なグリシンやタウリン電気泳動システムに限定。比較では、硝酸銀の汚れは蛋白質に銀イオンの高い生体親和性を悪用する、主なスルフヒとカルボキシル基側鎖からグループ化しより効率的に酸性タンパク質を染色する傾向がある7。ブラウン-ダーク色を視覚化するを構築金属の銀粒子に銀イオンを抑える銀イオン結合後、現像液 (通常金属炭酸塩溶液におけるホルムアルデヒドおよびナトリウム チオ硫酸製) が適用される、タンパク質のバンド。
銀染色は 1970 年代8の開発以来その汎用性と高感度の知られているがメソッド頻繁にトリッキーないわ。銀染色方法はステップの時間制限があるし、低再現性を示します。銀染色の色は、通常ない均一でコントロールするは難しいが、削減の手順に依存しているので銀染色定量的方法ではありません、したがって、ゲルの比較研究とタンパク質定量9には推奨されません。感度の最適化方法は、アルデヒド10を染色より均一をまた提供することができますを利用できます。ただし、アルデヒドによるタンパク質の架橋によりさらに下流解析を犠牲になります。高速プロトコルは主を組み合わせるか、再現性と染色5の均一性を損なうこと、時間を短縮するには手順を短きます。その結果、多数の銀染色染色、特定の要件に合わせて最適化された各蛋白質ゲル内の亜種があります。たとえば、シンプルさ、感度、またはペプチドの回収率下流の分析。これらの属性は、互いに影響をあります、1 つのプロトコルのすべての要件を満たすは難しいことができます。
この作品は、新しい蛍光銀染色法電気泳動法でタンパク質検出用を紹介します。この方法で銀含浸タンパク質11を視覚化すると銀イオン、 TPE 4TA (図 1)、蛍光プローブを使用します。TPE 4TA凝集誘起発光 (AIE) 原則として設計されています。水溶液に溶解したとき、非発光ですが銀イオンの存在下で高発光性です。開発ステップ蛍光発色における伝統的な銀汚れに置き換える、蛍光銀法により総蛋白減少の背景を持つ堅牢な染色します。
さらに、蛍光の銀製の汚れはタンパク質の定量化は, 広く使用される可視ルビー汚れに匹敵する、伝統的な銀汚れで達成可能でない良い動的線形範囲を示した。紫外線ランプで一般的に使用されるゲルのドキュメント システムで視覚化されるゲル (励起波長: 302/365 nm チャンネル; 排出量: ~ 490-530 nm) 多くの生物のラボで。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

銀染色は、ポリアクリルアミドゲル ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を次の蛋白質バンドの視覚化に広く用いられる比色法です。古典的な銀汚れ汚損、不良タンパク質の回収、低再現性、定量化、および質量分析法 (MS) と限られた互換性のダイナミック レンジの狭い線形高の背景など、いくつかの欠点があります。今、 TPE 4TA、Ag+蛍光発生プローブの使用と、蛍光銀染色ポリアクリルアミドゲルで総たんぱく可視化法を開発しました。この新しい汚れは、伝統的な銀汚れで面倒な銀削減ステップを回避できます。また、蛍光銀染色は良い再現性、感度、およびタンパク質検出後、有用かつ実用的な蛋白質ゲル染色で線形の数量を示します。

蛍光銀染色で染色蛋白質バンドは、365 nm の紫外線ランプの下で強烈な緑の蛍光性を表わします。すべて 14 タンパク質のバンド (10-200 kDa)、上下からから、染色可視ルビー色素 (図 2)1014 の赤いものによく相関、明確に表示でした。
量的蛋白質の検出に関するイメージング システムの...

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

ここでは、新しい蛍光染色ポリアクリルアミドゲルの総蛋白質の検出の技術をまとめた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルを利用して Ag+を検出する銀イオン固有蛍光ターンオン プローブ-タンパク質複合体、伝統的な発色銀汚れの特定の制限を排除します。

