Name: fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00
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Os autores gostaria agradecer Patrick Chan no centro de Lau Wai Ming para medicina reparativa, Karolinska Institutet, seu suporte técnico. S. X. é grato pelo apoio do Conselho de pesquisas sueco (Grant No. 2017-06344).

1. preparação do Gel
Nota: A demonstração segue um protocolo padrão para preparar o gel para coloração pouco depois de SDS-PAGE12. Em resumo, as etapas a seguir descrevem a preparação das amostras e electroforese do gel.
<ol><li>Executar SDS-PAGE com géis de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 mm, 15-bem) usando um gel de mini tanque cheio de 2-(N -Morpholinos) etanesulfónico tampão de ácido (MES).</li>
	<li>Dilua as amostras com uma mistura de ág...

<ol>
	<li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+the+capacities+of+&amp;#34;Gel-based&amp;#34;+proteomics.">Highlights on the capacities of &amp;#34;Gel-based&amp;#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li><li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses.">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li><li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics:+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods.">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li><li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye,+calconcarboxylic+acid,+as+a+silver-ion+sensitizer.">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li><li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).</li><li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels.">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li><li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels:+a+general+overview.">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li><li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+Ag+-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining.">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Apresentado aqui é uma romance prata fluorescente método de coloração para proteínas em gel de poliacrilamida. Essa estratégia integra convencionais prata manchas e manchas fluorescentes. As façanhas de coloração a ligação seletiva de íons de prata às proteínas como em outra prata manchas mas emprega uma prata fluorogenic altamente sensível sonda TPE-4TA para iluminar as proteínas prata acopladas. Desde que a sonda fluorogenic TPE-4TA pressentem-se íons de prata em conce...

Muitos métodos de coloração têm sido usados para visualizar proteínas após eletroforese em gel, por exemplo, usando colorimétricos corantes como azul de Coomassie brilhante, mancha prateada, fluorescência, ou radioativo rotulagem1,2, 3 , 4. coloração prata é considerada uma das técnicas mais sensíveis para a deteção de proteínas que requerem reagentes simples e baratos. Pode ser classificado em duas grandes famílias: a mancha de prata amoniacal e o nitrato de prata mancham5,6. O método de prata amoniacal alcalino, o complexo de prata-diamina é produzido com amônia e hidróxido de sódio e reduzido a prata metálica durante o desenvolvimento usando uma solução de formaldeído ácido. A mancha acomoda eficientemente para proteínas básicas mas mostra um desempenho comprometido para proteínas ácidas e neutras e é, além disso, limitado a clássica glicina e taurinas sistemas eletroforético. Em comparação, as manchas de nitrato de prata exploram a bio-afinidade elevada de íons de prata à proteína, principalmente a sulfidrila e carboxila grupos de cadeias de lado e tendem a manchar as proteínas ácidas mais eficientemente7. Após o íon prateado vinculativo, uma solução em desenvolvimento (normalmente feita de uma solução de carbonato de metal contendo formaldeído e sódio tiossulfato) é aplicada para reduzir os íons de prata para grãos de prata metálicos, que construir uma cor marrom-escuro para visualizar o bandas de proteínas.
Embora a coloração prata bem conhecida por sua versatilidade e alta sensibilidade desde seu desenvolvimento na década de 19708, o método é frequentemente considerado tão complicado. Métodos de coloração de prata tem passos de tempo restrito e mostram baixa reprodutibilidade. Desde que a cor da mancha prateada geralmente não é uniforme e dependente a etapa de redução, que é difícil de controlar, a mancha de prata não é um método quantitativo e, assim, não é recomendado para gel de comparação estudo e proteína quantificação9. Métodos otimizados em sensibilidade podem utilizar aldeídos que podem também fornecer um uniforme mais10de coloração. No entanto, isto é à custa de uma análise mais aprofundada a jusante devido a reticulação de proteínas por aldeídos. Protocolos rápidos principalmente combinam ou encurtam etapas para reduzir o tempo, comprometer a reprodutibilidade e a uniformidade da mancha5. Como resultado, existem numerosas prata coloração variantes dentro do gel de proteína, coloração, cada um otimizado para atender a certos requisitos; por exemplo, simplicidade, sensibilidade ou peptídeo taxa de recuperação para análise a jusante. Esses atributos também podem ter impacto sobre os outros, e satisfazer todas as exigências em um protocolo pode ser difícil.
Neste trabalho, apresentamos uma nova prata fluorescente método para detecção de proteínas em gel de poliacrilamida de coloração. Neste método, usamos uma sonda fluorogenic para íons de prata, TPE-4TA (Figura 1), para visualizar as proteínas impregnado de prata11. TPE-4TA é projetado pelo princípio de emissão induzida por agregação (AIE). É não-emissivo quando dissolvido em solução aquosa, mas é altamente emissivo na presença de íons de prata. Substituindo o desenvolvimento cromogênico em manchas de prata tradicionais com um fluorogenic passo a desenvolver, o método fluorescente prateado permite a coloração robusto de proteínas totais com um fundo reduzida.
Além disso, a mancha de prata fluorescente mostrou uma boa faixa linear dinâmica para quantificação da proteína, que é comparável com a mancha de Ruby SYPRO amplamente utilizado e não realizáveis com manchas de prata tradicionais. O gel pode ser fotografado em sistemas de documentação comumente usados gel com uma lâmpada de ultravioleta (comprimento de onda de excitação: canal de 302/365 nm; emissão: ~ 490-530 nm) em muitos laboratórios biológicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Precast gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25977</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300W Power Supply (230 VAC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PS0301</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31630-25G-R</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bragg and co.</td>
			<td>42520J</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>103201A</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Synthesis A10</td>
			<td>Merk</td>
			<td>-</td>
			<td>Provides 18.2 M&#937;.cm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel documentation system (c600 model)</td>
			<td>Azure biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent silver staining of proteins in polyacrylamide gels

