Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

الكتاب تقر دعم البنية التحتية من علوم الحياة مختبر ومعهد كارولينسكا. كما تقر المؤلفين الإدخال ومناقشات مع شهادتي ميكايلا، ماغدالينا أوتروكا وتوماس Lundbäck.

1-زرع الخلايا
ملاحظة: للحصول على لمحة عامة عن سير العمل راجع الشكل 1. وتتوفر قائمة مفصلة بالمواد والمواد الكاشفة في الجدول للمواد.
<ol><li>قبل البذر للخلايا، حفر ثقوب مع حفر قياسية في إطار أسود 384-جيدا التصوير لوحات الفحص لتجنب الوقوع تحت صفيحة...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

كما تمت مناقشته في المقطع النتائج، هناك العديد من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء. أولاً، من المهم التعرف كاشف تقارب عالية الجودة. نوصي بفحص مكتبة صغيرة من الأجسام المضادة لكل من الهدف المنشود. بعد أن تم تحديد جسم الأولية، من المهم أيضا التحقق من صحة النظام لعدد من المواقع المختلفة ملزمة ال?...

عند تطوير عقاقير جديدة أو المجسات الكيميائية من الضروري للزوجين التأثير الدوائي الملاحظ أو قراءات وظيفية للقياسات لشغل المستهدفة أو المشاركة في الخلايا الحية1،،من23. هذه البيانات ضرورية للتأكد من أن الجزيئات الصغيرة في الواقع تصل إلى هدفها المنشود، وكذلك للتحقق من صحة الفرضية البيولوجية وراء البروتين المستهدف التحديد4،5. وعلاوة على ذلك، وأثناء تطوير الأدوية، تستخدم نظم نموذجية للتعقيد المتزايد تحديد وتأكيد رائد مركبة قبل التجارب السريرية. لتأكيد الترجمة البيولوجيا عبر هذه النظم الإكلينيكية، أساليب لاقتفاء أثر المخدرات-هدف المشاركة والمصاحبة لعلم الأحياء في جميع مراحل عملية التنمية هذه الحاسمة.
مشاركة المخدرات المستهدفة تقليديا تحديا لرصد في الخلايا الحية مع جزيئات صغيرة أونفونكتيوناليزيد والبروتينات، وبخاصة على مستوى خلية واحدة مع القرار المكانية6،7. أسلوب واحد مؤخرا لمراقبة التفاعل بين معدلة العقاقير والبروتينات في الخلايا الحية هي المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) الذي هو استقرار البروتين الأصلي في الاستجابة لتحدي حرارة المستحثة يجند كمياً8، 9،10. يتم ذلك عن طريق تحديد كمية البروتين للذوبان المتبقية بعد التعرض لحرارة تحد. في الكشف عن أولى سيتسا، استخدمت لطخة غربية للكشف. لتمكين حملات الفحص وضرب فرز مجموعات أكبر مجمع، الجهود المبذولة لزيادة إنتاجية تجارب سيتسا قد تؤدي إلى تطوير عدة فحوصات متجانسة، وعلى أساس ميكروسكوبية10،11. ومع ذلك، هو القيد واحد مع هذه الأساليب حاليا أفضل فإنها تكون مناسبة للعلاج المركب في تعليق خلية ويتطلب الكشف عن تحلل الخلية، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات المكانية. سيتسا يمكن تطبيقها تجريبيا أما إلى تحول المستحثة يجند في التجميع الحراري درجة الحرارة (Tagg) في تركيز واحد من جزيء صغير أو تركيز يجند اللازمة لتحقيق الاستقرار في البروتين عند درجة حرارة واحدة. هذا الأخير هو ما يسمى الجرعة متحاور استجابة بصمات الأصابع (إيتدرف) للدلالة على الاعتماد على هذه القياسات في ظروف تجريبية محددة.
والهدف من هذا البروتوكول قياس الاشتباك المستهدفة باستخدام سيتسا في الخلايا ملتصقة بكشف الأجسام المضادة (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت مع ارتفاع محتوى الفحص المجهري12. ويمتد هذا الإجراء منصة سيتسا الأصلي للسماح لخلية واحدة القياس الكمي لمشاركة الهدف مع الحفاظ على الترجمة سوبسيلولار. جدير بالذكر أن خلافا للعديد من التقارير السابقة، في هذا الإجراء العلاج المركب يتم في الخلايا ملتصقة العيش دون مفرزة السطحية أو الغسيل قبل التحدي الحرارة، وبالتالي الحفاظ على توازن المنشأة ملزمة ونحن نهدف إلى قياس13. حاليا، يتم التحقق من الأسلوب لهدف واحد بروتين p38α (MAPK14) في الخلية عدة خطوط، ويحدونا الأمل في أن تقاسم هذا الإجراء هذه التقنية يمكن تطبيقها على نطاق واسع عبر البروتين ذوبان. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها في جميع أنحاء خط الأنابيب التنمية المخدرات من الفحص، وضرب التعقب عن طريق رصد الهدف المشاركة في فيفو.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