蛍光タンパク質のポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

これは、蛍光化銀プローブを利用して従来の銀染色を蛍光銀染色に変換する新規のゲル染色法です。この方法は、アルデヒドを含まない簡単で簡単なプロトコルを使用しながら、従来の硝酸銀染色およびSYPROルビー染色と比較して性能が向上した。この手順を実証することは、私の研究室の研究アシスタントであるアレックス・ウォンです。この手順を開始するには、蒸留水、LDSバッファー、およびサンプル還元剤を含む溶液でタンパク質サンプルを希釈します。MES バッファーを充填したミニゲルタンクをセットして、4-12%Bis-Tris プロテインゲルを使用して SDS-PAGE を実行します。調製したタンパク質サンプルでウェルをロードし、30分間200ボルトの一定電圧でゲルを実行します。電気泳動後、エタノールと酢酸を含む100ミリリットル溶液にゲルを軌道シェーカーに沈め、50rpmで振りながら室温でそれぞれ30分間2回インキュベートする。次に、洗浄を10分間続けて、清潔な容器に超純水でゲルを3回洗います。まず、0.01グラムの硝酸銀を10ミリリットルの超純水に溶解し、100マイクロリットルのストック溶液を100マイクロリットルの超純水に加えて硝酸銀を働く溶液に調製します。ヒュームフードに、密閉ガラス室に硝酸銀の働く溶液の100ミリリットルでゲルを沈めます。アルミホイルを使用して含浸中にゲルを光から保護し、軌道シェーカーで50rpmで振りながら1時間インキュベートします。その後、ゲルを超純水で2回洗浄し、洗浄水を約100ミリリットルで洗浄し、60秒間持続します。銀含浸工程後のゲルを洗浄するためには、背景染色を最小限に抑えるために、超純水を使用することが重要です。まず、TPE-4TA染料の3ミリグラムに超純水の50ミリリットルを追加します。3分間溶液を超音波処理し、各超音波処理セッションの間に1モル水酸化ナトリウム溶液の5マイクロリットルを追加して、染料を溶解させ、通常は3回まで。次に、365ナノメートルのUVランプの下で溶液の蛍光をチェックして、色素が完全に溶解していることを確認します。完全溶解を示しているのは、弱い溶液または非発光溶液のみです。蛍光発生溶液を調製するには、TPE-4TAストック溶液の10ミリリットルを90ミリリットルの超純水に加えます。pHメーターを使用して、溶液のpHをチェックします。溶液を7~9の間のpHに調整し、pHが範囲外の場合は水酸化ナトリウム溶液または酢酸を希釈して使用します。次に、100ミリリットルの蛍光発生溶液を含む清潔で密封可能な容器にゲルを移し、ゲルが完全に浸漬されていることを確認します。容器を密封し、それを覆って光から守ります。50 rpmで軌道シェーカーで一晩、室温で容器を振ります。ゲルを清潔な容器に移し、100ミリリットルのエタノールで30分間脱塩します。その後、ゲルを超純水で5分間リンスします。このゲルは、ベンチトップのトランイルミニューエータで視覚化したり、365ナノメートルチャンネルまたは302ナノメートルチャンネルのゲルドキュメンテーションマシンで画像化することができます。本研究では、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を染色するために、新しい蛍光性銀染色法が用いられている。蛍光性銀染色で染色されたタンパク質バンドは、365ナノメートルのUVランプの下で強烈な緑色を示す。全14個のタンパク質バンドがはっきりと見え、SYPROルビー色素によって染色された赤色のバンドとよく相関しています。この蛍光銀染色法は、高分解能を有しているように見える。一部のタンパク質バンドでは、蛍光性銀染色の感度も、蛍光性SYPROルビー染色の感度よりもわずかに優れています。特にこの染色の性能は、10~40キロダルトンのタンパク質バンドに対して改善され、この新しい方法が低分子量のタンパク質の検出に特に有用であることを示している。見られるように、このデータは、蛍光銀染色が比較的広い範囲のタンパク質定量に関して、14タンパク質すべてに良好かつ均一な直線性を与えることも示唆している。硝酸銀染色は高いレベルのバックグラウンドシグナルと歪んだピークを与えましたが、蛍光銀染色は、14タンパク質すべてにわたってSYPRO Ruby染色に匹敵する良好なコントラストと均一な強度分布を持つバンドを検出しました。洗浄工程は、銀含浸またはフッ素発生を妨げる残留固定溶液を制限するため重要です。硝酸銀を使用する場合は、皮膚の接触を避けてください。すぐにこぼれをきれいにしてください。防護服や手袋を着用し、化学廃棄物として処分する。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

センサー蛍光蛋白質生きているセルおよびバルク量を定量化する方法

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグRNAの蛍光可視化

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support