Coloração prata é uma técnica colorimétrica amplamente usada para visualizar bandas de proteínas em gel de poliacrilamida após eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE). As manchas de prata clássicas tem alguns inconvenientes, tais como o fundo elevado, coloração, recuperação de proteína pobre, baixa reprodutibilidade, uma estreita faixa dinâmica linear para quantificação e compatibilidade limitada com espectrometria de massa (MS). Agora, com o uso de uma sonda de fluorogenic Ag+ , TPE-4TA, desenvolvemos uma fluorescente prata coloração método para a visualização de proteínas totais em gel de poliacrilamida. Esta mancha nova evita a etapa de redução de prata problemático em manchas de prata tradicionais. Além disso, a mancha de prata fluorescente demonstra boa reprodutibilidade, sensibilidade e quantificação linear na detecção de proteínas, tornando-se uma mancha de gel de proteína útil e prático.

As bandas de proteínas coradas pela mancha prata fluorescente apresentam uma fluorescência verde intensa sob uma lâmpada de UV 365 nm. Todas as bandas de proteínas 14 (10-200 kDa), de cima para baixo, eram claramente visíveis, correlacionando-se bem com os 14 cor vermelha manchada com o Ruby SYPRO corante (Figura 2)10.
Em relação a deteção quantitativa de proteína, ...

