Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Författarna erkänner infrastrukturstöd från Science for Life Laboratory och Karolinska Institutet. Författarna också erkänna input och diskussioner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka och Thomas Lundbäck.

1. sådd av celler
Obs: Se figur 1för en allmän översikt över arbetsflödet. En detaljerad lista över material och reagenser finns i Tabell för material.
<ol><li>Före sådd av cellerna, borra hål med en standardborr inom ramen för svart 384-väl tänkbar assay plattor att undvika luftbubblor att bli instängd under plattan senare under värme steg. Att undvika plast partiklar in brunnarna under detta steg och för att u...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Som diskuteras i resultatavsnittet, finns det flera viktiga steg till förfarandet. Först, är det viktigt att identifiera en hög affinitet reagens. Vi rekommenderar screening ett litet bibliotek av antikroppar för varje önskat mål. Efter en primär antikropp har valts, är det också viktigt att validera systemet för ett antal olika bindande platser av protein målet om lämpliga. Kampen mot screening för föreningar som stör signalen assay som visas i figur 2 c genom att utelämna ...

Vid utveckling av nya läkemedel eller kemiska sonder är det viktigt att den observerade farmakologiska effekten eller funktionella avläsning till mätningar av målet beläggning eller engagemang i levande celler1,2,3. Dessa uppgifter är nödvändiga både för att säkerställa att den lilla molekylen i själva verket når sitt önskade mål och för att validera biologiska hypotesen bakom protein mål urval4,5. Dessutom under läkemedelsutveckling används modellsystem av ökande komplexitet för att välja och bekräfta ett lead förening innan kliniska prövningar. För att bekräfta översättning av biologi över dessa prekliniska system, är metoder för spårning drog-mål engagemang och medföljande biologi i hela denna utvecklingsprocess kritisk.
Läkemedel-mål engagemang har traditionellt varit utmanande att övervaka i levande celler med unfunctionalized små molekyler och proteiner, särskilt på enskild cell nivå med rumslig upplösning6,7. En nyligen metod att observera samspelet mellan omodifierade droger och proteiner i levande celler är den cellulära termiska Skift analys (CETSA) där ligand-inducerad stabilisering av en infödd protein som svar på en värme utmaning är kvantifierade8, 9,10. Detta åstadkoms genom att kvantifiera återstående lösligt protein efter exponering för en värme utmaning. I inledande utlämnande av CETSA användes western blot för detektion. För att aktivera screening kampanjer och slå triaging av större sammansatta samlingar, har insatser för att öka genomströmningen av CETSA experiment lett till utvecklingen av flera homogen, mikroplattbaserade analyser10,11. En begränsning med dessa metoder är dock att de är för närvarande bäst lämpade till sammansatta behandling i cellsuspensioner och upptäckt kräver cellys, leder till förlust av rumslig information. CETSA kan vara tillämpas experimentellt antingen som en ligand-inducerad Skift i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enda koncentration av små molekylen eller ligand koncentrationen nödvändigt att stabilisera proteinet vid en inre temperatur. Den senare kallas isotermiska dos svar fingeravtryck (ITDRF) för att beteckna beroendet av dessa mätningar på de särskilda villkor som experimentell.
