Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Patrick Chan Ming Wai Lau sentrum for Reparative medisin, Karolinska Institutet, hans kundestøtte. S. X. er takknemlig for støtten fra den svenske Research Council (Grant No. 2017-06344).

1. forberedelse av Gel
Merk: Demonstrasjonen følger en standardprotokoll for å forberede gel flekker etter SDS-side12. I korte trekk følgende beskriver utarbeidelse av prøvene og gel geleelektroforese.
<ol><li>Utføre SDS-side med 4% - 12% Bis-Tris protein gels (1 mm, 15-vel) ved hjelp av en mini gel tank fylt med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer.</li>
	<li>Fortynne prøvene med en blanding av destillert vann, litium dodecyl sulfate (LDS...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Presenteres her er romanen fluorescerende sølv flekker metode for proteiner i polyakrylamid gels. Denne strategien integrerer konvensjonell sølv flekker og fluorescerende flekker. Farging bedriftene selektiv binding av sølv ion proteiner som andre sølv flekker, men bruker svært sensitive fluorogenic sølv sonde TPE-4TA å lyse opp en bundet proteiner. Siden fluorogenic sonden TPE-4TA kan forstand sølv ioner i en relativt lav konsentrasjon i nanomolar området11</s...

Mange flekker metoder har blitt brukt til å visualisere proteiner følgende gel geleelektroforese, for eksempel bruker kolorimetrisk fargestoffer som Coomassie briljant blå, sølv flekken, fluorescens eller radioaktivt merking1,2, 3 , 4. sølv flekker anses å være en av de mest følsomme teknikkene for proteinet oppdagelsen som trenger enkel og billig reagenser. Det kan kategoriseres i to store familier: ammoniacal sølv flekken og sølv nitrat flekken5,6. I alkalisk ammoniacal sølv metoden, er sølv-diamine komplekset produsert med ammoniakk og natriumhydroksid og redusert til metallic sølv under utvikling ved hjelp av en syrlig formaldehyd løsning. Flekken passer effektivt for grunnleggende proteiner, men viser en kompromittert ytelsen for syreholdig og nøytralt proteiner og er videre begrenset til klassisk glysin og taurine electrophoretic systemer. Sammenligning Sølvnitrat flekker utnytter det høy bio-affinitet sølv ioner protein, hovedsakelig av sulfhydryl og carboxyl grupper fra siden kjedene, og pleier å flekken surt proteiner mer effektivt7. Etter sølv ion binding, en utvikling løsning (vanligvis laget av en metall karbonat løsning som inneholder formaldehyd og natrium thiosulphate) brukes til å redusere sølv ioner metallisk sølv korn, som bygger opp en brunt til mørkt farge å visualisere den protein band.
Selv om sølv flekker har vært kjent for sin allsidighet og høy følsomhet siden utviklingen i 1970-tallet8, er metoden ofte ansett som vanskelig. Sølv flekker metoder har tid-begrenset trinn og viser lav reproduserbarhet. Siden fargen på sølv stain ikke er vanligvis uniform og avhengig av reduksjon-trinnet, som er vanskelig å kontrollere, sølv flekken er ikke en kvantitativ metode og, derfor, anbefalt ikke for gel sammenligning studier og protein kvantifisering9. Metoder optimert i følsomhet kan benytte aldehyder som gir også en mer enhetlig flekker10. Dette er imidlertid på bekostning av videre nedstrøms analyse på grunn av crosslinking proteiner av aldehyder. Rask protokoller hovedsakelig kombinere eller kortere for å redusere tiden, at reproduserbarhet og ensartethet av flekken5. Derfor finnes det mange sølv flekker varianter i protein gel flekker, hver optimalisert for å passe visse krav; for eksempel enkelhet, følsomhet eller peptid utvinningsgrad for nedstrøms. Disse attributtene kan også ha innvirkning på hverandre, og oppfyller alle krav i én protokoll kan være vanskelig.
I dette arbeidet introduserer vi en ny fluorescerende sølv flekker metode for proteinet oppdagelsen i polyakrylamid gel. I denne metoden bruker vi en fluorogenic sonde for sølv ioner, TPE-4TA (figur 1), visualisere sølv-impregnert proteiner11. TPE-4TA er designet av aggregering-indusert utslipp (AIE) prinsippet. Det er ikke-emissive når oppløst i vandig løsning, men er svært emissive i nærvær av sølv ioner. Erstatter kromogent utviklingen i tradisjonelle sølv flekker med en fluorogenic utvikle trinn, gjør fluorescerende sølv metoden den robuste flekker av totale proteiner med redusert bakgrunn.
Videre fluorescerende sølv flekken viste en god lineær dynamikk for protein kvantifisering, som er sammenlignbare med brukte SYPRO Ruby flekken og ikke oppnåelig med tradisjonelle sølv flekker. Gelen kan avbildes på brukte gel dokumentasjonssystemer med en ultrafiolett lampe (eksitasjon bølgelengde: 302/365 nm kanal, utslipp: ~ 490-530 nm) på mange biologiske laboratorier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

