Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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लेखक जीवन प्रयोगशाला और कारोलिंस्का Institutet के लिए विज्ञान से बुनियादी सुविधाओं का समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखक भी Michaela Vallin, Magdalena Otrocka और थॉमस Lundbäck के साथ इनपुट और विचार विमर्श स्वीकार करते हैं ।

1. कोशिकाओं की सीडिंग
नोट: वर्कफ़्लो के सामांय ओवरव्यू के लिए, चित्र 1देखें । सामग्री और रिएजेंट की एक विस्तृत सूची सामग्री की तालिकामें उपलब्ध हैं ।
<ol><li>कोशिकाओं के बो...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

के रूप में परिणाम अनुभाग में चर्चा की, वहां कई मुख्य प्रक्रिया के लिए कदम उठाए हैं । सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है एक उच्च गुणवत्ता संबध एजेंट की पहचान । हम प्रत्येक इच्छित लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी के एक छोट?...

जब नई दवाओं या रासायनिक जांच के विकास के लिए यह जोड़ा आवश्यक है औषधीय प्रभाव या कार्यात्मक readout लक्ष्य अधिभोग या सगाई की माप के लिए जीना कोशिकाओं1,2,3में । इन आंकड़ों दोनों को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि वास्तव में छोटे अणु अपने वांछित लक्ष्य तक पहुंचता है और प्रोटीन लक्ष्य चयन4,5के पीछे जैविक परिकल्पना को मांय । इसके अलावा, दवा के विकास के दौरान, बढ़ती जटिलता के मॉडल प्रणालियों का चयन करें और नैदानिक परीक्षणों से पहले एक नेतृत्व यौगिक पुष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन नैदानिक प्रणाली में जीव विज्ञान के अनुवाद की पुष्टि करने के लिए, दवा का पता लगाने के लिए तरीके लक्ष्य सगाई और साथ जीव विज्ञान इस विकास प्रक्रिया में महत्वपूर्ण हैं ।
दवा-लक्ष्य सगाई पारंपरिक रूप से एक स्थानिक संकल्प6,7के साथ एकल सेल स्तर पर, unfunctional छोटे अणुओं और प्रोटीन के साथ लाइव कोशिकाओं में निगरानी करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है । हाल ही में एक विधि unmodifiedd दवाओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (एक गर्मी चुनौती के जवाब में एक देशी प्रोटीन के ligand प्रेरित स्थिरीकरण) है quantified8, 9,10. यह एक गर्मी चुनौती के लिए जोखिम के बाद शेष घुलनशील प्रोटीन को बढ़ाता है द्वारा पूरा किया है । CETSA के आरंभिक खुलासे में पश्चिमी ब्लाटर का इस्तेमाल पता लगाने के लिए किया गया था । स्क्रीनिंग अभियानों को सक्षम करने के लिए और बड़ा यौगिक संग्रह के हिट triaging, CETSA प्रयोगों का प्रवाह बढ़ाने के प्रयासों में कई समरूप के विकास के लिए नेतृत्व किया है, microplate-परख10,11आधारित. हालांकि, इन पद्धतियों के साथ एक सीमा है कि वे वर्तमान में सबसे अच्छा है सेल सस्पेंशन में यौगिक उपचार के लिए अनुकूल है और पता लगाने के सेल lysis, स्थानिक जानकारी के नुकसान के लिए अग्रणी की आवश्यकता है । CETSA एक ही तापमान पर प्रोटीन को स्थिर करने के लिए आवश्यक छोटे अणु या ligand एकाग्रता के एक एकल एकाग्रता पर थर्मल एकत्रीकरण तापमान (टीagg) में एक ligand प्रेरित बदलाव के रूप में या तो प्रयोगात्मक लागू किया जा सकता है । बाद इज़ोटेर्माल खुराक प्रतिक्रिया फिंगरप्रिंट (ITDRF) के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों पर इन माप की निर्भरता दर्शाता है ।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य immunofluorescent द्वारा अनुयाई कोशिकाओं में CETSA का उपयोग कर लक्ष्य सगाई को मापने के लिए है (यदि) उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी12के साथ एंटीबॉडी का पता लगाने । यह कार्यविधि उपसेलुलर स्थानीयकरण के संरक्षण के साथ लक्ष्य सगाई के एकल-कक्ष ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए मूल CETSA प्लेटफ़ॉर्म बढ़ाता है । विशेष रूप से, कई पिछले रिपोर्टों के विपरीत, इस प्रक्रिया में यौगिक उपचार सतह टुकड़ी या धोने के बिना लाइव अनुयाई कोशिकाओं में किया जाता है गर्मी चुनौती से पहले, इस प्रकार की स्थापना की बाध्यकारी संतुलन हम13को मापने के उद्देश्य के संरक्षण । वर्तमान में, विधि एक लक्ष्य प्रोटीन p38α के लिए मान्य है (MAPK14) कई सेल लाइनों में, और हमें उम्मीद है कि इस प्रक्रिया को साझा करने के द्वारा तकनीक मोटे तौर पर पिघलने proteome भर में लागू किया जा सकता है. हमें आशंका है कि इस प्रोटोकॉल स्क्रीनिंग से दवा विकास पाइपलाइन में अनुकूलित किया जा सकता है, vivo मेंलक्ष्य सगाई की निगरानी के माध्यम से triaging मारा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating अपने इच्छित प्रोटीन लक्ष्य के साथ छोटे अणुओं की बातचीत दवा विकास, लक्ष्य सत्यापन और रासायनिक जांच सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण है । तरीकों कि प्रोटीन लक्ष्य या छोटे अणु के संशोधन के बिना इस घटना को मापने विशेष रूप से हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मूल्यवान हैं । सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) एक तकनीक को जीवित कोशिकाओं में लक्ष्य सगाई की निगरानी है । यहां, हम मूल CETSA प्रोटोकॉल है, जो उच्च प्रवाह माप के लिए अनुमति देता है, जबकि एक सेल स्तर पर उपसेलुलर स्थानीयकरण को बनाए रखने के एक अनुकूलन का वर्णन । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल के लिए CETSA के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण अग्रिम प्रदान करता है यौगिक-लक्ष्य बातचीत की गहराई लक्षण वर्णन, विशेष रूप से कोशिकाओं की विषम आबादी में ।

