Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

המחברים להכיר תשתית תמיכה מן המדע החיים מעבדה קרולינסקה Institutet. המחברים להכיר גם קלט ודיונים עם מיכאלה Vallin, מגדלנה Otrocka, תומאס Lundbäck.

1. זריעה של תאים
הערה: לקבלת סקירה כללית של זרימת העבודה ראה איור 1. רשימה מפורטת של נוגדנים וחומרים זמינים את הטבלה של חומרים.
<ol><li>לפני זריעה של התאים, לקדוח חורים עם מקדח רגיל במסגרת שחורה 384-ובכן הדמיה assay צלחות כדי להימנע מלהיות לכוד מתחת ...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

כפי שפורט בסעיף התוצאות, ישנם מספר שלבים מרכזיים להליך. ראשית, חשוב לזהות ריאגנט זיקה באיכות גבוהה. אנו ממליצים על הקרנת ספרייה קטנה של נוגדנים עבור כל מטרה רצויה. לאחר שנבחר נוגדן ראשוני, חשוב גם לאמת את המערכת עבור מספר אתרי קישור שונים של חלבון היעד במידת הצורך. הקרנה הנגד של תרכובות מפרי...

בעת פיתוח תרופות חדשות או כימי הגששים חיוני כמה את התצפיות מהדם או פונקציונלי readout למדידות של תפוסת היעד או אירוסין תאים חיים1,2,3. נתונים אלה נחוצים כדי לוודא מולקולה קטנה יגיע למעשה המטרה הרצויה שלו והן כדי לאמת את ההשערה ביולוגי מאחורי חלבון המטרה בחירת4,5. יתר על כן, במהלך פיתוח תרופות, דגם מערכות המורכבות הגוברת משמשים כדי לבחור לאמת חוט המורכב לפני ניסויים קליניים. כדי לאשר תרגום של הביולוגיה על פני המערכות פרה, שיטות איתור סמים-יעד האירוסין וליווי ביולוגיה לאורך כל תהליך הפיתוח זה הם קריטיים.
סמים-יעד האירוסין באופן מסורתי מאתגר כדי לפקח על תאים חיים עם מולקולות קטנות unfunctionalized, חלבונים, במיוחד ברמה תא יחיד עם רזולוציה מרחבית6,7. אחת השיטות האחרונות כדי לבחון האינטראקציה בין יבוצעו בהם שינויים-תרופות, חלבונים בתאים חיים וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) שבו הנוצרות על-ידי ליגנד ייצוב של חלבון יליד בתגובה אתגר חום הוא כימות8, 9,10. זו מושגת על ידי לכימות חלבון מסיס שנותרו לאחר חשיפה אתגר חום. חשיפה ראשונית של CETSA, תספיג שימשה למטרות איתור. כדי לאפשר הקרנה קמפיינים ופגע triaging של אוספים מתחם גדול יותר, המאמצים כדי להגדיל את התפוקה של ניסויים CETSA יש להוביל להתפתחות של מבחני הומוגנית, המבוססים על microplate מספר10,11. עם זאת, מגבלה אחת באמצעות שיטות אלה היא כי הם הם המתאימים ביותר כיום לטיפול המורכב ב השעיות תא האיתור דורש פירוק התא, מוביל לאובדן מידע מרחבי. CETSA יכול להיות מיושם ניסיוניים כמו משמרת הנוצרות על-ידי ליגנד בטמפרטורה צבירת תרמי (Tagg) גם ריכוז אחד של המולקולה קטנה או ריכוז ליגנד לייצב את החלבון בטמפרטורה יחיד. האחרון נקרא במינון איזותרמי התגובה טביעות אצבעות (ITDRF) שמסמלת את התלות של מדידות אלה על תנאי ניסויי ספציפי.
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההתחייבות היעד באמצעות CETSA ב תאים חסיד על ידי זיהוי נוגדנים (אם) immunofluorescent עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן12. הליך זה מרחיב את הפלטפורמה CETSA המקורי כדי לאפשר את החד-תאיים כימות של היעד האירוסין עם שימור לוקליזציה subcellular. ראוי לציין, בניגוד לדיווחים קודמים רבים, בהליך זה מתחם הטיפול מתבצע בתאים חסיד חי ללא ניתוק משטח או כביסה לפני האתגר חום, וכך לשמר את האיזון מחייב הוקמה שאנו שואפים למדוד13. כיום, השיטה מאומתת עבור מטרה אחת חלבון p38α (MAPK14), תא מספר שורות, אנו מקווים כי על-ידי שיתוף הליך זה הטכניקה שניתן להחילה בהרחבה פרוטאום נמס. אנו צופים כי פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל אורך הצינור פיתוח התרופה של ההקרנה, פגע triaging דרך כדי ניטור של היעד האירוסין ויוו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם המטרה חלבון המיועד שלהם הוא קריטי עבור פיתוח תרופות, היעד אימות ובדיקת בדיקה כימית. שיטות למדוד תופעה זו ללא שינוי של חלבון המטרה או מולקולה קטנה הם יקר במיוחד אבל טכנית מאתגר. וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) היא טכניקה אחת לעקוב אחר היעד האירוסין בתאים חיים. כאן, אנו מתארים עיבוד של פרוטוקול CETSA המקורי, אשר מאפשר למדידות תפוקה גבוהה תוך שמירה על לוקליזציה subcellular ברמה תא בודד. אנו מאמינים שפרוטוקול זה מציע מקדמות חשוב ליישום של CETSA עבור אפיון מעמיק של המתחם-יעד אינטראקציה, במיוחד באוכלוסיות הטרוגניות של תאים.

