Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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Die Autoren erkennen Infrastrukturunterstützung aus der Wissenschaft Leben Labor-und Karolinska Institutet. Die Autoren erkennen auch ein- und Gespräche mit Michaela Vallin, Magdalena Otrocka und Thomas Lundbäck.

(1) Aussaat von Zellen
Hinweis: Für einen allgemeinen Überblick über den Workflow siehe Abbildung 1. Eine detaillierte Liste der Materialien und Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung.
<ol><li>Vor der Aussaat der Zellen, die Bohrungen Sie mit einem standard Bohrer im Rahmen des schwarzen 384-Well Assay Bildplatten, wird unter der Platte später während der Heizung Schritt eingeschlossenen Luftbläschen ...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Wie im Abschnitt "Ergebnisse", gibt es mehrere wichtige Schritte des Verfahrens. Erstens ist es wichtig, eine qualitativ hochwertige Affinität Reagenz zu identifizieren. Es wird empfohlen, eine kleine Bibliothek von Antikörpern für jedes gewünschte Ziel screening. Nachdem Sie ein primärer Antikörper ausgewählt hat, ist es auch wichtig zur Validierung des Systems für eine Reihe von verschiedenen Bindungsstellen des Protein-Ziel gegebenenfalls. Counter-Screening für Verbindungen, die mit dem Assay-Signal stören, ...

Bei der Entwicklung neuer Medikamente oder chemische Sonden es unerlässlich ist, die beobachteten pharmakologischen Wirkung oder funktionelle auslesen, Messungen der Ziel-Belegung oder Engagement in lebenden Zellen1,2,3paar. Diese Daten sind notwendig, um sicherzustellen, dass das kleine Molekül in der Tat das gewünschte Ziel erreicht und die biologischen Hypothese hinter Protein Ziel Auswahl4,5zu überprüfen. Darüber hinaus werden während der Medikamentenentwicklung, Modellsysteme der zunehmenden Komplexität zur auswählen und einen Vorsprung vor klinischen Studien Verbindung bestätigen. Um die Übersetzung der Biologie dieser präklinischen systemübergreifend zu bestätigen, sind Methoden für Droge-Ziel Engagement verfolgen und begleitende Biologie während dieses Entwicklungsprozesses entscheidend.
Droge-Ziel Engagement ist traditionell schwierig, in lebenden Zellen mit unfunctionalized kleine Moleküle und Proteine, insbesondere auf der Ebene der Einzeller mit räumlicher Auflösung6,7zu überwachen. Eine neue Methode zu beobachten, die Interaktion zwischen unveränderten Drogen und Proteine in lebenden Zellen ist die zelluläre thermische Verschiebung Assay (CETSA) in dem Liganden-induzierte Stabilisierung eines nativen Proteins als Reaktion auf eine Hitze-Herausforderung quantifizierte8ist, 9,10. Dies geschieht durch Quantifizierung der verbleibenden lösliche Protein nach Exposition gegenüber einem Hitze-Herausforderung. In der ersten Offenlegung von CETSA wurde western-Blot zum Nachweis verwendet. Screening-Kampagnen aktivieren und Selektierung von größeren zusammengesetzten Sammlungen getroffen, haben Anstrengungen zur Erhöhung des Durchsatzes CETSA Experimente führten zur Entwicklung von mehreren homogenen, Mikrotestplatte basierende Assays10,11. Eine Einschränkung mit diesen Methoden ist jedoch, dass derzeit zusammengesetzten Behandlung in Zellsuspensionen optimal und die Erkennung Zelle Lysis erfordert, führt zum Verlust der räumlichen Informationen. CETSA kann sein angewandt experimentell entweder als Liganden-induzierte Verschiebung in der thermischen Aggregation Temperatur (TAgg) an einem einzigen Zusammenschluss kleiner Moleküle oder die Liganden-Konzentration notwendig, das Protein in einer einzelnen Temperatur zu stabilisieren. Letzteres wird als isothermen Dosis Antwort Fingerabdrücke (ITDRF), um die Abhängigkeit von diesen Messungen an bestimmten experimentellen Bedingungen bedeuten bezeichnet.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, Ziel Engagement mit CETSA in adhärenten Zellen durch immunofluorescent (IF)-Antikörpernachweis mit High-Content Mikroskopie12messen. Dieses Verfahren reicht die ursprüngliche CETSA-Plattform, um einzellige Quantifizierung der Ziel-Engagement mit der Erhaltung der subzellulären Lokalisierung zu ermöglichen. Bemerkenswert ist, im Gegensatz zu vielen früheren Berichten in diesem Verfahren zusammengesetzte Behandlung erfolgt in lebenden adhärente Zellen ohne Oberflächen Ablösung oder waschen vor der Hitze-Challenge, so bewahrt das Gleichgewicht der etablierten Bindung wollen wir13messen. Derzeit ist die Methode für ein Ziel Protein p38α validiert (MAPK14) in mehrere Zellinien, und wir hoffen, dass durch den Austausch dieses Verfahren die Technik im großen und ganzen über das schmelzende Proteom angewendet werden kann. Wir erwarten, dass dieses Protokoll kann angepasst werden, während die Droge-Entwicklungs-Pipeline vom Screening, hit Selektierung durch Überwachung der Ziel Engagement in Vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantifizierung der Interaktion von kleinen Molekülen mit ihrer beabsichtigten Protein-Ziel ist entscheidend für die Arzneimittelentwicklung, Target-Validierung und chemische Sonde Validierung. Besonders wertvoll sind die Methoden, die dieses Phänomen ohne Änderung der Protein-Ziel oder kleines Molekül zu messen, aber technisch anspruchsvolle. Die zelluläre thermische Verschiebung Assay (CETSA) ist eine Technik, Ziel Engagement in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Anpassung der ursprünglichen CETSA-Protokoll, das für hohen Durchsatz-Messungen unter Beibehaltung der subzellulären Lokalisierung auf der Ebene der einzelnen Zelle kann. Wir glauben, dass dieses Protokoll bietet wichtige Fortschritte für die Anwendung der CETSA für detaillierte Charakterisierung der Verbindung zu den Zielgruppen Interaktion, vor allem in heterogenen Bevölkerung der Zellen.

Das Protokoll gemäß Abbildung 1 beschreibt die grundlegenden Workflow für die Ausführung CETSA Assays auf adhärente Zellen mit Erkennung der verbleibenden lösliche Protein von hoher Content Imaging. Dieser Workflow kann durch Bearbeiten des Layouts der Platte der Verbindungen oder Reagenzien14leicht an allen Phasen der Assay-Entwicklung angepasst. Wir ausführlich die erwarteten Ergebnisse für mehrere erwartet folgenden Fällen ...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Messungen der Droge Ziel Engagement sind von zentraler Bedeutung für effektive Medikamentenentwicklung und chemische Sonde Validierung. Hier zeigen wir ein Protokoll zur Messung der Droge-Ziel Engagement mit hohen Inhalt Bildgebung in einer Mikrotestplatte-kompatiblen Adaption des zellulären thermische Verschiebung Assays (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der chemischen Biologie und Arzneimittelforschung zu beantworten. Wie, bindet Ihre Verbindung an das Zielprotein? Die Hauptvorteile für diese Technik sind, dass es keine Anforderung der Ablösung der anhaftenden Zellen gibt.Und die räumliche Lokalisierung kann durch Bildgebung bestimmt werden. Obwohl wir diese Methode in Zelllinien angewendet haben, ist es auch möglich, diese Methode auf andere Zellsysteme wie Primärkulturen und Kokulturen anzuwenden. Bevor Sie die Zellen säen, legen Sie schwarze 384-Well-Bild-Assay-Platten in eine Gewebekulturhaube und bedecken die Platten mit Aluminiumfolie, bevor Sie mit einem Standardbohrer drei Löcher mit 3,5 MillimeterDurchmesser an beiden Enden jeder Platte herstellen.Wenn die Platten fertig sind, verwenden Sie aseptische Technik, um eine A-431-Zellkultur mit 5 bis 10 Milliliter PBS zu waschen. Und die Zellen mit zwei Milliliter Ntrypsin bei 37 Grad Celsius bebrüten, bis sich die Zellen lösen. Nach dem Zählen, verdünnen Sie die Zellen auf 5 mal 10 bis die 4. Zellen pro Milliliter in Kulturmedium, und säen 40 Mikroliter Zellen zu jedem Brunnen jeder Assayplatte.Sanft schütteln jede Platte von Seite zu Seite nach der Aussaat, um eine homogene Verteilung der Zellen über die Brunnenböden zu gewährleisten. Um Plattenkanteneffekte zu minimieren, lassen Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im hinteren Teil der laminaren Strömungshaube an der Unterseite der Assayplatten absetzen, bevor sie die Platten zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in eine benutzerdefinierte Befeuchtungskammer legen. Verwenden Sie am Tag des Experiments eine Plattenscheibe, um das Medium aus jedem Brunnen zu aspirieren.Und fügen Sie 30 Mikroliter der Verbindung von Interesse in der entsprechenden experimentellen Konzentration zu den entsprechenden experimentellen Brunnen. Versiegeln Sie die compoundbehandelten Assayplatten mit atmungsaktiven Plattendichtungen. Und geben Sie die Platten für 30 Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück.Um die Zellen einer Hitzeherausforderung auszusetzen, stellen Sie zunächst das Wasserbad auf die entsprechende Versuchstemperatur und legen Sie eine unversiegelte Dummyplatte mit dem gleichen Mediumvolumen sowie die Assayplatte in das Bad, zusammen mit einem Thermoelementthermometer zur Überwachung