Målet med detta protokoll är att mäta målet engagemang med CETSA i vidhäftande celler genom Immunofluorescerande (om) påvisande av antikroppar med hög-innehåll mikroskopi12. Proceduren omfattar den ursprungliga CETSA plattformen som möjliggör encelliga kvantifiering av mål engagemang med bevarande av subcellulär lokalisering. Särskilt, till skillnad från många tidigare rapporter, i den här proceduren sammansatta behandlingen utförs i levande vidhäftande celler utan ytan avlossning eller tvättning innan värmen utmaningen, därmed bevara etablerade bindande equilibriumen siktar vi på att mäta13. För närvarande, metoden är validerad för ett mål protein p38α (MAPK14) i flera cellinjer, och vi hoppas att genom att dela denna procedur tekniken kan tillämpas i stort sett hela det smältande proteomet. Vi räknar med att detta protokoll kan anpassas under hela rörledningen drog utveckling från screening, hit triaging genom övervakning av mål engagemang i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Quantitating samverkan mellan små molekyler och deras avsedda protein mål är avgörande för läkemedelsutveckling, target validering och kemiska sonden validering. Metoder som mäter detta fenomen utan modifiering av protein målet eller liten molekyl är särskilt värdefulla men tekniskt utmanande. Cellulära termisk Skift analysen (CETSA) är en teknik för att övervaka mål engagemang i levande celler. Här beskriver vi en anpassning av det ursprungliga CETSA-protokollet, som möjliggör hög genomströmning mätningar bibehållen subcellulär lokalisering på enstaka cellnivå. Vi tror detta protokoll erbjuder viktiga framsteg att tillämpningen av CETSA för djupgående karakterisering av förening-target interaktion, särskilt i heterogena populationer av celler.

Protokollet beskrivs i figur 1 beskriver det grundläggande arbetsflödet för att köra CETSA analyser på vidhäftande celler med påvisande av återstående lösligt protein av högt innehåll imaging. Arbetsflödet kan enkelt anpassas till alla stadier av assay utveckling genom att ändra layouten plattan av reagens eller föreningar14. Vi detalj förväntade resultat för flera förväntade användningsfall nedan.
<p class="jo...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Mätningar av drogen mål engagemang är centralt för utveckling av effektiva läkemedel och kemiska sonden validering. Här, detalj vi ett protokoll för mätning av drogen-mål engagemang med hög innehåll imaging i en mikroplattan-kompatibel anpassning av cellulära termisk Skift analysen (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i kemisk biologi och läkemedelsupptäckt. Såsom, gör din förening binda till målet proteinet? De största fördelarna med denna teknik är att det inte finns något krav på avlossning av de vidhäftande cellerna.Och rumslig lokalisering kan bestämmas genom avbildning. Även om vi har tillämpat denna metod i cellinjer, är det också möjligt att tillämpa denna metod på andra cellsystem som primära kulturer och kokulturer. Innan sådd cellerna, placera svart 384-brunns avbildning analysplattor i en vävnad kultur huva, och täcka plattorna med aluminiumfolie innan du använder en standard borr för att göra tre 3,5-millimeters hål på båda ändarna av varje platta.När plattorna är klara, använd aseptisk teknik för att tvätta en A-431 cellodling med 5 till 10 milliliter PBS. Och inkubera cellerna med två milliliter trypsin vid 37 grader Celsius tills cellerna lossnar. Efter räkning, späd cellerna till 5 gånger 10 till 4: e celler per milliliter i odlingsmedium, och utsäde 40 mikroliter celler till varje brunn av varje analysplatta.Försiktigt skaka varje platta från sida till sida efter sådd för att säkerställa en homogen fördelning av cellerna över brunnen bottnar. För att minimera plattan kant effekter, låt cellerna att bosätta sig i botten av analysen plattorna i 20 minuter vid rumstemperatur i baksidan av laminär flöde huva innan du placerar plattorna i en anpassad befuktade kammare för två till tre dagar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. På dagen för experimentet, använd en tallriksbricka för att aspirera mediet från varje brunn.Och tillsätt 30 mikroliter av föreningen av intresse vid lämplig experimentell koncentration till lämpliga experimentella brunnar. Täta de sammansatt behandlade analysplattorna med ventilerande platttätningar. Och returnera plattorna till cellkulturinkubatorn i 30 minuter.För att utsätta cellerna för en värmeutmaning, ställ först in vattenbadet på lämplig experimentell temperatur, och placera en oförseglad dummyplatta