Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Авторы признают, поддержку инфраструктуры от науки для жизни лабораторных и Каролинского института. Авторы также признают ввода и обсуждений с Michaela Vallin, Магдалена Otrocka и Томас Lundbäck.

1. Заполнение ячеек
Примечание: Общий обзор рабочего процесса см. Подробный перечень материалов и реагентов доступны в Таблице материалов.
<ol><li>До заполнения ячеек, сверлить отверстия сверлом стандартной в рамках черного 384-ну изображе?...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Как обсуждалось в разделе результаты, существует несколько ключевых шагов к процедуре. Во-первых важно определить реагент сродство высокого качества. Мы рекомендуем, скрининг небольшую библиотеку антител для каждой требуемой цели. После того, как был выбран основное антитело, также ва...

При разработке новых лекарств или химические датчики, важно пару наблюдаемых Фармакологический эффект или функциональной индикации измерений целевой размещение или участия в живых клеток в1,2,3. Эти данные необходимы для обеспечения что малые молекулы фактически достигает желаемой цели и проверки биологических гипотеза позади белка целевого отбора4,5. Кроме того во время разработки лекарств, модель системы возрастающей сложности используются для выбора и подтвердить свинца соединения до клинических испытаний. Чтобы подтвердить перевод биологии через эти доклинические систем, методы для отслеживания наркотиков целевых участия и сопровождающие биологии на протяжении всего этого процесса развития являются критическими.
Наркотики целевых участия традиционно сложной для мониторинга в живых клеток с unfunctionalized малых молекул и белков, особенно на уровне одной ячейки с пространственным разрешением6,7. Один из последних методов наблюдать взаимодействие между неизмененной наркотиков и белков в живых клеток является пробирного сотовой тепловой сдвиг (CETSA), в котором лиганд индуцированной стабилизации родной белка в ответ на вызов тепла является количественных8, 9,10. Это достигается путем количественной оценки оставшихся растворимого белка после воздействия тепла вызов. В первоначальное раскрытие CETSA Западная помарка была использована для обнаружения. Чтобы включить скрининг кампаний и ударил сортировка больших составных коллекций, усилия увеличить пропускную способность CETSA экспериментов привели к разработке нескольких однородных, основанный на Гонав анализов10,11. Однако одно ограничение с помощью этих методов является, что они в настоящее время лучше всего подходят для соединения лечения в клеточных суспензий и обнаружения требует лизис клеток, приводя к потере пространственной информации. CETSA может быть применена экспериментально, либо как лиганд индуцированного сдвига в тепловой агрегат температуры (общT) на одну концентрацию малые молекулы или лигандом концентрации, необходимой для стабилизации белка в одной температуры. Последняя называется изотермический дозы ответ отпечатки пальцев (ITDRF) для обозначения зависимость этих измерений на конкретных экспериментальных условиях.
Цель настоящего Протокола заключается в измерения поражения цели с помощью CETSA в адэрентных клеток immunofluorescent обнаружения антител (если) с высоким содержанием микроскопии12. Эта процедура расширяет оригинальный CETSA платформа для одноклеточных количественного определения целевых участия с сохранением субцеллюлярные локализации. В частности в отличие от многих предыдущих докладах, в этой процедуре составные лечение проводится в живых адэрентных клеток без поверхности отряд или стирки перед проблемой тепла, таким образом, сохраняя равновесие созданной привязки, мы стремимся, чтобы измерить13. В настоящее время метод проверяется на один целевой белок p38α (MAPK14) в несколько ячеек, строк, и мы надеемся, что путем обмена этой процедуры метод может быть применен широко по всей плавильной протеома. Мы ожидаем, что этот протокол может быть адаптирована в конвейере развития наркотиков от скрининга, хит классифицирование посредством мониторинга целевых участия в естественных условиях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating взаимодействие малых молекул с их предполагаемой белка цели имеет решающее значение для разработки лекарств, целевые проверки и проверки химических зонд. Методы, позволяющие оценить это явление без изменения целевого белка или малые молекулы особенно ценный, хотя технически сложным. Assay сотовой тепловой сдвига (CETSA) является одним из способов для отслеживания целевых участия в живых клетках. Здесь мы описываем адаптация оригинальной CETSA протокол, который позволяет для высокой пропускной способностью измерений при сохранении субцеллюлярные локализации на уровне отдельной ячейки. Мы считаем, что этот протокол предлагает важные успехи в приложение CETSA для углубленного характеристику соединения целевого взаимодействия, особенно в гетерогенной популяции клеток.