كوانتيتاتينج تفاعل الجزيئات الصغيرة مع الهدف المقصود من البروتين أمر بالغ الأهمية لتطوير العقاقير والتحقق من صحة الهدف والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. أساليب قياس هذه الظاهرة دون تعديل الهدف بروتين أو جزيء صغير قيمة خاصة ولو من الناحية التقنية الصعبة. المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) أسلوب واحد لرصد المشاركة المستهدفة في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا تعديلاً للبروتوكول سيتسا الأصلي، والذي يسمح لقياسات عالية الإنتاجية مع احتفاظها بالتعريب سوبسيلولار على مستوى الخلية الواحدة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر تقدما هاما لتطبيق سيتسا لتوصيف متعمقة للتفاعل المجمع المستهدف، لا سيما في السكان غير متجانسة من الخلايا.

ويصف البروتوكول المبينة في الشكل 1 سير العمل الأساسي لتشغيل سيتسا فحوصات على خلايا ملتصقة بالكشف عن البروتين للذوبان المتبقية بتصوير المحتوى عالية. سير العمل هذا يمكن تكييفها بسهولة لجميع مراحل التطور الإنزيم عن طريق تعديل تخطيط لوحة من المركبات أو المو...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

قياسات للمخدرات هدف المشاركة أمران أساسيان لتطوير العقاقير الفعالة والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس الاشتباك المخدرات المستهدفة باستخدام التصوير عالية المحتوى في تكييف الميكروسكوبية المتوافقة المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الكيميائية واكتشاف الأدوية. مثل, هل مركبك ربط البروتين الهدف? المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يوجد شرط من انفصال الخلايا المتصونة.ويمكن تحديد التوطين المكاني عن طريق التصوير. على الرغم من أننا قد طبقت هذه الطريقة في خطوط الخلية، فمن الممكن أيضا لتطبيق هذه الطريقة لأنظمة الخلايا الأخرى مثل الثقافات الأساسية والثقافات المشتركة. قبل بذر الخلايا، ضع لوحات فحص سوداء 384 بئرًا في غطاء لثقافة الأنسجة، واغطي اللوحات بورق الألومنيوم قبل استخدام حفر قياسي لإجراء ثلاثة ثقوب قطرها 3.5 ملليمتر على طرفي كل لوحة.عندما تكون اللوحات جاهزة، استخدم تقنية معقمة لغسل ثقافة الخلايا A-431 مع 5 إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. واحتضان الخلايا مع مليلترين من التربسين في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا. بعد العد، وتمييع الخلايا إلى 5 مرات 10 إلى الخلايا 4 لكل ملليلتر في المتوسطة الثقافة، والبذور 40 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من كل لوحة المقايسة.يهز بلطف كل لوحة من جانب إلى آخر بعد البذر لضمان توزيع متجانس للخلايا عبر قيعان البئر. لتقليل تأثيرات حافة اللوحة، السماح للخلايا بالاستقرار في الجزء السفلي من لوحات الفحص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الجزء الخلفي من غطاء تدفق الفلام قبل وضع اللوحات في غرفة مرطبة مخصصة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في يوم التجربة، استخدم غسالة لوحة لpirate المتوسطة من كل بئر.وإضافة 30 ميكرولترات من مركب الفائدة في التركيز التجريبي المناسب إلى الآبار التجريبية المناسبة. ختم لوحات الفحص المعالجة بالمركب بأختام لوحة تنفس. وإرجاع اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.لفضح الخلايا لتحدي الحرارة، تعيين حمام الماء أولا إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة، ووضع لوحة وهمية غير المخاين التي تحتوي على نفس حجم المتوسطة في كل بئر لوحة المقايسة في الحمام، جنبا إلى جنب مع ميزان الحرارة الحرارية لرصد درجة الحرارة داخل الآبار. عندما تم الوصول إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة، وإزالة ختم تنفس من كل لوحة المقايسة وإعادة ختم لوحات مع رقائق الألومنيوم لاصقة ضيقة لضمان عدم تسرب المياه في الآبار خلال التدفئة اللاحقة في حمام الماء. الحفاظ على الثقوب المحفورة داخل إطار اللوحة يمكن الوصول إليها.ضع لوحات الفحص ولوحة وهمية جديدة في حمام الماء ، مع قيعان الصفائح الزاوية نحو سطح الماء لإجبار أي هواء متبقي من تحت الألواح ، والبدء في مراقبة درجة حرارة اللوحة الوهمية الجديدة. التدفئة حتى من لوحة أمر بالغ الأهمية لأداء الفحص. الحرص على وضع لوحة في حمام الماء بحيث لا توجد فقاعات الهواء المحاصرين تحتها.