Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Forfatterne bekrefter infrastrukturstøtte fra vitenskap for livet laboratorium og Karolinska Institutet. Forfatterne bekrefter også inngang og diskusjoner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka og Thomas Lundbäck.

1. såing av celler
Merk: Se figur 1for en generell oversikt over arbeidsflyten. En detaljert liste over materialer og reagenser finnes i Tabellen for materiale.
<ol><li>Før Såing av cellene, bore hull med en standard drill i rammen av svart 384-og bildebehandling analysen plater å unngå luftbobler blir fanget under platen senere under oppvarming trinnet. Unngå plast partikler inn brønnene i dette trinnet og opprettholde s...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Som beskrevet under resultater, finnes det flere viktige trinn i prosedyren. Først er det viktig å identifisere en høykvalitets affinitet reagens. Vi anbefaler screening et lite bibliotek av antistoffer for hvert ønsket mål. Etter en primær antistoff er valgt, er det også viktig å validere systemet for en rekke forskjellige bindende områder av protein målet eventuelt. Mot screening for forbindelser som forstyrrer analysen signalet som vist i figur 2C ved å utelate varme utfordring...

Ved utvikling av nye medisiner eller kjemiske sonder er det viktig å par observert farmakologisk effekt eller funksjonelle avlesning mål mål personer eller engasjement i lever celler1,2,3. Disse dataene er både å sikre at de små molekylet faktisk når ønsket målet og validere biologiske hypotesen bak protein mål utvalg4,5. Videre under narkotika utvikling brukes modellsystemer økende kompleksitet til å velge og bekrefte et kundeemne sammensatte før kliniske studier. For å bekrefte oversettelse av biologi over disse prekliniske systemer, er metoder for sporing narkotika-mål engasjement og tilhørende biologi utvikling prosessen avgjørende.
Narkotika-mål engasjement har tradisjonelt vært utfordrende overvåke lever celler med unfunctionalized små molekyler og proteiner, særlig på encellede nivå med romlig oppløsning6,7. En nyere metode å observere samspillet mellom uendret narkotika og proteiner i levende celler er mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) der ligand-indusert stabilisering av en innfødt protein som svar på en varme utfordring er kvantifisert8, 9,10. Dette oppnås ved å kvantifisere gjenværende løselig protein etter eksponering for en varme utfordring. I første fremlegging av CETSA, ble western blot brukt for påvisning. For å aktivere screening kampanjer og traff triaging større sammensatte samlinger, har arbeidet med å øke gjennomstrømmingen CETSA eksperimenter ført til utviklingen av flere homogen, microplate-baserte analyser10,11. Imidlertid er en begrensning med disse at de er for tiden best egnet til sammensatte behandling i cellen suspensjoner og gjenkjenning krever celle lysis, fører til tap av romlig informasjon. CETSA kan være brukt eksperimentelt enten som en ligand-indusert endring i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enkelt konsentrasjon av små molekyl eller ligand konsentrasjon nødvendig å stabilisere protein på en enkelt temperatur. Sistnevnte kalles isotermiske dose svar fingeravtrykk (ITDRF) for å markere avhengighet av disse målene på bestemte eksperimentelle forhold.
Målet med denne protokollen er å måle mål engasjement ved hjelp av CETSA i tilhenger celler ved immunofluorescent (hvis) antistoff oppdagelsen med høyt innhold mikroskopi12. Denne prosedyren utvider den opprinnelige CETSA plattformen å tillate encellede kvantifisering av mål engasjement med bevaring av subcellular lokalisering. Spesielt, i motsetning til mange tidligere rapporter, i denne prosedyren sammensatte behandling utføres i live tilhenger celler uten overflaten avdeling eller vask før varme utfordringen, dermed bevare etablerte bindende likevekt mål å måle13. Foreløpig metoden er godkjent for ett mål protein p38α (MAPK14) i flere cellelinjer, og vi håper at ved å dele denne prosedyren teknikken kan brukes bredt på den smeltende proteom. Vi forventer at denne protokollen kan tilpasses gjennom rørledningen narkotika utvikling fra screening, traff triaging gjennom overvåking av målet engasjement i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating samspillet av små molekyler med sine tiltenkte protein målet er avgjørende for narkotika utvikling, målet validering og kjemiske sonde validering. Metoder som måler dette fenomenet uten endring av protein målet eller små molekyl er spesielt verdifull om teknisk utfordrende. Mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en teknikk for å overvåke målet engasjement i levende celler. Her beskriver vi en tilpasning av den opprinnelige CETSA-protokollen, som tillater for høy gjennomstrømning mål samtidig beholde subcellular lokalisering på enkeltcelle nivå. Vi tror denne protokollen gir viktige fremskritt til anvendelsen av CETSA for detaljert karakterisering av sammensatte mål interaksjon, spesielt i heterogene populasjoner av celler.