Sølv flekker er en kolorimetrisk teknikk brukte å visualisere protein band i polyakrylamid gels etter natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). Klassisk sølv flekker har visse ulemper, som høy bakgrunnsfarge flekker, dårlig protein utvinning, lav reproduserbarhet, en smal lineær dynamiske området for kvantifisering og begrenset kompatibilitet med massespektrometri (MS). Nå, med bruk av en fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, vi utviklet fluorescerende sølv flekker metode for totalt protein effekten i polyakrylamid gels. Denne nye flekken unngår plagsom sølv reduksjon trinnet i tradisjonelle sølv flekker. Videre viser fluorescerende sølv flekken god reproduserbarhet, følsomhet og lineær kvantifisering i proteinet oppdagelsen, gjør det en nyttig og praktisk protein gel flekk.

Protein bandene farget av fluorescerende sølv flekken forevise en intens grønne fluorescens under en 365 nm UV-lampe. Alle 14 protein band (10-200 kDa), var fra topp til bunn, tydelig, samkjøre godt med de 14 rød-farget farget av SYPRO Ruby fargestoff (figur 2)10.
Når det gjelder kvantitativt proteinet oppdagelsen, geléer ble fotografert av en gel imaging system som bru...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Her beskriver vi en detaljert protokoll beskriver en ny fluorescerende flekker teknikk for totalt proteinet oppdagelsen i polyakrylamid gels. Protokollen bruker en sølv ion-spesifikke fluorescens turn-on sonde, som oppdager Ag+-protein komplekser, og eliminerer visse begrensninger av tradisjonelle kromogent sølv flekker.