פרוטוקול המתוארים באיור 1 מתאר את זרימת העבודה הבסיסי עבור הפעלת מבחני CETSA על תאים חסיד עם זיהוי של חלבון מסיס שנותרו על ידי הדמיה תוכן גבוהה. זרימת עבודה זו ניתן להתאים בקלות בכל שלבי ההתפתחות assay על-ידי שינוי הפריסה צלחת של תרכובות או ריאגנטים14</...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה כימית וגילוי סמים. כגון, האם המתחם שלך נקשר לחלבון היעד? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שאין דרישה של ניתוק של התאים חסידים.ולוקליזציה מרחבית יכולה להיקבע על ידי הדמיה. למרות שהחלנו שיטה זו בשורות תאים, ניתן גם ליישם שיטה זו על מערכות תאים אחרות כגון תרבויות ראשיות ותרבויות אחרות. לפני זריעת התאים, מניחים לוחות דגימת הדמיה שחורים של 384 היטב במכסה המנוע של תרבות הרקמה, ומכסים את הלוחות בנייר אלומיניום לפני השימוש במקדחה סטנדרטית כדי ליצור שלושה חורים בקוטר 3.5 מ"מ בשני קצות כל צלחת.כאשר הצלחות מוכנות, השתמש בטכניקה אספטית כדי לשטוף את תרבות התא A-431 עם 5 עד 10 מיליליטר של PBS. ו דגירה התאים עם שני מיליליטר של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק. לאחר הספירה, לדלל את התאים ל 5 פעמים 10 לתאים 4 למיליליטר בינוני תרבות, וזרע 40 microliters של תאים לכל באר של כל צלחת בדיקה.בעדינות לנער כל צלחת מצד לצד לאחר הזריעה כדי להבטיח הפצה הומוגנית של התאים על פני התחתון היטב. כדי למזער את השפעות קצה הלוח, אפשר לתאים להתיישב בתחתית לוחות ההתזה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחלק האחורי של מכסה המנוע של הזרימה למינארית לפני הצבת הצלחות בתא לח מותאם אישית במשך יומיים עד שלושה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום הניסוי, השתמש בכביסה כדי לשוות את המדיום מכל באר.ותוסיפו 30 מיקרוליטרים של תרכובת הריבית בריכוז הניסוי המתאים לבירות הניסוי המתאימות. לאטום את לוחות ההתאספה המטופלים בתרכובת עם אטמי צלחת נושמים. ולהחזיר את הצלחות לאנקובטור תרבות התא במשך 30 דקות.כדי לחשוף את התאים לאתגר חום, הגדר תחילה את אמבט המים לטמפרטורה הניסיונית המתאימה, והצב צלחת דמה לא חתוך המכילה את אותו נפח של מדיום לכל צלחת מים לאמבטיה, יחד עם מדחום תרמוקופול לניטור הטמפרטורה בתוך הבאר. כאשר הטמפרטורה הניסיונית המתאימה הושגה, להסיר את החותם נושם מכל צלחת מיסטי לחתום מחדש את הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק הדוק כדי להבטיח כי אין דליפות מים לתוך הבאר במהלך החימום הבא שלהם באמבט המים. שמירה על החורים שנקדחו בתוך מסגרת הלוחית נגישה.מניחים את צלחות ההצבה וצלחת דמה חדשה לאמבט המים, כאשר תחתיות הצלחות זוויתיות לכיוון פני המים כדי לכפות את כל האוויר שנותר מתחת לצלחות, ולהתחיל לעקוב אחר הטמפרטורה של צלחת הבובה החדשה. חימום שווה של הצלחת הוא קריטי לביצועי ההסקה. יש לדאוג למקם את הצלחת באמבט המים כך שאין בועות אוויר לכודים מתחת.