Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

De auteurs erkennen infrastructuurondersteuning van wetenschap voor leven laboratorium en Karolinska Institutet. De auteurs erkennen ook input en discussies met Michaela Vallin, Magdalena Otrocka en Thomas Lundbäck.

1. het zaaien van de cellen
Opmerking: Zie afbeelding 1voor een algemeen overzicht van de werkstroom. Een gedetailleerde lijst van materialen en reagentia zijn beschikbaar in de Tabel van materialen.
<ol><li>Vóór het zaaien van de cellen, boorgaten met een standaard boor in het kader van zwarte 384-well imaging assay platen om luchtbellen wordt gevangen onder de plaat later tijdens de stap van de verwarming. Om te voorkomen da...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Zoals besproken in het gedeelte ' resultaten ', zijn er verschillende belangrijke stappen voor de procedure. Ten eerste is het belangrijk om te identificeren op een kwalitatief hoogwaardige affiniteit reagens. Het is raadzaam om de screening een kleine bibliotheek met antilichamen voor elke gewenste doelgroep. Nadat een primair antilichaam is geselecteerd, is het ook belangrijk voor het valideren van het systeem voor een aantal verschillende bandplaatsen van de eiwit-doelstelling, indien van toepassing. Contra screening ...

Bij het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen of chemische sondes er absoluut voor het koppelen van de waargenomen farmacologisch effect of functionele uitlezing aan metingen van doel bezetting of engagement in levende cellen1,2,3. Deze gegevens zijn nodig om ervoor te zorgen dat de kleine molecule in feite haar gewenste doel bereikt, zowel voor het valideren van de biologische hypothese achter eiwit target selectie4,5. Bovendien, tijdens Geneesmiddelenontwikkeling, modelsystemen van toenemende complexiteit worden gebruikt om te selecteren en bevestigen van een voorsprong samengestelde voorafgaand aan klinische proeven. Om te bevestigen vertaling van biologie over deze preklinische systemen, zijn methoden voor het traceren van drug-target engagement en bijbehorende biologie in dit ontwikkelingsproces kritisch.
Drug-target engagement is van oudsher uitdagend om te controleren in levende cellen met unfunctionalized kleine moleculen en proteïnen, vooral op het niveau van de eencellige met ruimtelijke resolutie6,7. Een recente methode voor het waarnemen van de interactie tussen ongewijzigd drugs en eiwitten in levende cellen is de cellulaire thermische shift test (CETSA) waarin ligand-geïnduceerde stabilisatie van een natuurlijk eiwit in antwoord op de uitdaging van een warmte is gekwantificeerde8, 9,10. Dit wordt bereikt door het kwantificeren van de resterende oplosbaar eiwit na blootstelling aan een uitdaging van de warmte. In de eerste vermelding van CETSA, werd westelijke vlek gebruikt voor de detectie. Om te schakelen van screening campagnes en sloeg triaging van grotere samengestelde collecties, hebben inspanningen om de doorvoer van CETSA experimenten geleid tot de ontwikkeling van verschillende homogene, microplaat assays10,11. Echter, een beperking met deze methoden is dat zij momenteel het best voor samengestelde behandeling in cel suspensies geschikt zijn en de detectie lysis van de cel vereist, wat leidt tot verlies van ruimtelijke informatie. CETSA kan worden toegepast in experimenteel als een ligand-geïnduceerde verschuiving in thermische aggregatie temperatuur (Tagg) op een enkele concentratie van het kleine molecuul of het ligand nodig om te stabiliseren van het eiwit bij een interne temperatuur. De laatste heet isothermische dosis reactie vingerafdrukken (ITDRF) om aan te duiden van de afhankelijkheid van deze metingen op de specifieke experimentele omstandigheden.
Het doel van dit protocol is voor het meten van betrokkenheid van de doelgroep met behulp van CETSA in Adherente cellen door immunefluorescentie (IF) antistofdetectie met hoge-inhoud microscopie12. Deze procedure strekt zich uit van de oorspronkelijke CETSA platform te maken voor eencellige kwantificering van target engagement met behoud van subcellular localisatie. Met name, in tegenstelling tot vele eerdere verslagen in deze procedure samengestelde behandeling wordt uitgevoerd in levende Adherente cellen zonder oppervlakte detachement of wassen vóór de uitdaging van de warmte, dus het behoud van het evenwicht van de vastgestelde bindende willen we meten van13. Op dit moment de methode is gevalideerd voor één doel eiwit p38α (MAPK14) in verschillende cellijnen, en we hopen dat door het delen van deze procedure de techniek kan worden toegepast in grote lijnen op de smeltende Proteoom. Wij verwachten dat dit protocol kan worden aangepast in de drug ontwikkeling pijpleiding van screening, hit triaging via toezicht op target engagement in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating van de interactie van kleine moleculen met hun beoogde eiwit-doelstelling is essentieel voor de Geneesmiddelenontwikkeling, doel validatie en chemische sonde validatie. Methodes die het meten van dit verschijnsel zonder wijziging van het eiwit doel of klein molecuul zijn bijzonder waardevol, hoewel technisch uitdagende. De cellulaire thermische shift test (CETSA) is een techniek om te controleren de betrokkenheid van de doelgroep in levende cellen. Hier beschrijven we een aanpassing van de originele CETSA-protocol, waarmee een hoge doorvoersnelheid metingen met behoud van subcellular localisatie op het niveau van één cel. Wij geloven dat dit protocol biedt belangrijke vorderingen op de toepassing van CETSA voor diepgaande karakterisering van samengestelde doelsoort interactie, met name in heterogene populaties van cellen.

