Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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Les auteurs remercient soutien infrastructure Science for Life laboratoire et Karolinska Institutet. Les auteurs reconnaissent également l’entrée et discussions avec Michaela Vallin, Magdalena Otrocka et Thomas Lundbäck.

1. ensemencement de cellules
Remarque : Pour un aperçu général du flux de travail Voir la Figure 1. Une liste détaillée des matériels et réactifs sont disponibles dans la Table des matières.
<ol><li>Avant le semis des cellules, percer des trous avec un foret standard dans le cadre de 384 puits d’imagerie dosage plaques noires pour éviter les bulles d’air étant pris au piège sous la plaque plus tard au cours de l?...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Tel que discuté dans la section résultats, il y a plusieurs étapes clés de la procédure. Tout d’abord, il est important d’identifier un réactif d’affinité de haute qualité. Nous vous recommandons une petite bibliothèque d’anticorps pour chaque cible souhaitée. Après qu’un anticorps primaire a été sélectionné, il est aussi important de valider le système pour un certain nombre de sites de liaison différents de la cible de la protéine, le cas échéant. Contre le dépistage des composés qui int...

Lors de l’élaboration de nouveaux médicaments ou sondes chimiques, il est indispensable de coupler l’effet pharmacologique observé ou lecture fonctionnelle aux mesures de l’occupation de la cible ou l’engagement dans des cellules vivantes1,2,3. Ces données sont nécessaires pour s’assurer que la petite molécule a en effet atteint sa cible recherchée tant pour valider l’hypothèse biologique derrière la protéine cible sélection4,5. En outre, au cours du développement de médicaments, systèmes de modèles de complexité croissante servent à sélectionner et à corroborer un chef de file avant les essais cliniques. Pour confirmer la traduction de biologie dans l’ensemble de ces systèmes précliniques, les méthodes pour tracer les fiançailles de drogue-cible et accompagnant la biologie tout au long de ce processus de développement sont essentiels.
Engagement de drogue-cible est traditionnellement difficile à surveiller dans des cellules vivantes avec tétrahydrofuraniques de petites molécules et des protéines, notamment au niveau unicellulaire avec une résolution spatiale de6,7. Une méthode récente pour observer l’interaction entre tels quels médicaments et protéines dans des cellules vivantes est l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) dans lequel stabilisation induite par le ligand d’une protéine native en réponse à un défi de chaleur est quantifiée8, 9,10. Ceci est accompli en quantifiant les protéines solubles restantes après exposition à une épreuve de la chaleur. Dans la notification initiale de CETSA, tache occidentale a été utilisée pour la détection. Pour activer les campagnes de dépistage et a frappé le triage des plus grandes collections de composés, efforts pour augmenter le débit de CETSA expériences ont conduit à l’élaboration de plusieurs essais homogènes, axée sur la microplaque10,11. Toutefois, une limitation avec ces méthodes est qu’elles sont actuellement mieux adaptées à un traitement composé des suspensions cellulaires et la détection exige la lyse cellulaire, conduisant à la perte de l’information spatiale. CETSA peut être appliqué expérimentalement soit comme un changement induite par le ligand température agrégation thermique (Ttot.) à une concentration unique de la petite molécule ou la concentration de ligand nécessaire pour stabiliser la protéine à une seule température. Ce dernier est appelé empreintes de réponse dose isotherme (ITDRF) pour signifier la dépendance à l’égard de ces mesures sur les conditions expérimentales spécifiques.