לאחר שלוש דקות, מיד לקרר את הצלחות באמבט מים שני של מים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני הניתוח שלהם. כדי לדמיין את התאים, הוסיפו תחילה 10 מיקרוליטרים של 16% paraformaldehyde ישירות לצלחות ההסקה לצורך דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף תקופת התקבעון, לשטוף את התאים עם 300 microliters של PBS על מכונת הכביסה צלחת, ולהוסיף 20 microliters של 0.1% NP40 עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים כפי שהוכח. ולחסום את התאים עם 15 microliters של אלבומין סרום 1%, או BSA, במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו בכביסה כדי לשאוף את סרום החסימה, והוסיפו 10 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי המעניין את הבארות המתאימות עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם 300 microliters של PBS, ולתייג את התאים עם 10 microliters של הנוגדן המשני המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. עבור כתמים גרעיניים של התאים, להוסיף 10 microliters של צבע גרעיני מתאים לכל באר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ולשטוף את התאים PBS כפי שהודגם.סמן את התאים עם 10 microliters של מסכת תא ל הבאר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שטיפה אחרונה עם PBS. לאחר מכן מחלקים 60 מיקרוליטרים של PBS טרי לכל באר, ואוטמים את הצלחות בנייר אלומיניום עד להדמיה.כדי לדמיין את התאים, לכוד ארבע תמונות לאורך באר בתמונה עם תוכן גבוה באמצעות ערוצי הפלואורסצנט המתאימים תחת המטרה 10 פעמים באמצעות פוקוס אוטומטי אוטומטי בלייזר והחל binning על במהלך הרכישה. לאחר מכן אחסן את התמונות כקובצי dot-tiff בגווני אפור של 16 סיביות יחד עם המטה-נתונים. אין לשבש את זיהוי הנוגדנים על ידי שינויים קונפורמיים בחלבון היעד שעשויים להיגרם על ידי קשירה ליגנד.לדוגמה, ל- BIRB796 יש שיעור חופש ארוך, וכמות מעורבות היעד אפשרית רק על-ידי החלת שלב אחזור אנטי-גני. ניסוי עקומת צבירה תרמית ייצוגית זו עבור תאים שטופלו בתרכובות בקרה חיוביות ושליליות ממחיש טווחי ייצוב חלבון טיפוסיים לאחר טיפול בתאים עם התרכובות בטמפרטורות שונות. כאן ניסוי טיפוסי של טביעת אצבע תגובת מינון isothermal מוצג להפגין טווחים מייצגים של ייצוב חלבון בתגובה מינונים שונים של תרכובת ניסיונית.היישום של אתגרי חום isothermal עבור הקרנה מורכבת לזהות קלסרים הרומן של חלבון היעד מאפשר ניתוח של מספר רב של תרכובות בריכוז אחד בבת אחת, לפני טביעת אצבע מינון-תגובה isothermal של הלהיטים כדי לאשר ייצוב חלבון היעד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי התנאים הניסיוניים המדויקים, כגון אורך וטמפרטורה של אתגר החום להשפיע על העוצמה שנצפו של התרכובות. אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehyde יכול להיות מסוכן מאוד.ואמצעי זהירות, כגון שמירה על הנחיות הבטיחות המוסדיות, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

מדידות העברת אנרגיה תהודה Förster בתאי צמח חיים

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...