Het protocol dat is uiteengezet in Figuur 1 beschrijft de fundamentele workflow voor het uitvoeren van CETSA assays op Adherente cellen met opsporing van resterende oplosbaar eiwit door hoge inhoud imaging. Deze werkstroom kan gemakkelijk aan te passen op alle stadia van de ontwikkeling van de bepaling worden door aanpassing van de indeling van de plaat van de verbindingen of reagentia14. We detail verwachte resultaten voor verschillen...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in chemische biologie en drugsontdekking. Zoals, bindt uw verbinding zich aan het doeleiwit? De belangrijkste voordelen voor deze techniek zijn dat er geen vereiste is van onthechting van de aanhangende cellen.En ruimtelijke lokalisatie kan worden bepaald door beeldvorming. Hoewel we deze methode in cellijnen hebben toegepast, is het ook mogelijk om deze methode toe te passen op andere celsystemen zoals primaire culturen en coculturen. Voordat u de cellen plaatst, plaatst u zwarte 384-well beeldvormende testplaten in een weefselkweekkap en bedek u de platen met aluminiumfolie voordat u een standaardboor gebruikt om drie gaten met een diameter van 3,5 millimeter aan beide uiteinden van elke plaat te maken.Wanneer de platen klaar zijn, gebruik aseptische techniek om een A-431 celcultuur te wassen met 5 tot 10 milliliter PBS. En broeden de cellen met twee milliliter trypsine bij 37 graden Celsius tot de cellen loskomen. Verdun de cellen na het tellen tot 5 keer 10 tot de 4e cel per milliliter in kweekmedium en zaad 40 microliter cellen tot elke put van elke testplaat.Zachtjes schudden elke plaat van links naar rechts na het zaaien om een homogene verdeling van de cellen over de put bodems te garanderen. Om de effect van de plaatrand te minimaliseren, laat de cellen zich aan de bodem van de testplaten gedurende 20 minuten op kamertemperatuur in de achterkant van de laminaire stroomkap nestelen voordat u de platen twee tot drie dagen in een aangepaste bevochtigde kamer plaatst bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Op de dag van het experiment, gebruik een plaat wasmachine om het medium te aspirate van elke put.En voeg 30 microliter van de verbinding van belang bij de juiste experimentele concentratie toe aan de juiste experimentele putten. Verzegel de samengestelde testplaten met ademende plaatafdichtingen. En breng de platen terug naar de celcultuur incubator voor 30 minuten.Om de cellen bloot te stellen aan een hitte-uitdaging, eerst het waterbad op de juiste experimentele temperatuur, en plaats een onverzegelde dummy plaat met hetzelfde volume van medium per goed als de testplaat in het bad, samen met een thermokoppel thermometer voor het toezicht op de temperatuur in de putten. Wanneer de juiste experimentele temperatuur is bereikt, verwijdert u de ademende afdichting van elke testplaat en sluit u de platen opnieuw af met een strakke lijmaluminiumfolie om ervoor te zorgen dat er geen water in de putten lekt tijdens de daaropvolgende verwarming in het waterbad. Het toegankelijk houden van de geboorde gaten in het plaatframe.Plaats de testplaten en een nieuwe dummyplaat in het waterbad, met de bodems van de platen schuin naar het wateroppervlak om de resterende lucht onder de platen te forceren en de temperatuur van de nieuwe dummyplaat te controleren. Een gelijkmatige verwarming van de plaat is van cruciaal belang voor de testprestaties. Zorg ervoor dat de plaat in het waterbad zodanig dat er geen luchtbellen gevangen onder.Na drie minuten, onmiddellijk afkoelen van de platen in een tweede waterbad van kamertemperatuur water gedurende vijf minuten voor hun