Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
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Los autores reconocen el apoyo de infraestructura de ciencia para laboratorio de la vida y el Karolinska Institutet. Los autores también reconocen entrada y discusiones con Michaela Vallin, Magdalena Otrocka y Thomas Lundbäck.

1. siembra de células
Nota: Para una visión general del flujo de trabajo vea la figura 1. Una lista detallada de materiales y reactivos están disponibles en la Tabla de materiales.
<ol><li>Antes de la siembra de las células, perforar con un taladro estándar en el marco de placas de ensayo imágenes de 384-pozo negro para evitar burbujas de aire que está atrapadas debajo de la placa más adelante durante la etapa de calefac...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Como comentamos en la sección de resultados, hay varias medidas claves para el procedimiento. En primer lugar, es importante identificar un reactivo de alta calidad afinidad. Recomendamos una pequeña biblioteca de anticuerpos para cada objetivo deseado de detección. Después de que un anticuerpo primario se ha seleccionado, también es importante validar el sistema para un número de sitios de Unión diferentes de la meta de proteína si es necesario. Counter-detección de compuestos que interfieren con la señal de e...

En el desarrollo de nuevos fármacos o sondas químicas es esencial par el efecto farmacológico observado o lectura funcional a las medidas de ocupación del destino o participación en células vivas1,2,3. Estos datos son necesarios para que la molécula pequeña de hecho llegue a su destino deseado y validar la hipótesis biológica detrás de proteína objetivo selección4,5. Además, durante el desarrollo de drogas, modelo de los sistemas de complejidad creciente se utiliza para seleccionar y corroborar un plomo compuesto antes de los ensayos clínicos. Para confirmar la traducción de la biología a través de estos sistemas preclínicos, métodos de rastreo contrato de drogas blanco y acompañando la biología a lo largo de este proceso de desarrollo son fundamentales.
Compromiso de Diana farmacológica ha sido tradicionalmente difícil de controlar en células vivas con unfunctionalized pequeñas moléculas y proteínas, especialmente a nivel unicelular con resolución espacial6,7. Sin modificar de un método reciente para observar la interacción entre fármacos y proteínas en células vivas es el ensayo celular cambio térmico (CETSA) en el cual estabilización inducida por ligando de una proteína nativa en respuesta a un desafío de calor es cuantificada8, 9,10. Esto se logra mediante la cuantificación de proteína soluble restante después de la exposición a un desafío de calor. En la divulgación inicial de CETSA, mancha blanca /negra occidental fue utilizada para la detección. Para activar campañas de detección y clasificación de colecciones compuestos más grandes del golpe, los esfuerzos para aumentar el rendimiento de CETSA experimentos han llevado al desarrollo de varios ensayos homogéneos, basado en una microplaca10,11. Sin embargo, una limitación con estos métodos es que ellos son actualmente más adecuados para tratamiento compuesto en suspensiones celulares y lisis celular, llevando a la pérdida de la información espacial requiere de la detección. CETSA puede ser aplicado experimentalmente como un cambio inducido por ligando de temperatura térmica agregación (Tagg) en una concentración única de la molécula pequeña o la concentración del ligand necesaria para estabilizar la proteína en una sola temperatura. Este último se denomina huellas dactilares isotermo dosis respuesta (ITDRF) para indicar la dependencia de estas mediciones en las condiciones experimentales específicas.
El objetivo de este protocolo es medir el compromiso de destino mediante CETSA en células adherentes detección inmunofluorescente del anticuerpo de (IF) con microscopía de alto contenido12. Este procedimiento extiende la plataforma original de CETSA para permitir la cuantificación unicelular del contrato de blanco con la conservación de la localización subcelular. En particular, a diferencia de muchos informes anteriores, en este procedimiento de tratamiento compuesto se realiza en células vivas adherentes sin desprendimiento superficial o lavado antes del reto de calor, preservando así el equilibrio establecido enlace que pretendemos medir13. Actualmente, el método está validado para un destino proteína p38α (MAPK14) en varias líneas celulares, y esperamos que al compartir este procedimiento la técnica se puede aplicar ampliamente a través del fusión proteoma. Esperamos que este protocolo puede ser adaptado a lo largo de la tubería del desarrollo drogas de proyección, golpe clasificación a través de seguimiento de objetivo participación en vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Cuantificación de la interacción de moléculas pequeñas con su blanco prevista de la proteína es fundamental para desarrollo de fármacos, validación de destino y validación química de la sonda. Métodos que miden este fenómeno sin modificación del destino de la proteína o molécula pequeña son particularmente valiosos aunque técnicamente difícil. El ensayo celular cambio térmico (CETSA) es una técnica para supervisar el contrato de blanco en las células vivas. Aquí, describimos una adaptación del protocolo original de CETSA, que permite mediciones de alto rendimiento manteniendo la localización subcelular en el nivel unicelular. Creemos que este protocolo ofrece importantes avances para la aplicación de CETSA profunda caracterización del compuesto objetivo interacción, especialmente en poblaciones heterogéneas de células.