Protokollen i figur 1 beskriver den grunnleggende arbeidsflyten for å kjøre CETSA analyser på tilhenger celler med oppdagelsen av gjenværende løselig protein av høy innhold tenkelig. Denne arbeidsflyten kan lett tilpasses alle stadier av analysen utvikling ved å endre oppsettet plate forbindelser eller reagenser14. Vi detalj forventede resultater for flere forventet brukstilfeller nedenfor.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Målinger av narkotika mål engasjement er sentrale effektiv narkotika utvikling og kjemiske sonde validering. Her, detalj vi måle narkotika mål engasjement med høy innhold imaging i en microplate-kompatibelt tilpasning av mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en protokoll.

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i kjemisk biologi og narkotikaoppdagelse. Som, binder forbindelsen seg til målproteinet? De viktigste fordelene med denne teknikken er at det ikke er krav om løsrivelse av de tiltalende cellene.Og romlig lokalisering kan bestemmes av bildebehandling. Selv om vi har brukt denne metoden i cellelinjer, er det også mulig å bruke denne metoden på andre cellesystemer som primære kulturer og kokulturer. Før du sår cellene, legg svarte 384-brønns bildeanalyseplater i en vevskulturhette, og dekk platene med aluminiumsfolie før du bruker en standard drill for å lage tre 3,5 millimeter diameter hull på begge ender av hver plate.Når platene er klare, bruk aseptisk teknikk for å vaske en A-431 cellekultur med 5 til 10 milliliter PBS. Og inkuber cellene med to milliliter trypsin ved 37 grader Celsius til cellene løsner. Etter telling, fortynne cellene til 5 ganger 10 til fjerde celler per milliliter i kultur medium, og frø 40 mikroliter celler til hver brønn av hver analyseplate.Forsiktig risting hver plate fra side til side etter såing for å sikre en homogen fordeling av cellene over brønnbunnen. For å minimere platekanteffekter, la cellene slå seg ned på bunnen av analyseplatene i 20 minutter ved romtemperatur på baksiden av laminærstrømningshetten før du plasserer platene i et tilpasset fuktet kammer i to til tre dager ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. På dagen for eksperimentet, bruk en tallerken vaskemaskin for å aspirere mediet fra hver brønn.Og tilsett 30 mikroliter av interesseforbindelsen ved riktig eksperimentell konsentrasjon til de aktuelle eksperimentelle brønnene. Forsegle de sammensatte analyserte analyseplatene med pustende platetetninger. Og returner platene til cellekulturinkubatoren i 30 minutter.For å utsette cellene for en varmeutfordring, sett først vannbadet til riktig eksperimentell temperatur, og plasser en uforseget dummyplate som inneholder samme volum av middels per samt analyseplaten inn i badekaret, sammen med et termoelementtermometer for overvåking av temperaturen i brønnene. Når riktig eksperimentell temperatur er nådd, fjern den pustende forseglingen fra hver analyseplate og forsegle platene med en tett limaluminiumsfolie for å sikre at det ikke lekker vann inn i brønnene under etterfølgende oppvarming i vannbadet. Holde de borede hullene inne i platerammen tilgjengelig.Plasser analyseplatene og en ny dummyplate i vannbadet, med bunnen av platene vinklet mot vannoverflaten for å tvinge gjenværende luft fra under platene, og begynn å overvåke temperaturen på den nye dummyplaten. En jevn oppvarming av platen er avgjørende for analyseytelse. Vær forsiktig med å plassere platen i vannbadet slik at det ikke er noen luftbobler fanget under.Etter tre minutter, umiddelbart kjøle platene i et annet vannbad av romtemperatur vann i fem minutter før analysen. For å se