Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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著者は、ライフ研究所、カロリンスカ研究所の科学からインフラストラクチャのサポートを認めます。著者には、入力、ミカエラ Vallin、マグダレナ Otrocka とトーマス ・ Lundbäck との協議も認めます。

1. 細胞の播種
注:ワークフローの一般的な概要については、図 1を参照してください。材料および試薬の詳細なリストはテーブルの材料で利用できます。
<ol><li>細胞の播種前に黒 384-well アッセイ プレート加熱ステップ中に後で皿の下敷きにされている空気の泡を避けるためにフレームに標準的なドリルで穴をあけます。こ...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

結果のセクションで説明したように、方法は、いくつかのキー手順があります。まず、質の高い親和性の試薬を識別するために重要です。各ターゲットのための抗体の小さなライブラリをスクリーニングをお勧めします。一次抗体を選択すると、また適切な蛋白質ターゲットの異なる結合部位数のシステムを検証することが重要です。カウンター熱チャレンジを省略することによって<strong cl...

開発新薬や化学プローブ ターゲット占有または生きているセル1,2,3への関与の測定と観察された薬理効果や機能的な読み出しをカップルが不可欠です。これらのデータが小分子実際に目的のターゲットに達することを確認して蛋白質ターゲット選択4、5の背後にある生物学的仮説を検証するために必要です。さらに、医薬品開発の間には複雑化のモデル システムは選択し、臨床試験の前に化合物鉛を裏付けるにされます。これらの前臨床システムの生物学の翻訳を確認するための創薬ターゲットの関与をトレースと付随するこの開発プロセス全体を通じて生物学の方法が重要です。
創薬ターゲット婚約伝統的 unfunctionalized 小分子や蛋白質、特に空間分解能6、7の単一細胞レベルで生きた細胞を監視するために挑戦されています。間の相互作用を観察する 1 つの最近の方法は、薬をそのまま、生きた細胞中のタンパク質は熱チャレンジへの応答でネイティブ蛋白質のリガンド誘導性の安定化、定量化された8、携帯電話熱シフト試金 (CETSA) 9,10。これが熱の挑戦への暴露後残りの可溶性タンパク質を定量化することでできます。CETSA の最初の開示、西部のしみの検出のため使用されました。早期発見キャンペーンを有効にし、大きい化合物コレクションのトリアージをヒット、CETSA 実験のスループットを増やすためにいくつか同種のマイクロ プレート ベースのアッセイ10,11の開発をリードしています。ただし、これらのメソッド 1 つの制限は、細胞懸濁液における化合物の治療に適しています現在最高検出セル換散、空間情報の損失につながるが必要です。CETSA がすることができます小さな分子の単一濃度または単一温度で蛋白質を安定させるために必要なリガンド濃度で実験加熱凝集温度 (Tagg) の配位子誘起シフトのいずれかとして適用します。後者は、等温線量応答指紋これら測定は特定の実験条件に依存性を示すために (ITDRF) と呼ばれます。
このプロトコルの目標は、付着細胞で CETSA を用いた高コンテンツ顕微鏡12蛍光 (IF) 抗体の検出のターゲットの関与を測定することです。この手順は、内局の保全とターゲットの関与の単一セルの定量化を可能にするのには、元の CETSA プラットフォームを拡張します。特に、多くの以前のレポートとは異なりこの手順では複合治療で実行されますライブの付着性のセル表面剥離有無により13の測定を目指して設立された結合平衡を保持熱挑戦前に洗濯。現在、メソッドは 1 つのターゲット蛋白質 p38α の検証 (MAPK14) のいくつかの細胞株、およびことこの手順を共有することによってテクニック広範に適用できる溶融プロテオームを越えてほしい。我々 は、このプロトコルはスクリーニングから医薬品開発パイプライン全体で合わせることができる、ターゲット婚約生体内での監視を通じてトリアージを見込んでいます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

目的の蛋白質ターゲットと小分子の相互作用を量的に表わす創、ターゲットの検証および化学プローブ検証にとって重要です。蛋白質ターゲットまたは小さい分子のままこの現象の測定方法は、技術的には難しいと思う特に貴重です。細胞熱シフト試金 (CETSA) は、細胞内のターゲットの関与を監視する技術のひとつです。ここでは、単一細胞レベルでの細胞内局在化を維持しながら高いスループット測定できますオリジナルの CETSA プロトコルの適応について述べる。このプロトコルは CETSA の化合物ターゲット相互作用、特に細胞の異種個体集団の詳細な特性評価申請に重要な進歩を提供するいますと考えています。

図 1で説明したプロトコルでは、残りの可溶性タンパク質の検出と付着性のセルで高いコンテンツ イメージングによる CETSA 試金を実行するための基本的なワークフローについて説明します。このワークフローは、化合物や試薬14プレート レイアウトを変更することによりアッセイ開発のすべての段階に容易に適応することがで...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。

薬のターゲットの関与の測定、効果的な薬の開発と妥当性化学プローブの中心。ここでは、我々 は携帯電話熱シフト試金 (CETSA) のマイクロ プレート互換適応高コンテンツ イメージングを用いた創薬ターゲット婚約を測定するためのプロトコルを詳しく説明します。