بعد ثلاث دقائق، على الفور تبريد لوحات في حمام ماء ثان من المياه درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل تحليلها. لتصوير الخلايا، أولا إضافة 10 ميكرولترات من 16٪ شبهformaldehyde مباشرة إلى لوحات فحص لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التثبيت، وغسل الخلايا مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني على غسالة لوحة، وإضافة 20 ميكرولترات من 0.1٪NP40 لاحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة ، وغسل الخلايا كما هو موضح. وحجب الخلايا مع 15 ميكروليتر من 1٪ من الألبومين المصل البقري، أو BSA، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم غسالة اللوحة لاستنشاق مصل الحجب ، وإضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام إلى الآبار المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وغسل كل بئر مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتسمية الخلايا مع 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بالنسبة للتلوين النووي للخلايا، أضف 10 ميكرولترات من صبغة نووية مناسبة لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني كما هو موضح.تسمية الخلايا مع 10 ميكرولترات من قناع الخلية في بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تليها غسل الماضي مع برنامج تلفزيوني. ثم الاستغناء 60 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني جديد لكل بئر، وختم لوحات مع رقائق الألومنيوم حتى التصوير.لتصوير الخلايا، التقط أربع صور في البئر على جهاز تصوير عالي المحتوى باستخدام القنوات الفلورية المناسبة تحت الهدف 10 مرات باستخدام التركيز التلقائي بالليزر وتطبيق binning على أثناء الاستحواذ. ثم تخزين الصور كملفات نقطة tiff رمادية 16 بت مع البيانات الوصفية. لا ينبغي أن تتعطل التعرف على الأجسام المضادة عن طريق التغيرات التشكلية في البروتين الهدف التي قد تكون مستحثة عن طريق ملزمة ليغاند.على سبيل المثال، BIRB796 لديه معدل إيقاف طويل، وتحديد كمية المشاركة المستهدفة ممكن فقط عن طريق تطبيق خطوة استرداد مستضد. هذه التجربة التمثيلية منحنى التجميع الحراري للخلايا المعالجة بمركبات التحكم الإيجابية والسلبية توضح نطاقات تثبيت البروتين النموذجية بعد علاج الخلايا بالمركبات في درجات حرارة مختلفة. هنا نموذجي تجربة بصمة الجرعة الحرارية استجابة يظهر لإظهار نطاقات تمثيلية لتثبيت البروتين استجابة لجرعات مختلفة من مركب تجريبي.تطبيق تحديات الحرارة الحرارية الأيزوحرارية للفحص المركب لتحديد المجلدات الجديدة للبروتين المستهدف يسمح بتحليل عدد كبير من المركبات بتركيز واحد في وقت واحد، قبل بصمة الجرعة الحرارية للإستجابة للإيدز لتأكيد استقرار البروتين المستهدف. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الظروف التجريبية الدقيقة، مثل طول ودرجة حرارة التحدي الحراري تؤثر على القوة الملحوظة للمركبات. لا تنس أن العمل مع شبه شكلي يمكن أن تكون خطرة للغاية.وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل اتباع المبادئ التوجيهية للسلامة المؤسسية، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

تحديد المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس سبيكتروفوتوميتريك

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

القياس المباشر للمشاركة المستهدفة KDM1A باستخدام الاختبارات المناعية المستندة إلى العلاج الكيميائي

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

الكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي في الخلايا المنضمة من قبل 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين Diacetate تلطيخ

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

تقدير محتوى اللجنين الكتلة الحيوية النباتية باستخدام حمض ثيوغليكوليك (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

قياسات نقل الطاقة الرنين Förster في الخلايا النباتية الحية

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...