der Temperatur in den Brunnen. Wenn die entsprechende Versuchstemperatur erreicht ist, entfernen Sie die atmungsaktive Dichtung von jeder Assayplatte und verschließen Sie die Platten mit einer dichten Klebe-Aluminiumfolie, um sicherzustellen, dass bei der anschließenden Erwärmung im Wasserbad kein Wasser in die Brunnen austritt. Halten Sie die gebohrten Löcher innerhalb des Plattenrahmens zugänglich.Legen Sie die Assay-Platten und eine neue Dummy-Platte in das Wasserbad, wobei die Böden der Platten zur Wasseroberfläche gewinkelt sind, um die verbleibende Luft unter den Platten zu erzwingen, und beginnen Sie, die Temperatur der neuen Dummyplatte zu überwachen. Eine gleichmäßige Erwärmung der Platte ist entscheidend für die Assay-Leistung. Achten Sie darauf, die Platte in das Wasserbad zu legen, so dass keine Luftblasen darunter eingeschlossen sind.Nach drei Minuten die Platten sofort in einem zweiten Wasserbad mit Raumtemperaturwasser für fünf Minuten vor ihrer Analyse abkühlen. Um die Zellen abzubilden, fügen Sie zunächst 10 Mikroliter 16% Paraformaldehyd direkt zu den Assayplatten für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der Fixierungsphase die Zellen mit 300 MikroliterPBS auf der Plattenscheibe waschen und 20 Mikroliter 0,1%NP40 für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.Waschen Sie am Ende der Inkubation die Zellen, wie gezeigt. Und blockieren Sie die Zellen mit 15 Mikrolitern 1%Rinderserumalbumin, oder BSA, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes verwenden Sie die Plattenscheibe, um das blockierende Serum zu aspirieren, und fügen Sie 10 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse zu den entsprechenden Brunnen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu.Am Ende der Inkubation jeden Brunnen mit 300 Mikroliter PBS waschen und die Zellen mit 10 Mikrolitern des entsprechenden Sekundärantikörpers für eine Stunde bei Lichtschutz beschriften. Für die kerntechnische Färbung der Zellen 10 Mikroliter eines geeigneten Kernfarbstoffs für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu jedem Brunnen hinzufügen. Und waschen Sie die Zellen in PBS, wie gezeigt.Beschriften Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern Zellmaske pro Brunnen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von einer letzten Wäsche mit PBS. Dann geben Sie 60 Mikroliter frische PBS an jeden Brunnen und versiegeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie bis zur Bildgebung.Um die Zellen abzubilden, erfassen Sie vier Bilder pro Brunnen auf einem hochauflösenden Imager mit den entsprechenden Fluoreszenzkanälen unter dem 10-fachen Ziel mithilfe des automatisierten Laser-Autofokus und wenden Sie während der Erfassung Binning an. Speichern Sie dann die Bilder zusammen mit den Metadaten als 16-Bit-Graustufen-Dot-Tiff-Dateien. Die Antikörpererkennung sollte nicht durch konforme Veränderungen des Zielproteins gestört werden, die durch Ligandenbindung induziert werden können.Beispielsweise hat BIRB796 eine Long-Off-Rate, und die Quantifizierung des Zielengagements ist nur durch Anwenden eines Antigen-Abrufschritts möglich. Dieses repräsentative thermische Aggregationskurvenexperiment für Zellen, die mit positiven und negativen Kontrollverbindungen behandelt werden, veranschaulicht typische Proteinstabilisierungsbereiche nach der Behandlung der Zellen mit den Verbindungen bei verschiedenen Temperaturen. Hier zeigt ein typisches isothermes Dosis-Wirkungs-Fingerabdruckexperiment repräsentative Bereiche der Proteinstabilisierung als Reaktion auf verschiedene Dosen experimenteller Wirkstoffe.Die Anwendung von isothermen Wärmeherausforderungen für das zusammengesetzte Screening zur Identifizierung neuartiger Bindemittel des Zielproteins ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen in einer einzigen Konzentration gleichzeitig, bevor isotherme Dosis-Antwort-Fingerabdrücke der Treffer zur Bestätigung der Zielproteinstabilisierung durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die genauen experimentellen Bedingungen, wie die Länge und Temperatur der Hitzeherausforderung, die beobachtete Potenz der Verbindungen beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd extrem gefährlich sein kann.Und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. die Befolgung institutioneller Sicherheitsrichtlinien.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Biochemie

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