Le but du présent protocole est de mesurer l’engagement de cibles à l’aide de CETSA dans les cellules adhérentes de détection des anticorps par immunofluorescence (IF) avec la microscopie haute teneur12. Cette procédure s’étend la plate-forme CETSA originale permettant la quantification unicellulaire de l’engagement de cibles avec conservation de la localisation subcellulaire. En particulier, contrairement à nombreux rapports précédents, dans cette procédure composé traitement est effectué dans des cellules vivantes adhérentes sans détachement de surface ou de lavage avant le défi de la chaleur, afin de préserver l’équilibre de liaison établis que nous voulons mesurer13. Actuellement, la méthode est validée pour une cible protéine p38α (MAPK14) en plusieurs lignées de cellules, et nous espérons qu’en partageant cette procédure la technique peut être appliquée largement à travers la fusion proteome. Nous prévoyons que ce protocole peut être adaptée dans l’ensemble du pipeline de développement de drogue de dépistage, hit triage grâce au suivi de cible engagement in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantifiant l’interaction des petites molécules avec la cible de leur protéine prévue est essentiel pour le développement de médicaments, de validation de cibles et de validation de la sonde chimique. Méthodes qui mesurent ce phénomène sans modification de la protéine ou les petites molécules sont particulièrement utiles, bien que techniquement difficile. L’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) est une technique pour contrôler l’engagement cible dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une adaptation du protocole CETSA original, qui permet pour les mesures de débit élevé tout en conservant la localisation sous-cellulaire au niveau de la cellule unique. Nous croyons que ce protocole offre des avancées importantes à l’application du CETSA caractérisation approfondie d’interaction composé-cible, notamment dans les populations hétérogènes de cellules.

Le protocole décrit dans la Figure 1 décrit le workflow de base pour l’exécution des essais CETSA sur des cellules adhérentes avec détection de protéines solubles restantes en imagerie contenu élevé. Ce flux de travail peut être facilement adapté à tous les stades de développement de l’analyse en modifiant le schéma des composés ou des réactifs14. Nous détaillons les résultats escomptés car plusieurs prévoit util...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes

Mesures de l’engagement de cibles de drogue sont au cœur de développement des médicaments efficaces et validation de la sonde chimique. Ici, nous détaillons un protocole permettant de mesurer l’engagement de drogue-cible à l’aide de l’imagerie contenu élevé dans une adaptation de microplaques compatibles de l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie chimique et la découverte de médicaments. Par exemple, votre composé se lie-t-il à la protéine cible? Les principaux avantages de cette technique sont qu’il n’y a pas besoin de détachement des cellules adhérentes.Et la localisation spatiale peut être déterminée par imagerie. Bien que nous ayons appliqué cette méthode dans les lignées cellulaires, il est également possible d’appliquer cette méthode à d’autres systèmes cellulaires tels que les cultures primaires et les cocultures. Avant d’ensemencer les cellules, placez des plaques noires d’analyse d’imagerie de 384 puits dans un capot de culture tissulaire et recouvrez les plaques de papier d’aluminium avant d’utiliser une perceuse standard pour faire trois trous de 3,5 millimètres de diamètre aux deux extrémités de chaque plaque.Lorsque les plaques sont prêtes, utilisez la technique aseptique pour laver une culture cellulaire A-431 avec 5 à 10 millilitres de PBS. Et incuber les cellules avec deux millilitres de trypsine à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent. Après comptage, diluer les cellules à 5 fois 10 à la 4ème cellule par millilitre dans le milieu de la culture, et les graines 40 microlitres de cellules à chaque puits de chaque plaque d’essai.Secouer doucement chaque plaque d’un côté à l’autre après l’ensemencement pour assurer une distribution homogène des cellules à travers le fond du puits. Pour minimiser les effets du bord de la plaque, laissez les cellules s’installer au fond des plaques d’essai pendant 20 minutes à température ambiante à l’arrière du capot d’écoulement laminaire avant de placer les plaques dans une chambre humidifiée personnalisée pendant deux à trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de l’expérience, utilisez une laveuse à plaques pour aspirer le milieu de chaque puits.Et ajouter 30 microlitres du composé d’intérêt à la concentration expérimentale appropriée aux puits expérimentaux appropriés. Sceller les plaques d’analyse traitées au