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Dette er en ny gel-farging metode som benytter en fluorogen sølv sonde for å konvertere den tradisjonelle sølv farging til en fluorescerende sølv farging. Denne metoden viste forbedret ytelse sammenlignet med konvensjonell sølvnitratfarging og SYPRO Ruby-farging mens du bruker en enkel og grei protokoll uten aldehyder. Å demonstrere prosedyren vil være Alex Wong, en forskningsassistent fra laboratoriet mitt.For å starte denne prosedyren, fortynne proteinprøvene med en løsning som inneholder destillert vann, LDS-buffer og et prøvereduserende middel. Sett opp en mini gel tank fylt med MES buffer for å utføre SDS-PAGE med en 4-12% Bis-Tris protein gel. Last brønnene med den tilberedte proteinprøven, og kjør deretter gelen med en konstant spenning på 200 volt i 30 minutter.Etter elektroforese, senk gelen i en 100-milliliter løsning som inneholder etanol og eddiksyre på en orbital shaker og inkubere to ganger i 30 minutter hver ved romtemperatur mens du rister på 50 rpm. Vask deretter gelen tre ganger med ultrarent vann i en ren beholder med hver vask som varer i 10 minutter. Oppløs først 0,01 gram sølvnitrat i 10 milliliter ultrarent vann for å lage en lagerløsning med en konsentrasjon på 0,1%Tilsett 100 mikroliter av lagerløsningen i 100 milliliter ultrarent vann for å lage sølvnitratarbeidsløsningen.I en røykhette, senk gelen i 100 milliliter av sølvnitratarbeidsløsningen i et forseglet glasskammer. Bruk aluminiumsfolie for å beskytte gelen mot lys under impregnering og inkubere i en time mens du rister på 50 rpm på en orbital shaker. Etter dette vasker du gelen to ganger med ultrarent vann i en ren beholder, med hver vask med ca. 100 milliliter vann og varer i 60 sekunder.Det er viktig å bruke ultrapure vann til å rengjøre gelen etter sølvimpregneringstrinnet for å minimere bakgrunnsfarging. Først, tilsett 50 milliliter ultrapure vann til tre milligram TPE-4TA fargestoff. Sonicate løsningen i tre minutter og tilsett fem mikroliter av en-molar natriumhydroksid løsning mellom hver sonikering økt for å bidra til å oppløse fargestoffet, vanligvis opptil tre ganger.Kontroller deretter fluorescensen av løsningen under en 365 nanometer UV-lampe for å sikre at fargestoffet er fullstendig oppløst. Bare svake eller ikke-emissive løsninger indikerer full oppløsning. For å forberede den fluorogene utviklingsløsningen, tilsett 10 milliliter av TPE-4TA-lagerløsningen til 90 milliliter ultrarent vann.Bruk en pH-måler til å kontrollere pH-en til løsningen. Sett løsningen på en pH mellom 7 og 9, ved hjelp av fortynnet natriumhydroksidoppløsning eller eddiksyre hvis pH-en er utenfor rekkevidde. Overfør deretter gelen til en ren og forseglet beholder med 100 ml fluorogen utviklingsløsning og sørg for at gelen er helt nedsenket.Forsegle beholderen og dekk den for å beskytte den mot lys. Rist beholderen over natten på en orbital shaker ved 50 o/min og ved romtemperatur. Overfør gelen til en ren beholder og destain den i 100 milliliter på 10% etanol i 30 minutter.Skyll deretter gelen i ultrarent vann i fem minutter. Gelen kan visualiseres på en benkeplate transilluminator eller avbildet på en gel dokumentasjon maskin på 365-nanometer kanal eller 302-nanometer kanal. I denne studien brukes en ny fluorescerende sølvfargingsmetode til å flekke proteiner i polyakrylamidgeler.Proteinbåndene farget av den fluorescerende sølvflekken viser en intens grønn under en 365 nanometer UV-lampe. Alle de 14 proteinbåndene er godt synlige og korrelerer godt med de rødfargede båndene farget av SYPRO Ruby-fargestoffet. Denne fluorescerende sølvfargingsmetoden ser ut til å ha høy oppløsning.For noen proteinbånd er følsomheten til den fluorescerende sølvflekken også litt bedre enn den fluorescerende SYPRO Ruby-flekken. Spesielt er ytelsen til denne flekken forbedret for proteinbåndene mellom 10 og 40 kilodaltonn, noe som indikerer at den nye metoden er spesielt nyttig for påvisning av proteiner med lav molekylvekt. Som det kan ses, tyder dataene også på at den fluorescerende sølvflekken gir en god og jevn linearitet for alle 14 proteiner over et relativt bredt spekter av proteinkvantifisering.Mens sølvnitratflekken ga et høyt nivå av bakgrunnssignal og forvrengte topper, oppdaget den fluorescerende sølvflekken båndene med god kontrast og jevn intensitetsfordeling som kan sammenlignes med SYPRO Ruby-flekken på tvers av alle 14 proteiner. Vasketrinn er viktige da de begrenser restfikseringsløsningen fra å forstyrre sølvimpregnering eller fluorogen utvikling. Når du bruker sølvnitrat, unngå hudkontakt.Rengjør eventuelle søl umiddelbart. Bruk verneklær og hansker og kast som kjemisk avfall.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering av Multi-subenheten Protein Komplekser av menneskelig MXA bruk av ikke-denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spenningsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjelp av fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan kvantifisere brøkdel av Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og lever celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerende visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamid gels via en Poststaining metode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte