Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Forfatterne anerkende infrastruktur støtte fra videnskab for Life laboratorium og Karolinska Institutet. Forfatterne også anerkende input og drøftelser med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka og Thomas Lundbäck.

1. såning af celler
Bemærk: Se figur 1for en generel oversigt over arbejdsprocessen. En detaljeret liste over materialer og reagenser, der er tilgængelige i Tabel af materialer.
<ol><li>Inden såning af cellerne, bore huller med en standard bor i ramme af sort 384-godt imaging assay plader til at undgå luftbobler blive fanget under pladen senere under trinnet varme. Undgå plastik partiklerne ind brøndene under dette trin o...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Som omtalt i afsnittet resultater, er der flere vigtige skridt til proceduren. For det første er det vigtigt at identificere en høj kvalitet affinitet reagens. Vi anbefaler screening et lille bibliotek med antistoffer for hver ønsket mål. Efter en primær antistof er blevet valgt, er det også vigtigt at validere system for en række forskellige bindingssteder protein-målet, hvis det er relevant. Counter screening for forbindelser, der forstyrrer analysen signal, som vist i figur 2 c ve...

Ved udvikling af nye stoffer eller kemiske sonder er det vigtigt at koble konstaterede farmakologiske virkning eller funktionelle udlæsning til målinger af target belægning eller engagement i levende celler1,2,3. Disse data er nødvendige for at sikre at den lille molekyle i virkeligheden når sin ønskede mål og validere biologiske hypotesen bag protein target udvalg4,5. Desuden, under udvikling af lægemidler, modelsystemer af stigende kompleksitet der bruges til at vælge og bekræfte en bly sammensatte forud for kliniske forsøg. For at bekræfte oversættelse af biologi på tværs af disse prækliniske systemer, er metoder til opsporing stof-mål engagement og ledsager biologi i hele denne udviklingsproces kritisk.
Drug-mål engagement har traditionelt været udfordrende at overvåger i levende celler med unfunctionalized små molekyler og proteiner, især på det enkelt celle niveau med rumlige opløsning6,7. En nyere metode til at observere samspillet mellem uændrede stoffer og proteiner i levende celler er cellulære termisk Skift assay (CETSA) hvor ligand-induceret stabilisering af et nativt protein som svar på en varme udfordring er kvantificeret8, 9,10. Dette opnås ved at kvantificere resterende opløseligt protein efter udsættelse for en varme udfordring. I den første offentliggørelse af CETSA, blev vestlige skamplet brugt til registrering. For at aktivere screening kampagner og ramte triaging af større sammensatte samlinger, har bestræbelser på at øge gennemløbet af CETSA eksperimenter ført til udviklingen af flere homogen, mikrotiterplade-baseret assays10,11. Dog er en begrænsning med disse metoder at de er i øjeblikket bedst egnet til sammensatte behandling i celle suspensioner og påvisning kræver celle lysis, fører til tab af geografisk information. CETSA kan anvendes eksperimentelt enten som en ligand-induceret forskydning i termisk sammenlægning temperatur (Tagg) på en enkelt koncentration af den lille molekyle eller den ligand koncentration nødvendigt at stabilisere proteinet på en enkelt temperatur. Sidstnævnte kaldes isotermisk dosis svar fingeraftryk (ITDRF) til at betyde afhængighed af disse målinger på de specifikke forsøgsbetingelser.
Målet med denne protokol er at måle mål engagement ved hjælp af CETSA i vedhængende celler af immunfluorescent påvisning af antistof (IF) med high-indhold mikroskopi12. Denne procedure udvider den oprindelige CETSA platform til at give mulighed for enkelt-celle kvantificering af mål engagement med bevarelse af subcellulært lokalisering. Navnlig, i modsætning til mange tidligere rapporter, er i denne procedure sammensatte behandling udført i live vedhængende celler uden overflade udstationering eller vask før den varme udfordring, således at beskytte det etablerede bindende ligevægt vi sigter mod at måle13. I øjeblikket, metoden er valideret for ét mål protein p38α (MAPK14) i flere cellelinjer, og vi håber, at ved at dele denne procedure teknikken kan anvendes bredt på tværs af smeltende proteomet. Vi forventer, at denne protokol kan tilpasses hele stof udvikling rørledning fra screening, ramte triaging gennem overvågning af target engagement i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating samspillet mellem små molekyler med deres tilsigtede protein mål er kritisk for udvikling af lægemidler, target validering og kemiske sonde validering. Metoder, der måler dette fænomen uden ændring af protein mål eller lille molekyle er særlig værdifuld, selvom teknisk udfordrende. Cellulære termisk Skift assay (CETSA) er en teknik til at overvåge mål engagement i levende celler. Her beskriver vi en tilpasning af den oprindelige CETSA protokol, som giver høj overførselshastighed målinger samtidig bevare subcellulært lokalisering på enkelt celle-niveau. Vi mener, at denne protokol tilbyder vigtige fremskridt til anvendelsen af CETSA for dybdegående karakterisering af sammensatte-target interaktion, især i heterogene befolkninger af celler.

Den protokol, der er skitseret i figur 1 beskriver den grundlæggende arbejdsgang for at køre CETSA assays på vedhængende celler med påvisning af resterende opløseligt protein af høj indhold billeddannelse. Denne arbejdsproces kan være let tilpasses til alle faser af analysen udvikling ved at ændre layoutet plade af forbindelser eller reagenser14. Vi detalje forventede resultater for flere forventede brug tilfælde nedenfor.</p...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ved hjælp af højt indhold Imaging for at kvantificere mål Engagement i vedhængende celler

Målinger af drug target engagement er centrale for udvikling af effektive lægemidler og kemiske sonde validering. Vi detalje her, en protokol til måling af stof-mål engagement ved hjælp af høje indhold billeddannelse på en mikrotiterplade-kompatible tilpasning af cellulære termisk Skift assay (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i kemisk biologi og narkotika opdagelse. Såsom, gør din sammensatte binde sig til målet protein? De vigtigste fordele ved denne teknik er, at der ikke er noget krav om løsrivelse af de klæbende celler.Og rumlig lokalisering kan bestemmes af billeddannelse. Selvom vi har anvendt denne metode i cellelinjer, er det også muligt at anvende denne metode på andre cellesystemer såsom primære kulturer og cokulturer. Før såning cellerne, skal du placere sorte 384-brønd imaging assay plader i et væv kultur hætte, og dække pladerne med aluminiumsfolie, før du bruger en standard boremaskine til at gøre tre 3,5-millimeter-diameter huller i begge ender af hver plade.Når pladerne er klar, skal du bruge aseptisk teknik til at vaske en A-431 cellekultur med 5 til 10 milliliter PBS. Og inkuber cellerne med to milliliter trypsin ved 37 grader Celsius, indtil cellerne løsner sig. Efter optælling fortyndes cellerne til 5 gange 10 til 4.Forsigtigt ryste hver plade fra side til side efter såning for at sikre en homogen fordeling af cellerne på tværs af brønden bunde. For at minimere pladekant effekter, lad cellerne til at bosætte sig i bunden af analysen plader i 20 minutter ved stuetemperatur i bagsiden af laminar flow hætte, før du placerer pladerne i en brugerdefineret befugtet kammer i to til tre dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. På dagen for eksperimentet skal du bruge en pladevasker til at aspirere mediet fra hver brønd.Og tilsæt 30 mikroliter af interessestoffet ved den relevante eksperimentelle koncentration til de relevante forsøgsbo godts. Forsegle de sammensatte behandlede analyseplader med åndbare pladetætninger. Og returnere pladerne til cellekultur inkubatoren i 30 minutter.For at udsætte cellerne for en varmeudfordring skal du først indstille vandbadet til den relevante forsøgstemperatur og placere en uforseglet attrapplade, der indeholder samme mængde medium pr. samt analysepladen, ind i