Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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Os autores reconhecem o suporte de infra-estrutura de ciência para a vida de laboratório e Karolinska Institutet. Os autores também reconhecem a entrada e discussões com Michaela Vallin, Magdalena Otrocka e Thomas Lundbäck.

1. semeadura de células
Nota: Para uma visão geral do fluxo de trabalho consulte a Figura 1. Uma lista detalhada de materiais e reagentes estão disponíveis na Tabela de materiais.
<ol><li>Antes da semeadura das células, faça furos com uma broca padrão no quadro de preto 384-imagem do ensaio placas boas para evitar bolhas de ar, sendo presas sob a placa mais tarde durante a etapa de aquecimento. Para evitar plásticas part...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Conforme discutido na seção resultados, existem várias etapas-chave para o procedimento. Em primeiro lugar, é importante identificar um reagente de afinidade de alta qualidade. Recomendamos selecionando uma pequena biblioteca de anticorpos para cada destino desejado. Depois um anticorpo primário foi selecionado, é igualmente importante validar o sistema para um número de sítios de ligação diferente do alvo da proteína, se for o caso. Counter-triagem para compostos que interferem com o sinal de teste, conforme ...

Ao desenvolver novas drogas ou sondas químicas é essencial para acoplar os efeitos farmacológicos observados ou leitura funcional para medições de ocupação de alvo ou noivado em células vivas1,2,3. Estes dados são necessários para garantir que a pequena molécula de fato atinge seu alvo desejado e para validar a hipótese biológica atrás da proteína alvo seleção4,5. Além disso, durante o desenvolvimento de drogas, sistemas modelo de crescente complexidade são usados para selecionar e confirmar um composto antes de ensaios clínicos de chumbo. Para confirmar a tradução de Biologia através destes sistemas pré-clínicos, métodos de rastreamento noivado droga-alvo e que acompanha a biologia em todo este processo de desenvolvimento são críticos.
Noivado de droga-alvo tem sido tradicionalmente desafiador para monitorar em células vivas com unfunctionalized pequenas moléculas e proteínas, especialmente em nível de célula única com resolução espacial de6,7. Um método recente para observar a interação entre sem modificações drogas e proteínas nas células vivas é o ensaio de celular mudança térmica (CETSA) no qual induzida pelo ligante estabilização de uma proteína nativa em resposta a um desafio de calor é quantificada8, 9,10. Isso é realizado através da quantificação da proteína solúvel restante após a exposição a um desafio de calor. Na divulgação inicial de CETSA, borrão ocidental foi usado para a deteção. Para habilitar a campanhas de rastreio e bateu na triagem das maiores coleções de compostos, os esforços para aumentar a taxa de transferência de experiências CETSA tem levado ao desenvolvimento de vários ensaios homogênea, baseada em microplacas10,11. No entanto, uma limitação com esses métodos é que são atualmente melhor adequados ao tratamento composto em suspensões celulares e a detecção exige lise celular, levando à perda de informação espacial. CETSA pode ser aplicado experimentalmente como uma mudança induzida pelo ligante na agregação térmica da temperatura (Tagg) em uma única concentração da molécula pequena ou a concentração de ligante necessária para estabilizar a proteína em uma única temperatura. O último é denominado impressões digitais de resposta de dose isotérmico (ITDRF) para significar a dependência dessas medições em condições experimentais específicas.
O objetivo do presente protocolo é medir o engajamento do alvo usando CETSA em células aderentes por detecção do anticorpo de imunofluorescência (IF) com alto teor de microscopia12. Este procedimento estende a plataforma CETSA original para permitir a quantificação de célula única de engajamento do alvo com a conservação de Localização subcellular. Nomeadamente, ao contrário de muitos relatórios anteriores, neste procedimento composto tratamento é realizado em células aderentes ao vivo sem desprendimento de superfície ou lavar antes o desafio de calor, preservando assim o equilíbrio de ligação estabelecida que pretendemos medir13. Atualmente, o método é validado por um alvo da proteína p38α (MAPK14) em várias linhas de células, e esperamos que compartilhando este procedimento a técnica pode ser aplicada amplamente em todo o derretimento proteome. Esperamos que este protocolo pode ser adaptado ao longo do canal de desenvolvimento de drogas do rastreio, bateu na triagem através de monitoramento do alvo engajamento na vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Dosar a interação de moléculas pequenas com seu alvo pretendido proteína é fundamental para o desenvolvimento de drogas, validação de alvo e validação de sonda química. Métodos que medem este fenômeno sem modificação do alvo da proteína ou pequena molécula são particularmente valiosos, embora tecnicamente desafiador. O ensaio de celular mudança térmica (CETSA) é uma técnica para monitorar o engajamento do alvo em pilhas vivas. Aqui, descrevemos uma adaptação do protocolo CETSA original, que permite medições de alto rendimento, mantendo a Localização subcellular no nível da célula única. Acreditamos que este protocolo oferece importantes avanços para o aplicativo de CETSA para caracterização detalhada da interação de compostos-alvo, especialmente em populações heterogêneas de células.