composé avec des joints de plaque respirants. Et retourner les plaques à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.Pour exposer les cellules à un défi thermique, réglez d’abord le bain d’eau à la température expérimentale appropriée, et placez une plaque factice non scellée contenant le même volume de milieu par ainsi que la plaque d’analyse dans le bain, ainsi qu’un thermomètre thermocouple pour surveiller la température à l’intérieur des puits. Lorsque la température expérimentale appropriée a été atteinte, retirez le joint respirant de chaque plaque d’analyse et récellez les plaques avec une feuille d’aluminium adhésif étanche pour vous assurer qu’aucune eau ne s’écoule dans les puits pendant leur chauffage ultérieur dans le bain d’eau. Garder les trous percés dans le cadre de la plaque accessibles.Placez les plaques d’analyse et une nouvelle plaque factice dans le bain d’eau, avec le fond des plaques inclinées vers la surface de l’eau pour forcer tout air restant sous les plaques, et commencer à surveiller la température de la nouvelle plaque factice. Un chauffage même de la plaque est essentiel pour les performances d’analyse. Prenez soin de placer la plaque dans le bain d’eau de sorte qu’il n’y ait pas de bulles d’air emprisonnées en dessous.Après trois minutes, refroidir immédiatement les assiettes dans un deuxième bain d’eau à température ambiante pendant cinq minutes avant leur analyse. Pour imager les cellules, ajoutez d’abord 10 microlitres de 16% de paraformaldéhyde directement aux plaques d’essai pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. À la fin de la période de fixation, laver les cellules avec 300 microlitres de PBS sur la laveuse de plaque, et ajouter 20 microlitres de 0,1%NP40 pour une incubation de 10 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, laver les cellules comme démontré. Et bloquer les cellules avec 15 microlitres de 1% d’albumine sérique bovine, ou BSA, pendant une heure à température ambiante. Ensuite, utilisez la laveuse à plaques pour aspirer le sérum bloquant et ajoutez 10 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt aux puits appropriés pour une incubation d’une heure à température ambiante.À la fin de l’incubation, lavez chaque puits avec 300 microlitres de PBS, et étiquetez les cellules avec 10 microlitres de l’anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante protégée de la lumière. Pour la coloration nucléaire des cellules, ajouter 10 microlitres d’un colorant nucléaire approprié à chaque puits pendant 10 minutes à température ambiante. Et laver les cellules dans PBS comme démontré.Étiquetez les cellules avec 10 microlitres de masque cellulaire par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Suivi d’un dernier lavage avec PBS. Ensuite, distribuez 60 microlitres de PBS frais à chaque puits, et scellez les plaques avec du papier d’aluminium jusqu’à l’imagerie.Pour imager les cellules, capturez quatre images par puits sur un imageur à haute teneur en utilisant les canaux fluorescents appropriés dans le cadre de l’objectif 10 fois à l’aide d’autofocus laser automatisé et appliquez le binning pendant l’acquisition. Ensuite, stockez les images sous forme de fichiers point-tiff gris 16 bitscale ainsi que les métadonnées. La reconnaissance des anticorps ne doit pas être perturbée par des changements conformationnels dans la protéine cible qui peuvent être induits par la liaison ligand.Par exemple, birb796 a un taux de long terme, et la quantification de l’engagement cible n’est possible qu’en appliquant une étape de récupération des antigènes. Cette expérience représentative de courbe d’agrégation thermique pour les cellules traitées avec des composés de contrôle positifs et négatifs illustre les gammes typiques de stabilisation des protéines après le traitement des cellules avec les composés à différentes températures. Ici, une expérience typique d’empreinte digitale isothermale dose-réponse est montré pour démontrer des gammes représentatives de stabilisation des protéines en réponse à différentes doses de composé expérimental.L’application de défis de chaleur isothermale pour le criblage composé pour identifier de nouveaux liants de la protéine cible permet l’analyse d’un grand nombre de composés à une seule concentration à la fois, avant l’empreinte isothermale dose-réponse des coups pour confirmer la stabilisation de protéine cible. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions expérimentales exactes, telles que la longueur et la température du défi thermique ont un impact sur la puissance observée des composés. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux.Et des précautions, telles que le suivi des directives de sécurité institutionnelles, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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