som innehåller samma volym medium per samt analysplattan i badet, tillsammans med en termoelementtermometer för övervakning av temperaturen i brunnarna. När lämplig experimentell temperatur har uppnåtts, ta bort den ventilerande tätningen från varje analysplatta och återförslut plattorna med en stram självhäftande aluminiumfolie för att säkerställa att inget vatten läcker ut i brunnarna under deras efterföljande uppvärmning i vattenbadet. Hålla de borrade hålen inom plattan ram åtkomlig.Placera analysplattorna och en ny dummyplatta i vattenbadet, med plattornas bottnar vinklade mot vattenytan för att tvinga ut eventuell kvarvarande luft under plattorna, och börja övervaka temperaturen på den nya provdockan. En jämn uppvärmning av plattan är avgörande för analysprestanda. Var noga med att placera plattan i vattenbadet så att det inte finns några luftbubblor fångade under.Efter tre minuter, omedelbart kyla plattorna i ett andra vattenbad av rumstemperatur vatten i fem minuter innan deras analys. För att avbilda cellerna, tillsätt först 10 mikroliter av 16%paraformaldehyd direkt till analysplattorna för en 20-minuters inkubation vid rumstemperatur. Vid slutet av fixeringsperioden tvättar du cellerna med 300 mikroliter PBS på plåtbrickan, och tillsätt 20 mikroliter på 0,1%NP40 för en 10-minuters inkubation vid rumstemperatur.Vid slutet av inkubationen tvättar du cellerna som det visats. Och blockera cellerna med 15 mikroliter av 1%bovint serumalbumin, eller BSA, i en timme i rumstemperatur. Därefter använder plattan bricka för att aspirera den blockerande serum, och tillsätt 10 mikroliter av den primära antikroppen av intresse för lämpliga brunnar för en timmes inkubation vid rumstemperatur.Vid slutet av inkubationen, tvätta varje brunn med 300 mikroliter pbs, och märk cellerna med 10 mikroliter av lämplig sekundär antikropp under en timme vid rumstemperatur skyddad från ljus. För nukleär färgning av cellerna, tillsätt 10 mikroliter av en lämplig kärnämne till varje brunn i 10 minuter vid rumstemperatur. Och tvätta cellerna i PBS som visats.Märk cellerna med 10 mikroliter cellmask per brunn i 30 minuter i rumstemperatur. Följt av en sista tvätt med PBS. Sedan dispensera 60 mikroliter färska PBS till varje brunn, och försegla plattorna med aluminiumfolie tills bildtagning.För att avbilda cellerna, ta fyra bilder per brunn på en hög innehållsbaserad imager med hjälp av lämpliga lysrörskanaler under 10-gånger objektivet med hjälp av automatiserad laser autofokus och tillämpa binning till under förvärvet. Sedan lagra bilderna som 16-bitars gråskala dot-tiff filer tillsammans med metadata. Antikroppsigenkänning bör inte störas av konformationella förändringar i målproteinet som kan framkallas genom ligandbindning.Till exempel har BIRB796 en lång off rate, och kvantifiering av målet engagemang är endast möjligt genom att tillämpa ett antigen hämtning steg. Denna representativa termisk aggregering kurvan experiment för celler som behandlats med positiva och negativa kontroll föreningar illustrerar typiska protein stabiliseringsintervall efter behandling av cellerna med föreningarna vid olika temperaturer. Här en typisk isotermisk dos-respons fingeravtryck experiment visas för att visa representativa intervall av protein stabilisering som svar på olika doser av experimentell förening.Tillämpningen av isotermisk värme utmaningar för sammansattscreening för att identifiera nya bindemedel av målproteinet möjliggör analys av ett stort antal föreningar vid en enda koncentration på en gång, innan isotermiska dos-svar fingeravtryck av träffar för att bekräfta mål proteinstabilisering. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att de exakta experimentella förhållanden, såsom längd och temperatur av värmen utmaning påverkar den observerade styrkan av föreningarna. Glöm inte att arbeta med paraformaldehyd kan vara extremt farligt.Och försiktighetsåtgärder, såsom att följa institutionella säkerhetsriktlinjer, bör alltid vidtas när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkt mätning av KDM1A mål engagemang med Chemoprobe-baserade Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Detektion av total reaktiva syrearter i vidhäftande celler med 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Färgning

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Uppskattning av växtbiomassa Ligninhalt med tioglykolsyra (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonance Energy Transfer Mätningar i levande växtceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...