O protocolo descrito na Figura 1 descreve o fluxo de trabalho básico para a execução de ensaios CETSA em células aderentes com detecção de proteína solúvel restante pelo alta conteúda imagem. Este fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado a todas as fases de desenvolvimento do ensaio, modificando o layout da placa dos compostos ou reagentes14. Detalhamos os resultados esperados para vários antecipado abaixo de casos de u...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Medições de engajamento do alvo de drogas são centrais para droga eficaz desenvolvimento e validação de sonda química. Aqui, detalhamos um protocolo para medição engajamento de droga-alvo utilizando imagens de conteúdo de alta em uma adaptação de microplacas-compatível do ensaio celular mudança térmica (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em biologia química e descoberta de drogas. Como, seu composto se liga à proteína alvo? As principais vantagens para esta técnica são que não há necessidade de desprendimento das células aderentes.E a localização espacial pode ser determinada por imagens. Embora tenhamos aplicado este método em linhas celulares, também é possível aplicar este método a outros sistemas celulares, como culturas primárias e coculturas. Antes de semear as células, coloque placas de ensaio de imagem pretas de 384 poços em uma capa de cultura de tecido, e cubra as placas com papel alumínio antes de usar uma broca padrão para fazer três furos de 3,5 milímetros de diâmetro em ambas as extremidades de cada placa.Quando as placas estiverem prontas, use técnica asséptica para lavar uma cultura celular A-431 com 5 a 10 mililitros de PBS. E incubar as células com dois mililitros de trippsina a 37 graus Celsius até que as células se desprendem. Após a contagem, dilui as células para 5 vezes 10 a 4ª células por mililitro em meio de cultura, e semeou 40 microliters de células para cada poço de cada placa de ensaio.Agitando suavemente cada placa de um lado para o outro após a semeadura para garantir uma distribuição homogênea das células através dos fundos do poço. Para minimizar os efeitos da borda da placa, permita que as células se instalem na parte inferior das placas de ensaio por 20 minutos à temperatura ambiente na parte de trás do capô de fluxo laminar antes de colocar as placas em uma câmara umidificada personalizada por dois a três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia do experimento, use uma arruela de placa para aspirar o meio de cada poço.E adicionar 30 microliters do composto de interesse na concentração experimental apropriada aos poços experimentais apropriados. Sele as placas de ensaio tratadas com compostos com vedações de placa respiráveis. E devolva as placas à incubadora de cultura celular por 30 minutos.Para expor as células a um desafio de calor, primeiro coloque o banho de água à temperatura experimental apropriada, e coloque uma placa fictícia não selada contendo o mesmo volume de médio por bem como a placa de ensaio no banho, juntamente com um termômetro termopar para monitorar a temperatura dentro dos poços. Quando a temperatura experimental apropriada for atingida, remova o selo respirável de cada placa de ensaio e resseque as placas com uma folha de alumínio adesiva apertada para garantir que nenhuma água vaze nos poços durante seu aquecimento subsequente no banho de água. Mantendo os furos perfurados dentro da moldura da placa acessíveis.Coloque as placas de ensaio e uma nova placa falsa no banho de água, com os fundos das placas inclinadas em direção à superfície da água para forçar qualquer ar restante sob as placas, e comece a monitorar a temperatura da nova placa falsa. Um aquecimento uniforme da placa é fundamental para o desempenho do ensaio. Tome cuidado para colocar o prato no banho de água de tal forma que não há bolhas de ar presas por baixo.Após três minutos, esfrie imediatamente os pratos em um segundo banho de água de água em temperatura ambiente por cinco minutos antes de sua análise. Para a imagem das células, adicione primeiro 10 microlitradores de 16% de paraformaldeído diretamente às placas de ensaio para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Ao final do período de fixação, lave as células com 300 microliters de PBS na lavadora de placas e adicione 20 microliters de 0,1%NP40 para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, lave as células como demonstrado. E bloqueie as células com 15 microliters de 1%de albumina de soro bovino, ou BSA, por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, use a arruela de placa para aspirar o soro de bloqueio, e adicione 10 microliters do anticorpo primário de interesse aos poços apropriados para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente.No final da incubação, lave cada poço com 300 microliters de PBS, e rotule as células com 10 microliters do anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente protegida da luz. Para a coloração nuclear das células, adicione 10 microliters de um corante nuclear apropriado a cada poço por 10 minutos à temperatura ambiente. E lave as células em PBS como demonstrado.Rotule as células com 10 microliters de máscara celular por poço por 30 minutos à temperatura ambiente. Seguido por uma última lavagem com PBS. Em seguida, distribua 60 microliters de PBS frescos para cada poço, e sele as placas com papel alumínio até a imagem.Para visualizar as células, capture quatro imagens por poço em um imager de alto conteúdo usando os canais fluorescentes apropriados sob o objetivo de 10 vezes usando foco automático a laser automatizado e aplique binning durante a aquisição. Em seguida, armazene as imagens como arquivos de ponto-tiff de escala de cinza de 16 bits, juntamente com os metadados. O reconhecimento de anticorpos não deve ser interrompido por alterações conformais na proteína alvo que podem ser induzidas pela ligação de ligante.Por exemplo, BIRB796 tem uma taxa de longo desconto, e a quantificação do engajamento de destino só é possível aplicando uma etapa de recuperação de antígeno. Este experimento representativo da curva de agregação térmica para células tratadas com compostos de controle positivos e negativos ilustra faixas típicas de estabilização proteica após o tratamento das células com os compostos em várias temperaturas. Aqui, um típico experimento de impressão digital de dose isthermal é mostrado para demonstrar faixas representativas de estabilização proteica em resposta a diferentes doses de composto experimental.A aplicação de desafios térmicos isotérmicos para triagem composta para identificar novos aglutinantes da proteína alvo permite a análise de um grande número de compostos em uma única concentração ao mesmo tempo, antes da impressão digital de dose isotérmica dos hits para confirmar a estabilização proteica alvo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as condições experimentais exatas, como o comprimento e a temperatura do desafio térmico, afetam a potência observada dos compostos. Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso.E precauções, como seguir as diretrizes institucionais de segurança, devem ser sempre tomadas durante a realização desse procedimento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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