Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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Gli autori riconoscono un'infrastruttura di supporto dalla scienza per il laboratorio di vita e Karolinska Institutet. Gli autori riconoscono anche ingresso e discussioni con Michaela Vallin, Magdalena Otrocka e Thomas Lundbäck.

1. semina delle cellule
Nota: Per una panoramica generale del flusso di lavoro vedere la Figura 1. Un elenco dettagliato dei materiali e i reagenti sono disponibili nella Tabella materiali.
<ol><li>Prima della semina delle cellule, forare con una punta standard nella cornice di nero piastre dosaggio imaging da 384 pozzetti per evitare bolle d'aria intrappolata sotto la piastra più tardi durante la fase di riscaldamento. Per evi...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Come discusso nella sezione risultati, ci sono diversi passaggi chiave per la procedura. In primo luogo, è importante identificare un reagente di affinità di alta qualità. Si consiglia una piccola biblioteca di anticorpi per ogni destinazione desiderata di screening. Dopo aver selezionato un anticorpo primario, è anche importante convalidare il sistema per un certo numero di siti leganti differenti della proteina bersaglio, se del caso. Counter-screening per composti che interferiscono con il segnale di test, come mo...

Durante lo sviluppo di nuovi farmaci o sonde chimiche è essenziale per accoppiare l'effetto farmacologico osservato o lettura funzionale ad misure di capienza di destinazione o di fidanzamento in cellule vive1,2,3. Tali dati sono necessari per assicurare che la piccola molecola infatti raggiunge la sua destinazione desiderata sia per convalidare l'ipotesi biologica dietro proteine bersaglio selezione4,5. Inoltre, durante lo sviluppo di farmaci, sistemi di modello di complessità crescente vengono utilizzati per selezionare e confermare un piombo composto prima del test clinici. Per confermare la traduzione di biologia attraverso questi sistemi preclinici, metodi per tracciare l'impegno di droga-destinazione e biologia in tutto questo processo di sviluppo di accompagnamento sono critici.
L'impegno di droga-destinazione è tradizionalmente difficile da monitorare in cellule vive con Gegbenenfalls piccole molecole e proteine, soprattutto a livello di singola cellula con risoluzione spaziale6,7. Unmodified risale un metodo per osservare l'interazione tra farmaci e proteine in cellule vive è il test di spostamento termico cellulare (CETSA) in cui stabilizzazione indotta da legante di una proteina nativa in risposta ad una sfida di calore è quantificata8, 9,10. Ciò avviene mediante la quantificazione della proteina solubile rimanente dopo l'esposizione a una sfida di calore. La divulgazione iniziale di CETSA, western blot è stato usato per il rilevamento. Per attivare campagne di screening e colpire triaging delle più grandi collezioni di composti, gli sforzi per aumentare il throughput di CETSA esperimenti hanno portato allo sviluppo di parecchi saggi omogenei, basati su micropiastra10,11. Tuttavia, una limitazione con questi metodi è che attualmente meglio sono adatti al trattamento composto in sospensioni delle cellule e la rilevazione richiede la lisi cellulare, portando alla perdita di informazioni spaziali. CETSA può essere applicato sperimentalmente sia come uno spostamento indotta da legante in temperatura di aggregazione termica (Tagg) ad un'unica concentrazione della molecola piccola o alla concentrazione di ligando necessaria per stabilizzare la proteina ad una singola temperatura. Quest'ultimo è definito le impronte digitali di isotermici dose risposta (ITDRF) per indicare la dipendenza di queste misurazioni specifiche condizioni sperimentali.