El protocolo descrito en la figura 1 describe el flujo de trabajo básico para ejecución de ensayos CETSA en células adherentes con detección de la proteína soluble restantes por proyección de imagen de contenido alto. Este flujo de trabajo puede ser fácilmente adaptada a todas las etapas de desarrollo de ensayos modificando el diseño de la placa de los reactivos o compuestos14. Detallamos los resultados esperados para varias pr...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes

Medidas del contrato de blanco de la droga son fundamentales para desarrollo de fármacos eficaces y validación química de la sonda. Aquí detallamos un protocolo para la medición de compromiso de Diana farmacológica con alta proyección de imagen contenido en una adaptación de microplacas compatibles del ensayo celular cambio térmico (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología química y descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, ¿su compuesto se une a la proteína objetivo? Las principales ventajas de esta técnica son que no hay ningún requisito de desprendimiento de las células adherentes.Y la localización espacial se puede determinar mediante imágenes. Aunque hemos aplicado este método en líneas celulares, también es posible aplicar este método a otros sistemas celulares como cultivos primarios y coculturas. Antes de sembrar las células, coloque placas de ensayo de imágenes negras de 384 biens en una campana de cultivo de tejido y cubra las placas con papel de aluminio antes de usar un taladro estándar para hacer tres agujeros de 3,5 milímetros de diámetro en ambos extremos de cada placa.Cuando las placas estén listas, utilice una técnica aséptica para lavar un cultivo celular A-431 con 5 a 10 mililitros de PBS. E incubar las células con dos mililitros de tripsina a 37 grados celsius hasta que las células se desprendan. Después de contar, diluir las células a 5 veces 10 a las 4a células por mililitro en medio de cultivo, y sembrar 40 microlitros de células a cada pozo de cada placa de ensayo.Agitar suavemente cada placa de lado a lado después de la siembra para asegurar una distribución homogénea de las células a través de los fondos de los pozos. Para minimizar los efectos del borde de la placa, permita que las células se asienten en la parte inferior de las placas de ensayo durante 20 minutos a temperatura ambiente en la parte posterior de la campana de flujo laminar antes de colocar las placas en una cámara humidificada personalizada durante dos a tres días a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. El día del experimento, utilice una arandela de placas para aspirar el medio de cada pozo.Y añadir 30 microlitros del compuesto de interés en la concentración experimental adecuada a los pozos experimentales apropiados. Selle las placas de ensayo tratadas con compuestos con sellos de placa transpirables. Y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos.Para exponer las células a un desafío de calor, primero coloque el baño de agua a la temperatura experimental adecuada, y coloque una placa ficticia sin sellar que contenga el mismo volumen de medio por bien como la placa de ensayo en el baño, junto con un termómetro termopar para monitorear la temperatura dentro de los pozos. Cuando se haya alcanzado la temperatura experimental adecuada, retire el sello transpirable de cada placa de ensayo y vuelva a sellar las placas con una lámina de aluminio adhesiva apretada para asegurarse de que no haya fugas de agua en los pozos durante su calentamiento posterior en el baño de agua. Mantener los agujeros perforados dentro del marco de la placa accesibles.Coloque las placas de ensayo y una nueva placa ficticia en el baño de agua, con la parte inferior de las placas en ángulo hacia la superficie del agua para forzar cualquier aire restante desde debajo de las placas, y comience a monitorear la temperatura de la nueva placa ficticia. Un calentamiento uniforme de la placa es fundamental para el rendimiento del ensayo. Tenga cuidado de colocar la placa en el baño de agua de tal manera que no haya burbujas de aire atrapadas debajo.Después de tres minutos, enfríe inmediatamente las placas en un segundo baño de agua de agua a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de su análisis. Para tomar imágenes de las células, primero agregue 10 microlitros de 16%paraformaldehído directamente a las placas de ensayo para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final del período de fijación, lave las células con 300 microlitros de PBS en la arandela de placas, y agregue 20 microlitros de 0.1%NP40 para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave las células como se ha demostrado. Y bloquear las células con 15 microlitros de 1%albúmina sérica bovina, o BSA, durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, utilice la arandela de placas para aspirar el suero de bloqueo, y agregue 10 microlitros del anticuerpo primario de interés a los pozos apropiados para una incubación de una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS y etiquete las células con 10 microlitros del anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente protegidas de la luz. Para la tinción nuclear de las células, agregue 10 microlitros de un tinte nuclear apropiado a cada pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Y lavar las células en PBS como se demuestra.Etiquete las células con 10 microlitros de máscara celular por pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de un último lavado con PBS. A continuación, dispensar 60 microlitros de PBS fresco a cada pozo, y sellar las placas con papel de aluminio hasta que seinen.Para crear imágenes de las celdas, capture cuatro imágenes por pozo en un imager de alto contenido utilizando los canales fluorescentes apropiados bajo el objetivo de 10 veces utilizando el enfoque automático láser automatizado y aplique binning durante la adquisición. A continuación, almacene las imágenes como archivos punto-tiff en escala de grises de 16 bits junto con los metadatos. El reconocimiento de anticuerpos no debe ser interrumpido por cambios conformales en la proteína diana que pueden ser inducidos por la unión de ligandos.Por ejemplo, BIRB796 tiene una tasa de apagado larga y la cuantificación de la interacción de destino solo es posible aplicando un paso de recuperación de antígeno. Este experimento representativo de curva de agregación térmica para células tratadas con compuestos de control positivos y negativos ilustra los rangos típicos de estabilización de proteínas después del tratamiento de las células con los compuestos a varias temperaturas. Aquí se muestra un experimento típico de huellas dactilares de dosis-respuesta isotérmica para demostrar rangos representativos de estabilización de proteínas en respuesta a diferentes dosis de compuesto experimental.La aplicación de desafíos de calor isotérmico para el cribado compuesto para identificar nuevos aglutinantes de la proteína diana permite el análisis de un gran número de compuestos a una sola concentración a la vez, antes de la huella digital de dosis-respuesta isotérmica de los impactos para confirmar la estabilización de la proteína objetivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones experimentales exactas, como la longitud y la temperatura del desafío de calor afectan la potencia observada de los compuestos. No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso.Y siempre se deben tomar precauciones, como seguir las pautas de seguridad institucional, al realizar este procedimiento.

Research

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