av cellene, legg først til 10 mikroliter med 16% paraformaldehyd direkte til analyseplatene for en 20-minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av fikseringsperioden vasker du cellene med 300 mikroliter PBS på platevaskeren, og legger til 20 mikroliter på 0,1% NP40 for en 10-minutters inkubasjon ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, vask cellene som demonstrert. Og blokkere cellene med 15 mikroliter på 1% storfe serum albumin, eller BSA, i en time ved romtemperatur. Deretter bruker du platevaskeren til å aspirere blokkeringsserumet, og tilsett 10 mikroliter av det primære antistoffet av interesse for de aktuelle brønnene for en times inkubasjon ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen vask hver brønn med 300 mikroliter PBS, og merk cellene med 10 mikroliter av riktig sekundært antistoff i en time ved romtemperatur beskyttet mot lys. For kjernefysisk farging av cellene, tilsett 10 mikroliter av et passende kjernefysisk fargestoff til hver brønn i 10 minutter ved romtemperatur. Og vask cellene i PBS som demonstrert.Merk cellene med 10 mikroliter cellemaske per brønn i 30 minutter ved romtemperatur. Etterfulgt av en siste vask med PBS. Deretter dispenserer du 60 mikroliter med ferske PBS til hver brønn, og forsegler platene med aluminiumsfolie til avbildning.For å se for deg cellene, ta fire bilder per brønn på en bildeskriver med høyt innhold ved hjelp av de riktige fluorescerende kanalene under 10-tidens mål ved hjelp av automatisert laser autofokus og bruke binning til under oppkjøpet. Deretter lagrer du bildene som 16-biters gråtonepripunkt tiff-filer sammen med metadataene. Antistoffgjenkjenning bør ikke forstyrres ved konformasjonsendringer i målproteinet som kan induseres ved ligandbinding.Birb796 har for eksempel en lang avhastighet, og kvantifisering av målengasjementet er bare mulig ved å bruke et antigenhentingstrinn. Dette representative termiske aggregeringskurveeksperimentet for celler behandlet med positive og negative kontrollforbindelser illustrerer typiske proteinstabiliseringsområder etter behandling av cellene med forbindelsene ved ulike temperaturer. Her er et typisk isotermisk doserespons fingeravtrykkseksperiment vist å demonstrere representative områder av proteinstabilisering som svar på forskjellige doser eksperimentell forbindelse.Anvendelsen av isotermiske varmeutfordringer for sammensatt screening for å identifisere nye bindemiddel av målproteinet gjør det mulig åanalysere et stort antall forbindelser ved en enkelt konsentrasjon på en gang, før isotermisk doserespons fingeravtrykk av treffene for å bekrefte målproteinstabilisering. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at de eksakte eksperimentelle forholdene, for eksempel lengden og temperaturen på varmeutfordringen, påvirker den observerte styrken til forbindelsene. Ikke glem at det kan være ekstremt farlig å arbeide med paraformaldehyd.Og forholdsregler, for eksempel å følge institusjonelle sikkerhetsretningslinjer, bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan kvantifisere brøkdel av Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og lever celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkte måling av KDM1A Target Engagement ved hjelp av Chemoprobe-baserte immunanalyser

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Påvisning av total reaktive oksygenarter i tilhengerceller av 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Flekker

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster resonans energioverføringsmålinger i levende planteceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...