Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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作者承认科学生命实验室和卡洛林斯卡研究所提供的基础设施支持。提交人还感谢与 michaela valin、magdalena Otrocka 和 thomas lundbäck 的投入和讨论。

1. 细胞的播种
请注意:有关工作流的一般概述, 请参见图 1。材料和试剂的详细清单可在材料表中找到。
<ol><li>在播种细胞之前, 在黑色384孔成像检测板的框架内安装带有标准钻头的钻孔, 以避免气泡在加热步骤后被困在板下。为了避免塑料颗粒进入井在这一步骤中, 并保持无菌条件, 密封板与粘合剂铝箔或覆盖板之前, 在一个组?...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

如结果部分所述, 该过程有几个关键步骤。首先, 确定高质量的亲和力试剂是很重要的。我们建议为每个所需的目标筛选一个小型抗体库。在选择了初级抗体后, 如果合适的情况下, 验证蛋白质靶点的一些不同结合位点的系统也很重要。非常鼓励通过省略热挑战来反筛选干扰检测信号的化合物, 如图2所示。当观察到配体存在的减少信号时, 可以测试步骤5.2 中描述的抗原检索协?...

在开发新药或化学探针时, 必须将观察到的药理作用或功能读数与目标占位率或参与活细胞 1,2,3的测量结合起来。这些数据是必要的, 既可以确保小分子实际上达到其预期目标, 也可以验证蛋白质靶标选择4,5背后的生物学假设。此外, 在药物开发过程中, 在临床试验之前, 使用日益复杂的模型系统来选择和证实铅化合物。为了确认生物学在这些临床前系统中的翻译, 在整个开发过程中追踪药物靶手和伴随的生物学的方法至关重要。
药物靶向参与传统上是一个具有挑战性的小分子和蛋白质的活细胞监测的难题, 特别是在具有空间分辨率6,7的单细胞水平.最近观察未修饰药物与活细胞中蛋白质相互作用的方法之一是细胞热转移试验 (cetsa), 在该方法中, 配体诱导的本地蛋白质在应对热挑战时的稳定性被量化8, 9,10。这是通过量化剩余的可溶性蛋白质后暴露在热挑战。在 ctsa 的首次公开中, 使用了西方印迹进行检测。为了能够进行筛选活动和对较大的化合物集合进行分类, 为提高 cetsa 实验的吞吐量所做的努力导致了几个均匀的、基于微板的检测10、11的开发。然而, 这些方法的一个局限性是, 它们目前最适合在细胞悬浮液中进行复合治疗, 检测需要细胞裂解, 导致空间信息丢失。ctsa 可以在实验中应用, 既可以作为在单个分子浓度下的热聚集温度 (tagg) 的配体诱导转移, 也可以应用于在单一温度下稳定蛋白质所需的配体浓度。后者被称为等温剂量响应指纹 (itdrf), 以表示这些测量的依赖性于特定的实验条件。
该方案的目的是利用 cetsa 在粘附细胞中的靶点接触进行免疫荧光 (if) 抗体检测,并进行高含量显微镜12。此过程扩展了原始的 cetsa 平台, 允许对目标参与进行单细胞量化, 并对亚细胞定位进行保护。值得注意的是, 与以往许多报告不同的是, 在这一过程中, 复合治疗是在活体粘附细胞中进行的, 在热挑战之前没有表面分离或清洗, 从而保持了我们旨在测量13的既定结合平衡。目前, 该方法已被验证为一个目标蛋白 p38α (mapk14) 在几个细胞系, 我们希望通过分享这个程序的技术可以广泛地应用于整个融化蛋白质组。我们预计, 该协议可以在整个药物开发过程中进行调整, 从筛选、打击试验到监测体内的目标参与。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

量化小分子与其预期蛋白质靶标的相互作用对于药物开发、目标验证和化学探针验证至关重要。在不改变蛋白质靶点或小分子的情况下测量这种现象的方法特别有价值, 尽管在技术上具有挑战性。细胞热转移分析 (cetsa) 是监测活细胞中目标参与的一种技术。在这里, 我们描述了对原始 cetsa 协议的改编, 该协议允许进行高吞吐量测量, 同时在单个单元级别保持亚细胞定位。我们相信该协议为 cetsa 在复杂目标相互作用的深入表征方面的应用提供了重要的进展, 特别是在细胞的异质种群中。

图 1中概述的协议描述了通过高含量成像检测剩余可溶性蛋白质, 在粘附细胞上运行 cetsa 检测的基本工作流程。通过修改化合物或试剂的板材布局, 可以很容易地适应分析开发的所有阶段.我们详细介绍了以下几个预期用例的预期结果。
抗体鉴定和检测开发。成功结果的先决条件是...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