analyse. Om de cellen in beeld te brengen, voeg u eerst 10 microliter van 16% paraformaldehyde rechtstreeks toe aan de testplaten voor een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de fixatieperiode, was de cellen met 300 microliter PBS op de plaatwasser en voeg 20 microliters van 0,1%NP40 toe voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de cellen zoals aangetoond. En blokkeer de cellen met 15 microliters van 1%runderserum albumine, of BSA, gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens de plaatwasser om het blokkerende serum aan te sporen en voeg 10 microliter van het primaire antilichaam van belang toe aan de juiste putten voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was elk goed met 300 microliter pbs, en label de cellen met 10 microliters van de juiste secundaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Voor nucleaire kleuring van de cellen, voeg 10 microliter van een geschikte nucleaire kleurstof aan elke put gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. En was de cellen in PBS zoals aangetoond.Label de cellen met 10 microliter celmasker per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gevolgd door een laatste wasbeurt met PBS. Dan afzien van 60 microliter verse PBS aan elke put, en verzegelen de platen met aluminiumfolie tot beeldvorming.Om de cellen in beeld te brengen, leg je vier beelden per put vast op een high-content imager met behulp van de juiste tl-kanalen onder de 10-voudige doelstelling met behulp van geautomatiseerde laserautofocus en pas binning toe tijdens de overname. Sla vervolgens de afbeeldingen op als 16-bits grijswaarden dot-tiff-bestanden, samen met de metagegevens. De herkenning van antilichamen mag niet worden verstoord door conformatieveranderingen in het doeleiwit die kunnen worden veroorzaakt door ligandbinding.BirB796 heeft bijvoorbeeld een lange off rate en kwantificering van de doelbetrokkenheid is alleen mogelijk door een antigenererende ophaalstap toe te passen. Dit representatieve thermische aggregatiecurve-experiment voor cellen die worden behandeld met positieve en negatieve controleverbindingen illustreert typische eiwitstabilisatiebereiken na behandeling van de cellen met de verbindingen bij verschillende temperaturen. Hier wordt aangetoond dat een typisch isothermale dosisresponsvingsvingvingsvingertexperiment representatieve reeksen eiwitstabilisatie aantoont in reactie op verschillende doses experimentele verbinding.De toepassing van isothermale warmte-uitdagingen voor samengestelde screening om nieuwe bindmiddelen van het doeleiwit te identificeren, maakt de analyse van een groot aantal verbindingen in één concentratie in één keer mogelijk, voordat isothermale dosisresponsvingeprinting van de hits om de beoogde eiwitstabilisatie te bevestigen. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de exacte experimentele omstandigheden, zoals de lengte en temperatuur van de hitte uitdaging invloed hebben op de waargenomen potentie van de verbindingen. Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn.En voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van richtlijnen voor institutionele veiligheid, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Directe meting van KDM1A target engagement met behulp van Chemoprobe-gebaseerde immunoassay

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Schatting van het ligninegehalte van plantaardige biomassa met thioglycolzuur (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonantie EnergieOverdracht Metingen in Levende Plantencellen

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...