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Este é um novo método de coloração de gel que utiliza uma sonda de prata fluorogênica para converter a coloração tradicional de prata em uma coloração de prata fluorescente. Este método mostrou melhor desempenho em comparação com a coloração convencional de nitrato de prata e coloração de Rubi SYPRO enquanto usava um protocolo simples e simples sem aldeídos. Demonstrando o procedimento estará Alex Wong, um assistente de pesquisa do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, diluir as amostras de proteína com uma solução contendo água destilada, tampão LDS e um agente redutor de amostras. Configure um mini tanque de gel cheio de buffer MES para executar o SDS-PAGE com um gel de proteína Bis-Tris de 4-12%. Carregue os poços com a amostra de proteína preparada e execute o gel a uma tensão constante de 200 volts por 30 minutos.Após a eletroforese, submergir o gel em uma solução de 100 mililitros contendo etanol e ácido acético em um agitador orbital e incubar duas vezes por 30 minutos cada um em temperatura ambiente enquanto treme a 50 rpm. Em seguida, lave o gel três vezes com água ultrauso em um recipiente limpo com cada lavagem com duração de 10 minutos. Primeiro, dissolver 0,01 gramas de nitrato de prata em 10 mililitros de água ultrapura para preparar uma solução de estoque com uma concentração de 0,1%Adicione 100 microliters da solução de estoque em 100 mililitros de água ultrapura para fazer a solução de trabalho de nitrato de prata.Em um capô de fumaça, submergir o gel em 100 mililitros da solução de trabalho de nitrato de prata em uma câmara de vidro selada. Use papel alumínio para proteger o gel da luz durante a impregnação e incubar por uma hora enquanto treme a 50 rpm em um agitador orbital. Depois disso, lave o gel duas vezes com água ultrauso em um recipiente limpo, com cada lavagem usando aproximadamente 100 mililitros de água e durando 60 segundos.É importante usar água ultrauso para limpar o gel após a etapa de impregnação de prata para minimizar a coloração de fundo. Primeiro, adicione 50 mililitros de água ultrapura a três miligramas de corante TPE-4TA. Sonicar a solução por três minutos e adicionar cinco microliters de solução de hidróxido de sódio de um molar entre cada sessão de sônica para ajudar a dissolver o corante, geralmente até três vezes.Em seguida, verifique a fluorescência da solução sob uma lâmpada UV de 365 nanômetros para garantir que o corante esteja totalmente dissolvido. Apenas soluções fracas ou não emissivas indicam dissolução total. Para preparar a solução de desenvolvimento fluorogênico, adicione 10 mililitros da solução de estoque TPE-4TA a 90 mililitros de água ultrauso.Use um medidor de pH para verificar o pH da solução. Sintonize a solução a um pH entre 7 e 9, usando solução diluída de hidróxido de sódio ou ácido acético se o pH estiver fora de alcance. Em seguida, transfira o gel para um recipiente limpo e vedável com 100 mililitros da solução fluorogênica em desenvolvimento e certifique-se de que o gel esteja completamente imerso.Sele o recipiente e cubra-o para protegê-lo da luz. Agite o recipiente durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm e à temperatura ambiente. Transfira o gel para um recipiente limpo e desinto-lo em 100 mililitros de 10% de etanol por 30 minutos.Em seguida, enxágue o gel em água ultrauso por cinco minutos. O gel pode ser visualizado em um transilluminador de bancada ou imageado em uma máquina de documentação de gel no canal de 365 nanômetros ou no canal de 302 nanômetros. Neste estudo, um novo método de coloração de prata fluorescente é usado para manchar proteínas em géis de poliacrilamida.As faixas proteicas manchadas pela mancha de prata fluorescente exibem um verde intenso sob uma lâmpada UV de 365 nanômetros. Todas as 14 bandas de proteína são claramente visíveis e se correlacionam bem com as bandas de cor vermelha manchadas pelo corante SYPRO Ruby. Este método de coloração de prata fluorescente parece ter uma alta resolução.Para algumas bandas proteicas, a sensibilidade da mancha de prata fluorescente também é ligeiramente melhor do que a da mancha fluorescente SYPRO Ruby. Em particular, o desempenho desta mancha é melhorado para as faixas proteicas entre 10 e 40 kilodaltons, o que indica que o novo método é particularmente útil para a detecção de proteínas com baixo peso molecular. Como se pode ver, os dados também sugerem que a mancha de prata fluorescente dá uma boa e uniforme linearidade para todas as 14 proteínas em uma gama relativamente ampla de quantificação proteica.Enquanto a mancha de nitrato de prata deu um alto nível de sinal de fundo e picos distorcidos, a mancha de prata fluorescente detectou as bandas com bom contraste e distribuição de intensidade uniforme comparável à mancha de Rubi SYPRO em todas as 14 proteínas. As etapas de lavagem são importantes, pois limitam a solução de fixação residual de interromper a impregnação de prata ou o desenvolvimento fluorogênico. Ao usar nitrato de prata, evite o contato com a pele.Limpe qualquer derramamento imediatamente. Use roupas de proteção e luvas e descarte como resíduos químicos.

Research

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