利用高含量成像对增强细胞中的目标参与进行量化

药物靶向接触的测量是有效药物开发和化学探针验证的核心。在这里, 我们详细介绍了一种在细胞热转移分析 (cetsa) 的微板兼容适应中使用高含量成像测量药物靶点接触的协议。

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

该方法有助于回答化学生物学和药物发现中的关键问题。例如，你的化合物与目标蛋白质结合吗？该技术的主要优点是，对粘附细胞没有分离的要求。空间定位可以通过成像确定。尽管我们已经在细胞系中应用了此方法，但也可以将此方法应用于其他细胞系统，如原培养物和共培养物。在播种细胞之前，将黑色384孔成像检测板放在组织培养罩中，并在使用标准钻头在每个板的两端打三个3.5毫米直径的孔之前用铝箔盖住板。当板准备就绪时，使用无菌技术用 5 到 10 毫升 PBS 清洗 A-431 细胞培养。在37摄氏度下用两毫升的三辛细胞孵育，直到细胞分离。计数后，将细胞稀释至培养基中每毫升5倍至第4个细胞，并在每个检测板的每个井中播种40微升细胞。播种后，从一侧轻轻摇动每个板，以确保细胞在井底的均匀分布。为了尽量减少板边缘效应，允许细胞在层流罩背面的室温下在检测板底部沉淀20分钟，然后将板置于定制加湿室中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下放置两到三天。在实验当天，使用板垫圈从每一个井中吸气介质。并在适当的实验井中加入30微升的息化合物，浓度适当。用透气板密封件密封经过复合处理的检测板。将板返回细胞培养箱30分钟。要使细胞面临热挑战，首先将水浴设置为适当的实验温度，并在浴池中放置一个未密封的假板，该板包含与检测板相同体积的介质，以及用于监测水井内温度的热电偶温度计。当达到适当的实验温度时，从每个检测板上取下透气密封，用紧密的粘胶铝箔重新密封板，以确保水在水浴中随后加热时不会渗入井中。保持板架内的钻孔可访问。将检测板和新的假板放入水浴中，板的底部向水面倾斜，以迫使板下剩余的空气，并开始监测新虚拟板的温度。板的均匀加热对于检测性能至关重要。小心把盘子放在水浴里，这样下面没有气泡。三分钟后，立即将盘子用室温水第二水浴冷却五分钟，然后进行分析。要对细胞进行成像，首先将10微升16%的甲醛直接加入检测板，在室温下孵育20分钟。在固定期结束时，在板垫圈上用300微升PBS清洗细胞，并加入20微升0.1%NP40，在室温下孵育10分钟。在孵育结束时，如证明的洗涤细胞。并在室温下用15微升1%牛血清白蛋白（BSA）阻断细胞1小时。接下来，使用板垫圈吸制阻断血清，并将感兴趣的原抗体的10微升加入适当的井中，在室温下孵育一小时。在孵育结束时，用300微升PBS洗净每井，并在室温下用10微升适当的二次抗体标记细胞，在室温下一小时免受光线影响。对于细胞的核染色，在室温下，在每一个井中加入10微升适当的核染料10分钟。并清洗PBS中的细胞，如所证明的。在室温下，每井用10微升的细胞掩码标记细胞，30分钟。接着是最后一次用 Pbs 洗。然后将 60 微升的新鲜 PBS 分配到每口井，然后用铝箔密封板，直到成像。要对细胞进行成像，使用自动激光自动对焦的10倍目标下的适当荧光通道，在高含量成像仪上每井捕获四个图像，并在采集过程中应用装箱。然后将图像与元数据一起存储为 16 位灰度点 tiff 文件。抗体识别不应因配体结合引起的靶蛋白的构象变化而中断。例如，BIRB796 具有很长的关闭率，只有应用抗原检索步骤，才能量化目标参与度。这种具有代表性的热聚集曲线实验，用于使用正向和负对照化合物处理的细胞，说明了在各种温度下用化合物处理细胞后的典型蛋白质稳定范围。这里展示了一个典型的等温剂量-反应指纹实验，以展示蛋白质稳定对不同剂量的实验化合物的反应的代表性范围。应用等温热挑战进行化合物筛选，以识别靶蛋白的新粘结剂，允许在一次单一浓度下分析大量化合物，然后对命中的等温剂量-反应指纹进行识别，以确认目标蛋白稳定。在尝试此程序时，重要的是要记住，确切的实验条件，如热挑战的长度和温度，会影响化合物的观测效力。不要忘记，使用甲醛可能非常危险。执行此程序时，应始终采取预防措施，例如遵循机构安全准则。

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