चित्र 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल उच्च सामग्री इमेजिंग द्वारा शेष घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने के साथ अनुयाई कोशिकाओं पर CETSA परख चलाने के लिए बुनियादी कार्यप्रवाह का वर्णन । इस कार...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

अनुयाई कक्षों में लक्ष्य सहभागिता के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करना

दवा लक्ष्य सगाई की माप प्रभावी दवा विकास और रासायनिक जांच सत्यापन के लिए केंद्रीय हैं । यहां, हम विस्तार से दवा को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल-लक्ष्य सगाई सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) के एक microplate-संगत अनुकूलन में उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग कर ।

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

इस विधि रासायनिक जीव विज्ञान और दवा की खोज में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब में मदद कर सकते हैं । जैसे, अपने यौगिक लक्ष्य प्रोटीन के लिए बांध करता है? इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि अनुयायी कोशिकाओं की टुकड़ी की कोई आवश्यकता नहीं है।और स्थानिक स्थानीयकरण इमेजिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि हमने इस विधि को सेल लाइनों में लागू किया है, लेकिन इस विधि को प्राथमिक संस्कृतियों और सहसंस्कृतियों जैसे अन्य सेल प्रणालियों पर लागू करना भी संभव है। कोशिकाओं सीडिंग से पहले, एक ऊतक संस्कृति हुड में काले ३८४-अच्छी तरह से इमेजिंग परख प्लेटें रखें, और प्रत्येक प्लेट के दोनों सिरों पर तीन ३.५ मिलीमीटर व्यास छेद बनाने के लिए एक मानक ड्रिल का उपयोग करने से पहले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को कवर ।जब प्लेटें तैयार हो जाएं, तो पीबीएस के 5 से 10 मिलीलीटर के साथ ए-431 सेल कल्चर को धोने के लिए ए-431 सेल कल्चर का इस्तेमाल करें। और कोशिकाओं को अलग करने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइप्सिन के दो मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। गिनती के बाद, कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम में मिलीलीटर प्रति चौथी कोशिकाओं को 5 गुना 10 तक पतला करें, और प्रत्येक परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के बीज 40 माइक्रोलीटर करें।बोने के बाद प्रत्येक प्लेट को धीरे-धीरे मिलाते हुए अच्छी तरह से नीचे से कोशिकाओं का समरूप वितरण सुनिश्चित करें। प्लेट एज प्रभावों को कम करने के लिए, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो से तीन दिनों के लिए एक अनुकूलित आर्द्र कक्ष में प्लेटों को रखने से पहले लैमिनार प्रवाह हुड के पीछे कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए परख प्लेटों के नीचे व्यवस्थित करने की अनुमति दें। प्रयोग के दिन, प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करने के लिए एक प्लेट वॉशर का उपयोग करें।और उचित प्रयोगात्मक कुओं के लिए उचित प्रयोगात्मक एकाग्रता पर ब्याज के यौगिक के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें । सांस प्लेट जवानों के साथ यौगिक-इलाज परख प्लेटों को सील करें। और प्लेटों को 30 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।कोशिकाओं को गर्मी की चुनौती के लिए बेनकाब करने के लिए, पहले उचित प्रायोगिक तापमान के लिए पानी स्नान सेट करें, और एक असील डमी प्लेट रखें जिसमें मध्यम प्रति के समान मात्रा के साथ-साथ परख प्लेट को स्नान में रखा जाता है, साथ ही कुओं के भीतर तापमान की निगरानी के लिए थर्मोकपल थर्मामीटर के साथ। जब उचित प्रायोगिक तापमान तक पहुंच गया है, प्रत्येक परख प्लेट से सांस सील हटा दें और एक तंग चिपकने वाला एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को फिर से सील करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई पानी पानी स्नान में उनके बाद हीटिंग के दौरान कुओं में लीक । प्लेट फ्रेम के भीतर ड्रिल किए गए छेद को सुलभ रखना।परख प्लेटें और पानी के स्नान में एक नई डमी प्लेट प्लेस, प्लेटों के नीचे से किसी भी शेष हवा को मजबूर करने के लिए पानी की सतह की ओर angled प्लेटों के नीचे से, और नई डमी प्लेट के तापमान की निगरानी शुरू करते हैं । परख प्रदर्शन के लिए प्लेट का एक भी हीटिंग महत्वपूर्ण है। ध्यान रखें कि थाली को पानी के स्नान में रखें ताकि नीचे कोई हवा के बुलबुले न फंसे।तीन मिनट के बाद, तुरंत अपने विश्लेषण से पहले पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पानी के एक दूसरे पानी स्नान में प्लेटों को ठंडा । कोशिकाओं की छवि के लिए, पहले कमरे के तापमान पर 20 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए सीधे परख प्लेटों के लिए 16% पैराफॉर्मलडिहाइड के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें । निर्धारण अवधि के अंत में, प्लेट वॉशर पर पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए 0.1% NP40 के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।