Протокол, изложенные на рисунке 1 описывает основной рабочий процесс для запуска CETSA анализов на адэрентных клеток с выявления оставшихся растворимого белка с высоким содержание изображений. Этот рабочий процесс может быть легко адаптирована для всех...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Измерения поражения цели наркотиков являются центральным элементом разработки эффективных лекарств и химических зонд проверки. Здесь мы подробно протокол для измерения наркотиков целевых участия, используя высокое содержание изображений в Гонав совместимых адаптация сотовых тепловой сдвиг анализа (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в химической биологии и обнаружения наркотиков. Например, связывается ли ваше соединение с целевым белком? Основными преимуществами этой техники являются то, что нет необходимости отсоединения адептов клеток.А пространственную локализацию можно определить с помощью изображений. Хотя мы применили этот метод в клеточных линиях, можно также применить этот метод к другим клеточным системам, таким как первичные культуры и кокультуры. Перед посевом клеток, место черный 384-хорошо изображений анализ пластин в ткани культуры капот, и покрыть пластины с алюминиевой фольгой, прежде чем использовать стандартную дрель, чтобы сделать три 3,5-миллиметрового диаметра отверстия на обоих концах каждой пластины.Когда пластины будут готовы, используйте асептический метод для мытья культуры клеток A-431 с 5 до 10 миллилитров PBS. И инкубировать клетки с двумя миллилитров трипсина при 37 градусов по Цельсию, пока клетки отсоединиться. После подсчета, разбавить клетки до 5 раз от 10 до 4-го клетки на миллилитр в среде культуры, и семена 40 микролитров клеток к каждому хорошо каждой пластины анализа.Аккуратно встряхивая каждую пластину из стороны в сторону после посева, чтобы обеспечить однородное распределение клеток по днищам хорошо. Чтобы свести к минимуму эффекты края пластины, позвольте клеткам осесть в нижней части анализных пластин в течение 20 минут при комнатной температуре в задней части капота ламинарного потока, прежде чем поместить пластины в специальной увлажненной камере в течение двух-трех дней при температуре 37 градусов по Цельсию и 5%углекислом газе. В день эксперимента используйте шайбу пластины, чтобы аспирировать среду из каждой хорошо.И добавить 30 микролитров соединения интереса при соответствующей экспериментальной концентрации к соответствующим экспериментальным скважинам. Печать соединения обработанные анализные пластины с дышащий пластины уплотнения. И верните пластины в инкубатор клеточной культуры на 30 минут.Чтобы подвергнуть клетки тепловой проблеме, сначала установите водяную баню до соответствующей экспериментальной температуры и поместите в ванну распечатанные манекены, содержащие тот же объем среды на а также анализную пластину, а также термоотесательный термометр для мониторинга температуры в колодцах. Когда соответствующая экспериментальная температура была достигнута, удалить дышащий уплотнение с каждой пластины анализа и запечатать пластины с жесткой клей алюминиевой фольги, чтобы убедиться, что нет утечки воды в скважины во время их последующего нагрева в водяной бане. Обеспечение безопасности просверленных отверстий в раме пластины.Поместите анализные пластины и новую фиктивную тарелку в водяную баню, с дном пластин под углом к поверхности воды, чтобы заставить любой оставшийся воздух из-под пластин, и начать мониторинг температуры нового манекена пластины. Равномерное нагревание пластины имеет решающее значение для анализа производительности. Позаботьтесь, чтобы поместить тарелку в водяной бане так, что Есть нет пузырьков воздуха в ловушке под.Через три минуты сразу охладим тарелки во второй водяной бане комнатной температурной воды за пять минут до их анализа. Чтобы изображение клеток, сначала добавить 10 микролитров 16%paraformaldehyde непосредственно в анализ пластин для 20-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце периода фиксации, мыть клетки с 300 микролитров PBS на шайбу пластины, и добавить 20 микролитров 0,1%NP40 за 10-минутную инкубацию при комнатной температуре.В конце инкубации, мыть клетки, как попродемонстрировано. И блокировать клетки с 15 микролитров 1%бычьего альбумин сыворотки, или BSA, в течение одного часа при комнатной температуре. Далее используйте шайбу пластины для аспирации блокирующей сыворотки и добавьте 10 микролитров первичного антитела, представляющих интерес для соответствующих скважин для часовой инкубации при комнатной температуре.В конце инкубации, мыть каждый колодец с 300 микролитров PBS, и этикетки клеток с 10 микролитров соответствующих вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре защищены от света. Для ядерного окрашивания клеток добавьте 10 микролитров соответствующего ядерного красителя к каждому колодец в течение 10 минут при комнатной температуре. И мыть клетки в PBS, как попродемонстрировано.Этикетка клеток с 10 микролитров клеточной маски на колодец в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем последняя стирка с PBS. Затем обойтись 60 микролитров свежего PBS для каждой хорошо, и печать пластин с алюминиевой фольгой до визуализации.Чтобы изображение клеток, захватить четыре изображения на колодец на высоком содержании imager с помощью соответствующих флуоресцентных каналов под 10-раз цель с помощью автоматизированного лазерного автофокуса и применять binning во время приобретения. Затем храните изображения в качестве 16-битных серых файлов dot-tiff вместе с метаданными. Распознавание антител не должно нарушаться конформациальными изменениями в целевом белке, которые могут быть вызваны связыванием лигандов.Например, BIRB796 имеет длительный показатель, и количественная оценка целевого взаимодействия возможна только путем применения шага поиска антигена. Этот репрезентативный эксперимент по кривой тепловой агрегации для клеток, обработанных положительными и отрицательными контрольным соединениями, иллюстрирует типичные диапазоны стабилизации белка после обработки клеток соединениями при различных температурах. Здесь показан типичный изотермальный эксперимент по отпечаткам пальцев на дозу, чтобы продемонстрировать репрезентативные диапазоны стабилизации белка в ответ на различные дозы экспериментального соединения.Применение изотермальных тепловых проблем для соединения скрининга для выявления новых связующих целевых белков позволяет анализ большого количества соединений в одной концентрации в одно время, прежде чем изотермальная доза ответ дактилоскопии хитов для подтверждения стабилизации целевого белка. При попытке этой процедуры, важно помнить, что точные экспериментальные условия, такие как длина и температура тепла вызов воздействия наблюдаемой потенции соединений. Не забывайте, что работа с параформалдегидом может быть чрезвычайно опасной.И меры предосторожности, такие как следовать институциональным руководящим принципам безопасности, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Определение содержания гликогена в цианобактериях

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Высокая пропускная способность, абсолютное определение содержания выбранной белка на уровнях тканей, с использованием количественных Dot блот анализ (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Спектрофотометрические определение содержания Phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Прямое измерение целевого взаимодействия KDM1A с использованием иммуноанализов на основе хемозондов

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Обнаружение всего реактивного кислорода видов в клеток-приверженцев 2',7'-Dichlorodihydroflucescein Диацетат окрашивания

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в живых растительных клетках

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...