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

この方法は、化学生物学と創薬における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、あなたの化合物は標的タンパク質に結合しますか?この手法の主な利点は、接着細胞の剥離の要件が無いということです。空間的な局在化はイメージングによって決定することができる。この方法は細胞株で適用しましたが、この方法を主要な培養物やコカルチャーなどの他の細胞系にも適用することも可能です。細胞を播種する前に、黒い384ウェルイメージングアッセイプレートを組織培養フードに入れ、標準ドリルを使用して各プレートの両端に3.5ミリメートルの直径の穴を作る前に、アルミニウム箔でプレートを覆います。プレートの準備ができたら、無菌技術を使用して、5〜10ミリリットルのPBSでA-431細胞培養を洗浄します。そして、細胞が剥離するまで摂氏37度でトリプシンの2ミリリットルで細胞をインキュベートします。計数後、培養培地で1ミリリットル当たり4番目の細胞に5倍10~4番目の細胞を希釈し、各アッセイプレートの各ウェルに40マイクロリットルの細胞をシードする。播種後の各プレートを左右に軽く振り、ウェルボトム全体の細胞の均質な分布を確保します。プレートエッジの効果を最小限に抑えるために、細胞が積層流フードの後ろの室温で20分間アッセイプレートの底に落ち着くようにしてから、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間カスタム加湿チャンバーに入れます。実験当日は、プレートワッシャーを使用して各ウェルから培地を吸引します。そして、適切な実験井戸に適切な実験濃度で目的の化合物の30マイクロリットルを加える。合成処理アッセイプレートを通気性のあるプレートシールで密封します。そして、30分間細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。熱に挑戦する細胞を公開するには、まず、適切な実験温度に水浴を設定し、ウェル内の温度を監視するための温度温度計と一緒に、測定プレートと同様に同じ量の媒体を含む未密封のダミープレートを浴に入れます。適切な実験温度に達したら、各アッセイプレートから通気性シールを取り除き、密着した接着型アルミニウム箔でプレートを再密封して、その後の水浴の加熱中に井戸に水が漏れないようにします。プレートフレーム内のドリル穴をアクセス可能に保ちます。プレートの底を水面に向けて傾けて、プレートの下から残りの空気を強制的に押し付け、新しいダミープレートの温度の監視を開始して、アッセイプレートと新しいダミープレートを水浴に入れます。プレートの加熱もアッセイの性能にとって重要です。下に閉じ込められた気泡がなさそうな水浴にプレートを置くように注意してください。3分後、すぐに分析の前に5分間室温水の第二の水浴でプレートを冷却します。細胞を画像化するには、まず16%パラホルムアルデヒドの10マイクロリットルをアッセイプレートに直接加え、室温で20分間インキュベーションします。固定期間の終わりに、プレートウォッシャーに300マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、室温で10分間インキュベーションするために0.1%NP40の20マイクロリットルを加えます。インキュベーションの終わりに、実例のように細胞を洗浄する。そして、1%ウシ血清アルブミン、またはBSAの15マイクロリットルの細胞を室温で1時間ブロックします。次に、プレートワッシャーを使用してブロッキング血清を吸引し、目的の一次抗体の10マイクロリットルを適切なウェルに加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、300マイクロリットルのPBSで各ウェルをよく洗い、適切な二次抗体の10マイクロリットルを光から保護した室温で1時間ラベル付けします。細胞の核染色の場合は、適切な核染料10マイクロリットルを室温で10分間各ウェルに加えます。そして、実証したようにPBSで細胞を洗浄する。セルに1ウェルあたり10マイクロリットルのセルマスクを室温で30分間ラベル付けします。続いてPBSで最後の洗浄が行われた。その後、各ウェルに新鮮なPBSの60マイクロリットルを分配し、イメージングまでアルミニウム箔でプレートを密封します。細胞を画像化するには、自動レーザーオートフォーカスを使用して10倍の目的で適切な蛍光チャネルを使用して高含有量イメージャー上のウェルあたり4つの画像をキャプチャし、取得中にビニングを適用します。次に、画像をメタデータと共に 16 ビットのグレースケールのドット tiff ファイルとして保存します。リガンド結合によって誘導され得る標的タンパク質の立体構造変化によって抗体認識が破壊されてはならない。例えば、BIRB796は、長いオフレートを有し、かつ、抗原検索ステップを適用することによってのみ、標的関与の定量が可能である。陽性および陰性対照化合物で処理された細胞に対する本代表熱凝集曲線実験は、種々の温度での化合物での細胞の処理後の典型的なタンパク質安定化範囲を例示する。ここで典型的な等温線量応答指紋実験は、実験化合物の異なる用量に応答してタンパク質安定化の代表的な範囲を示すことを示す。化合物スクリーニングのための等温熱課題を適用して、標的タンパク質の新規結合剤を同定することで、ヒットの等温線量応答フィンガープリントの前に、一度に1つの濃度で多数の化合物を分析し、標的タンパク質安定化を確認することができます。この手順を試みる間、熱の長さや温度などの正確な実験条件が化合物の観察力に影響を与えることを覚えておくことが重要です。パラホルムアルデヒドを使用すると非常に危険なことができますことを忘れないでください。また、制度上の安全ガイドラインに従うなどの予防措置は、この手順を実行する際に必ず講じる必要があります。

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