इनक्यूबेशन के अंत में, कोशिकाओं को धोएं जैसा कि प्रदर्शन किया गया था। और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन, या बीएसए के 15 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें। इसके बाद, ब्लॉकिंग सीरम को एस्पिरेट करने के लिए प्लेट वॉशर का उपयोग करें, और कमरे के तापमान पर एक घंटे के इनक्यूबेशन के लिए उचित कुओं में ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक को पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं, और प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के 10 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को लेबल करें। कोशिकाओं के परमाणु धुंधला के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एक उपयुक्त परमाणु डाई के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें । और प्रदर्शन के रूप में पीबीएस में कोशिकाओं को धोएं।कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह सेल मास्क के 10 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं लेबल । पीबीएस के साथ एक अंतिम धोने के बाद । फिर प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा पीबीएस के 60 माइक्रोलीटर वितरित करें, और इमेजिंग तक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को सील करें।कोशिकाओं को छवि बनाने के लिए, स्वचालित लेजर ऑटोफोकस का उपयोग करके 10 गुना उद्देश्य के तहत उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करके उच्च सामग्री इमेजर पर चार छवियों को अच्छी तरह से कैप्चर करें और अधिग्रहण के दौरान बिनिंग लागू करें। फिर मेटाडेटा के साथ 16-बिट ग्रेस्केल डॉट-टिफ फाइलों के रूप में छवियों को स्टोर करें। एंटीबॉडी मान्यता को लक्षित प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तनों से बाधित नहीं किया जाना चाहिए जिसे लिगांड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, BIRB796 में एक लंबी दर है, और लक्ष्य सगाई का परिमाणीकरण केवल एक एंटीजन पुनर्प्राप्ति कदम लागू करके संभव है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण यौगिकों के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए यह प्रतिनिधि थर्मल एकत्रीकरण वक्र प्रयोग विभिन्न तापमान पर यौगिकों के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद विशिष्ट प्रोटीन स्थिरीकरण पर्वतमाला दिखाता है। यहां प्रयोगात्मक यौगिक की विभिन्न खुराकों के जवाब में प्रोटीन स्थिरीकरण की प्रतिनिधि श्रेणियों को प्रदर्शित करने के लिए एक विशिष्ट आइसोथेरमल खुराक-प्रतिक्रिया फिंगरप्रिंट प्रयोग दिखाया गया है।लक्ष्य प्रोटीन के उपन्यास बांधने वालों की पहचान करने के लिए यौगिक स्क्रीनिंग के लिए आइसोथर्मल हीट चुनौतियों का अनुप्रयोग एक समय में एक ही एकाग्रता पर बड़ी संख्या में यौगिकों के विश्लेषण की अनुमति देता है, इससे पहले कि लक्ष्य प्रोटीन स्थिरीकरण की पुष्टि करने के लिए हिट की आइसोथर्मल खुराक-प्रतिक्रिया फिंगरप्रिंटिंग। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि सटीक प्रयोगात्मक स्थितियां, जैसे गर्मी की लंबाई और तापमान यौगिकों की देखी गई शक्ति को प्रभावित करते हैं। यह न भूलें कि पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है।और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय संस्थागत सुरक्षा दिशा-निर्देशों का पालन करने जैसी सावधानियां हमेशा बरती जानी चाहिए ।

Research

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Biochemistry

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पौधों में लौह सामग्री को मापने के लिए एक वर्णमिति विधि

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Cyanobacterium Synechocystis में Phycobiliprotein सामग्री का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक निर्धारण

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

कैसे थोक में और जीने की कोशिकाओं में Photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश को बढ़ाता है

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

केमोप्रोब-आधारित इम्युनोसेस का उपयोग करके KDM1A लक्ष्य सगाई का प्रत्यक्ष मापन

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

2',7'-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफोरेसिन डायसेटेट स्टेनिंग द्वारा अनुयायी कोशिकाओं में कुल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाना

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) का उपयोग करके पौधे बायोमास लिग्निन सामग्री का अनुमान

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण जीवित संयंत्र कोशिकाओं में माप

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...