badet sammen med et termoelementtermometer til overvågning af temperaturen i brøndene. Når den relevante eksperimentelle temperatur er nået, fjernes den åndbare forsegling fra hver analyseplade og forsegle pladerne igen med en stram klæbende aluminiumsfolie for at sikre, at der ikke lækker vand ind i brøndene under deres efterfølgende opvarmning i vandbadet. Hold de borede huller i pladerammen tilgængelige.Anbevis analysepladerne og en ny attrapplade i vandbadet, hvor pladernes bund vinkles mod vandoverfladen for at tvinge eventuel resterende luft fra under pladerne, og begynd at overvåge temperaturen på den nye dukkeplade. En jævn opvarmning af pladen er afgørende for analysens ydeevne. Pas på at placere pladen i vandbadet, så der ikke er nogen luftbobler fanget nedenunder.Efter tre minutter afkøles pladerne straks i et andet vandbad med vand ved stuetemperatur i fem minutter, før de analyseres. For at afbilde cellerne, først tilføje 10 mikroliter af 16% paraformaldehyd direkte til analysen plader for en 20-minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved afslutningen af fikseringsperioden vaskes cellerne med 300 mikroliter PBS på pladevaskeren, og der tilsættes 20 mikroliter på 0,1% NP40 for en 10-minutters inkubation ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne som påvist. Og blokere cellerne med 15 mikroliter af 1% kvæg serum albumin, eller BSA, i en time ved stuetemperatur. Brug derefter pladevaskeren til at aspirere blokerende serum, og tilsæt 10 mikroliter af det primære antistof af interesse til de relevante brønde for en times inkubation ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning vaskes hver brønd med 300 mikroliter PBS, og cellerne med 10 mikroliter af det relevante sekundære antistof mærkes i en time ved stuetemperatur beskyttet mod lys. For nuklear farvning af cellerne, tilsættes 10 mikroliter af en passende nuklear farvestof til hver brønd i 10 minutter ved stuetemperatur. Og vask cellerne i PBS som påvist.Mærl cellerne med 10 mikroliter cellemaske pr. brønd i 30 minutter ved stuetemperatur. Efterfulgt af en sidste vask med PBS. Derefter dispensere 60 mikroliter frisk PBS til hver brønd, og forsegle pladerne med aluminiumsfolie indtil billeddannelse.At billedet cellerne, fange fire billeder per godt på et højt indhold imager ved hjælp af de relevante fluorescerende kanaler under 10-gange målsætning ved hjælp af automatiseret laser autofokus og anvende binning til under erhvervelsen. Gem derefter billederne som 16-bit gråtoned-tiff-filer sammen med metadataene. Antistofgenkendelse bør ikke forstyrres af kropslige ændringer i målproteinet, som kan være forårsaget af ligandbinding.For eksempel har BIRB796 en lang off rate, og kvantificering af målet engagement er kun muligt ved at anvende en antigen hentning trin. Dette repræsentative termiske sammenlægningskurveeksperiment for celler behandlet med positive og negative kontrolforbindelser illustrerer typiske proteinstabiliseringsområder efter behandling af cellerne med forbindelserne ved forskellige temperaturer. Her vises et typisk isotermisk dosisrespons-fingeraftryksforsøg for at demonstrere repræsentative intervaller af proteinstabilisering som reaktion på forskellige doser af eksperimentel forbindelse.Anvendelsen af isotermiske varmeudfordringer for sammensat screening for at identificere nye bindemidler af målproteinet gør det muligt at analysere et stort antal forbindelser ved en enkelt koncentration ad gangen, før isotermisk dosisrespons fingeraftryk af slagene for at bekræfte målproteinstabilisering. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske, at de nøjagtige eksperimentelle betingelser, såsom længden og temperaturen af varmen udfordring indvirkning den observerede styrken af forbindelserne. Glem ikke, at arbejde med paraformaldehyd kan være yderst farligt.Og forholdsregler, såsom at følge institutionelle sikkerhedsretningslinjer, bør altid træffes, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høj overførselshastighed, absolut bestemmelse af indholdet af en markeret Protein i væv niveauer ved hjælp af kvantitative Dot duppes analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestemmelse af Phycobiliprotein indhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkte måling af KDM1A Target engagement ved hjælp af Chemoprobe-baserede Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Påvisning af totalreaktive iltarter i klæbende celler med 2',7'-Dichlordihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonans Energioverførsel Målinger i Levende PlanteCeller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...