Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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저자는 과학 생활 연구소와 카롤 린스 카 Institutet 위한 인프라 지원을 인정합니다. 저자는 또한 입력과 Michaela Vallin, 막달레나 Otrocka와 토마스 Lundbäck 토론을 인정합니다.

1. 셀의 시드
참고: 워크플로 대 한 일반적인 개요에 대 한 그림 1을 참조 하십시오. 재료 및 시 약의 상세 목록 테이블의 재료에서 사용할 수 있습니다.
<ol><li>셀의 시드, 이전 나중 단계에서 난방 접시 아래 갇혀 공기 방울을 피하기 위해 검은 384-잘 이미징 분석 결과 접시의 프레임에 표준 드릴 구멍을 드릴 합니다. 플라스틱 입...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그?...

때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.
마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된8, 9,10. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (Tagg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.
이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경12immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가13를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.

그림 1 에 설명 된 프로토콜에서는 높은 콘텐츠 영상으로 남아 있는 수용 성 단백질의 탐지와 부착 세포에 CETSA 분석 실험을 실행 하기 위한 기본 워크플로 설명 합니다. 이 워크플로 화합물 또는 약14의 격판덮개 레이아웃을 수정 하 여 쉽게 분석 결과 개발의 모든 단계에 맞게 수 있습니다. 우리 선발 예상된 결과 예상 몇 가지 사용 ...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