L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'impegno di destinazione utilizzando CETSA in cellule aderenti di rilevazione dell'anticorpo di immunofluorescenza (IF) con microscopia ad alto contenuto12. Questa procedura si estende la piattaforma CETSA originale per consentire per cella singola quantificazione di aggancio di obiettivo con conservazione della localizzazione subcellulare. In particolare, a differenza di molti rapporti precedenti, in questa procedura composto trattamento viene effettuato in cellule vive aderente senza distacco di superficie o lavaggio prima della sfida di calore, preservando così l'equilibrio stabilito associazione che intendiamo misurare13. Attualmente, il metodo viene convalidato per una destinazione della proteina p38α (MAPK14) in diverse linee cellulari, e ci auguriamo che attraverso la condivisione di questa procedura la tecnica può essere applicata ampiamente attraverso il proteoma di fusione. Prevediamo che questo protocollo può essere adattato in tutta la pipeline di sviluppo di droga dallo screening, ha colpito triaging attraverso al monitoraggio dell'obiettivo fidanzamento in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantificazione dell'interazione di piccole molecole con loro previsto proteina bersaglio è fondamentale per lo sviluppo di farmaci, destinazione convalida e convalida di sonda chimica. Metodi che misurano questo fenomeno senza modifiche della proteina bersaglio o piccola molecola sono particolarmente preziose, anche se tecnicamente impegnativi. L'analisi di spostamento termico cellulare (CETSA) è una tecnica per monitorare l'impegno di destinazione in cellule viventi. Qui, descriviamo un adattamento del protocollo originale CETSA, che assicura per misurazioni di throughput elevato pur mantenendo la localizzazione subcellulare a livello di singola cellula. Crediamo che questo protocollo offre importanti progressi per l'applicazione di CETSA per approfondita caratterizzazione dell'interazione di composto-destinazione, particolarmente in popolazioni eterogenee delle cellule.

Il protocollo descritto nella Figura 1 descrive il flusso di lavoro di base per l'esecuzione di saggi CETSA su cellule aderenti con rilevazione della proteina solubile rimanente da alto contenuto imaging. Questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato a tutte le fasi di sviluppo di analisi modificando il layout della piastra dei composti o reagenti14. Dettagliamo i risultati attesi per più atteso seguito di casi di utilizzo.<...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Misurazioni di aggancio di obiettivo di droga sono centrale per lo sviluppo di farmaci efficaci e convalida di sonda chimica. Qui, dettagliamo un protocollo per la misurazione l'impegno di droga-destinazione usando la formazione immagine contenuta elevata in micropiastra compatibile con l'adattamento del dosaggio cellulare spostamento termico (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia chimica e scoperta di farmaci. Ad esempio, il tuo composto si lega alla proteina bersaglio? I principali vantaggi di questa tecnica sono che non c'è alcun requisito di distacco delle cellule aderenti.E la localizzazione spaziale può essere determinata dall'imaging. Sebbene abbiamo applicato questo metodo nelle linee cellulari, è anche possibile applicare questo metodo ad altri sistemi cellulari come colture primarie e coculture. Prima di seminare le cellule, posizionare le piastre nere di dosaggio di imaging da 384 porsi in una cappa di coltura tissutale e coprire le piastre con un foglio di alluminio prima di utilizzare un trapano standard per realizzare tre fori di diametro di 3,5 millimetri su entrambe le estremità di ciascuna piastra.Quando le piastre sono pronte, utilizzare la tecnica aseptica per lavare una coltura cellulare A-431 con da 5 a 10 millilitri di PBS. E incubare le cellule con due millilitri di tripina a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule si staccano. Dopo il conteggio, diluire le cellule a 5 per 10 fino alle 4 ° cellule per millilitro nel mezzo di coltura e seminare 40 microlitri di cellule in ogni pozzo di ogni piastra di dosaggio.Scuotere delicatamente ogni piastra da un lato all'altro dopo la semina per garantire una distribuzione omogenea delle cellule attraverso i fondali del pozzo. Per ridurre al minimo gli effetti del bordo della piastra, lasciare che le cellule si sistemino nella parte inferiore delle piastre di dosaggio per 20 minuti a temperatura ambiente nella parte posteriore della cappa di flusso laminare prima di posizionare le piastre in una camera umidificata personalizzata per due o tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno dell'esperimento, utilizzare una rondella per aspirare il mezzo da ogni pozzo.E aggiungere 30 microlitri del composto di interesse alla concentrazione sperimentale appropriata ai pozzi sperimentali appropriati. Sigillare le piastre di dosaggio trattate con composto con guarnizioni a piastre traspiranti. E riportare le piastre all'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti.Per esporre le cellule a una sfida termica, impostare prima il bagno d'acqua alla temperatura sperimentale appropriata e posizionare una piastra fittizia non sigillata contenente lo stesso volume di mezzo per mezzo e la piastra di dosaggio nel bagno, insieme a un termometro termoplastico per monitorare la temperatura all'interno dei pozzi. Una volta raggiunta la temperatura sperimentale appropriata, rimuovere la guarnizione traspirante da ogni piastra di dosaggio e rigillare le piastre con un foglio di alluminio adesivo stretto per assicurarsi che non perda acqua nei pozzi durante il successivo riscaldamento nel bagno d'acqua. Mantenere accessibili i fori praticati all'interno del telaio della piastra.Posizionare le piastre di dosaggio e una nuova piastra fittizia nel bagno d'acqua, con i fondi delle piastre angolati verso la superficie dell'acqua per forzare l'aria rimanente da sotto le piastre e iniziare a monitorare la temperatura della nuova piastra fittizia. Un riscaldamento uniforme della piastra è fondamentale per le prestazioni di dosaggio. Fare attenzione a posizionare la piastra nel bagno d'acqua in modo che non ci siano bolle d'aria intrappolate sotto.Dopo tre minuti, raffreddare immediatamente le piastre in un secondo bagno d'acqua di acqua a temperatura ambiente per cinque minuti prima della loro analisi. Per immagini le cellule, aggiungere prima 10 microlitri di paraformaldeide al 16% direttamente alle piastre di dosaggio per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Alla fine del periodo di fissazione, lavare le celle con 300 microlitri di PBS sulla rondella della piastra e aggiungere 20 microlitri dello 0,1%NP40 per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule come dimostrato. E bloccare le cellule con 15 microlitri di albumina siere bovina all'1%, o BSA, per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare la rondella per aspirare il siero bloccante e aggiungere 10 microlitri dell'anticorpo primario di interesse ai pozzi appropriati per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, lavare ogni bene con 300 microlitri di PBS ed etichettare le cellule con 10 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce. Per la colorazione nucleare delle cellule, aggiungere 10 microlitri di un colorante nucleare appropriato a ciascun pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente. E lavare le cellule in PBS come dimostrato.Etichettare le celle con 10 microlitri di maschera cellulare per pozzo per 30 minuti a temperatura ambiente. Seguito da un ultimo lavaggio con PBS. Quindi erogare 60 microlitri di PBS fresco ad ogni pozzo e sigillare le piastre con un foglio di alluminio fino all'imaging.Per immagini le celle, cattura quattro immagini per pozzo su un imager ad alto contenuto utilizzando i canali fluorescenti appropriati sotto l'obiettivo 10 volte utilizzando l'autofocus laser automatizzato e applica il binning durante l'acquisizione. Quindi archiviare le immagini come file dot-tiff in scala di grigi a 16 bit insieme ai metadati. Il riconoscimento degli anticorpi non deve essere interrotto da cambiamenti conformazionali nella proteina bersaglio che possono essere indotti dal legame del ligando.Ad esempio, BIRB796 ha un tasso di riposo lungo e la quantificazione dell'impegno target è possibile solo applicando un passaggio di recupero dell'antigene. Questo esperimento rappresentativo della curva di aggregazione termica per le cellule trattate con composti di controllo positivi e negativi illustra i tipici intervalli di stabilizzazione proteica dopo il trattamento delle cellule con i composti a varie temperature. Qui viene dimostrato che un tipico esperimento di impronte digitali isotermiche dose-risposta dimostra intervalli rappresentativi di stabilizzazione proteica in risposta a diverse dosi di composto sperimentale.L'applicazione di sfide di calore isotermico per lo screening composto per identificare nuovi leganti della proteina bersaglio consente l'analisi di un gran numero di composti ad una singola concentrazione contemporaneamente, prima del rilevamento delle impronte digitali isotermiche dose-risposta dei colpi per confermare la stabilizzazione della proteina bersaglio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le condizioni sperimentali esatte, come la lunghezza e la temperatura della sfida termica, hanno un impatto sulla potenza osservata dei composti. Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso.E le precauzioni, come seguire le linee guida istituzionali in materia di sicurezza, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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