이 방법은 화학 생물학 및 약물 발견의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 화합물은 표적 단백질에 결합합니까? 이 기술의 주요 장점은 부착 된 세포의 분리 요구 사항이 없다는 것입니다.그리고 공간 국소화는 이미징에 의해 결정될 수 있다. 우리는 세포주에서 이 방법을 적용했습니다, 1 차적인 배양 및 동배와 같은 그밖 세포 시스템에 이 방법을 적용하는 것은 또한 가능합니다. 세포를 파종하기 전에, 조직 배양 후드에 검은 색 384 웰 이미징 분석 플레이트를 배치하고, 각 플레이트의 양쪽 끝에 세 개의 3.5 밀리미터 직경 구멍을 만들기 위해 표준 드릴을 사용하기 전에 알루미늄 호일로 플레이트를 덮어.플레이트가 준비되면 무균 기술을 사용하여 PBS의 5~10밀리리터로 A-431 세포 배양을 세척합니다. 그리고 세포가 분리 될 때까지 섭씨 37도에서 트립신의 2 밀리리터로 세포를 배양합니다. 세고 후, 배양 배지에서 밀리리터당 4번째 세포로 세포를 5배 10배, 각 분석판의 각 웰에 40마이크로리터의 종자하였다.시드 후 각 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 우물 바닥을 가로질러 세포의 균질한 분포를 보장합니다. 플레이트 엣지 효과를 최소화하기 위해, 세포가 라미나르 유동 후드 뒤쪽의 실온에서 20분 동안 분석 플레이트의 바닥에 정착한 후 37°C와 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 사용자 지정 가습 챔버에 플레이트를 배치하도록 한다. 실험 당일, 플레이트 와셔를 사용하여 각 우물에서 배지를 흡인시합니다.그리고 적절한 실험적 우물에 적절한 실험 농도에 관심 있는 화합물의 30 마이크로리터를 첨가한다. 통기성 플레이트 씰로 화합물 처리 분석 플레이트를 밀봉하십시오. 그리고 30 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.열 과제에 세포를 노출하려면 먼저 수조를 적절한 실험 온도로 설정하고, 우물 내온도를 모니터링하기 위한 온도대 온도계와 함께 분석 플레이트와 동일한 양의 매체를 포함하는 밀봉되지 않은 더미 플레이트를 욕조에 배치합니다. 적절한 실험 온도에 도달하면 각 분석 판에서 통기성 씰을 제거하고 단단한 접착제 알루미늄 호일로 플레이트를 다시 밀봉하여 수조에서 후속 가열 중에 우물에 물이 누출되지 않도록하십시오. 플레이트 프레임 내에서 드릴링된 구멍을 액세스할 수 있도록 유지합니다.분석 플레이트와 새로운 더미 플레이트를 수조에 넣고 플레이트의 바닥이 수면쪽으로 기울어져 플레이트 아래에서 남은 공기를 강제로 밀어 내고 새로운 더미 플레이트의 온도를 모니터링합니다. 접시의 균일 한 가열은 분석 성능에 매우 중요합니다. 밑에 기포가 갇혀 있지 않습니다 있도록 수조에 접시를 배치주의하십시오.3분 후, 분석 전에 5분 동안 실온 수의 두 번째 수조에서 플레이트를 즉시 식힙니다. 세포를 이미지화하기 위해 먼저 16%의 파라포름알데히드 10마이크로리터를 실온에서 20분 배양하기 위해 분석 판에 직접 추가합니다. 고정 기간이 끝나면 플레이트 세탁기에 PBS 300 마이크로리터로 셀을 세척하고 실온에서 10분 동안 0.1%NP40의 마이크로리터 20을 추가합니다.인큐베이션의 끝에서, 입증 된 대로 세포를 씻어. 그리고 실온에서 1시간 동안 1%소 세럼 알부민 또는 BSA의 15 마이크로리터로 세포를 차단한다. 다음으로, 플레이트 와셔를 사용하여 차단 혈청을 흡인시키고, 1차 항체의 마이크로리터를 실온에서 1시간 배양에 적합한 우물에 첨가한다.인큐베이션이 끝나면 PBS 300 마이크로리터로 각각 잘 세척하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 항체의 10 마이크로리터로 세포를 라벨로 부착한다. 세포의 핵 염색의 경우 실온에서 10 분 동안 각 우물에 적절한 핵 염료 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 입증 된 바와 같이 PBS에서 세포를 씻어.실온에서 30분 동안 셀 마스크 10마이크로리터로 셀에 라벨을 부착합니다. 다음에 PBS와 마지막 세척. 그런 다음 60 마이크로리터의 신선한 PBS를 각 우물에 분배하고 이미징이 될 때까지 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉합니다.세포를 이미지화하기 위해 자동 레이저 자동 초점을 사용하여 10배 의 목표에 따라 적절한 형광 채널을 사용하여 고함량 이미저에 4개의 이미지를 캡처하고 획득 하는 동안 비닝을 적용합니다. 그런 다음 이미지를 메타데이터와 함께 16비트 그레이스케일 도트-티프 파일로 저장합니다. 항체 인식은 리간드 결합에 의해 유도될 수 있는 표적 단백질의 형성 변화에 의해 중단되어서는 안 된다.예를 들어, BIRB796은 긴 오프 레이트를 가지며, 표적 교합의 정량화는 항원 검색 단계를 적용하여서만 가능하다. 양성 및 음극성 대조군 화합물로 처리된 세포를 위한 대표적인 열 응집 곡선 실험은 다양한 온도에서 화합물을 가진 세포의 처리 후 전형적인 단백질 안정화 범위를 보여줍니다. 여기서 전형적인 이더스말 투여량 반응 지문 실험은 실험 화합물의 상이한 투여량에 반응하여 단백질 안정화의 대표적인 범위를 입증하는 것으로 나타났다.표적 단백질의 새로운 바인더를 식별하기 위한 화합물 스크리닝을 위한 이더말 열 과제의 적용은 표적 단백질 안정화를 확인하기 위해 안타의 더체말 투여 응답 지문 전에 한 번에 한 농도로 많은 수의 화합물을 분석할 수 있게 한다. 이 절차를 시도하는 동안, 열 도전의 길이 및 온도와 같은 정확한 실험 조건이 화합물의 관찰 된 효능에 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 파라포름알데히드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.그리고 이 절차를 수행하는 동안 제도적 안전 지침을 따르는 것과 같은 예방 조치는 항상 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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연구

생화학

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Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

살아있는 식물 세포에서 Förster 공명 에너지 전송 측정

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...