Name: using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Yazarlar için hayat laboratuar ve Karolinska Institutet bilim altyapı destek kabul etmiş oluyorsunuz. Yazarlar ayrıca giriş ve Michaela Vallin, Magdalena Otrocka ve Thomas Lundbäck ile sohbet edersiniz.

1. tohum hücrelerinin
Not: İş akışı genel bakış için bkz: Şekil 1. Tablo malzemelerimalzemeler ve Kimyasalları ait ayrıntılı bir liste mevcuttur.
<ol><li>Hücreleri tohum önce siyah 384-şey görüntüleme tahlil tabak tabak altında daha sonra Isıtma adımı sırasında yakalanan hava kabarcıkları önlemek için çerçeve içinde bir standart matkap ile delik. Plastik parçacıklar kuyuları bu adımı sıras?...

<ol>
	<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R&amp;D+productivity+at+AstraZeneca.">Impact of a five-dimensional framework on R&amp;D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li><li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research.">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).</li><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+flow+of+medicines+be+improved?+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival.">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li><li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+validation+using+chemical+probes.">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li><li>Sch&#252;rmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells.">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li><li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET.">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091 (2015).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Thermal+Shift+Assay:+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies.">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil.">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040 (2016).</li><li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells.">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li><li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundb&#228;ck, T. E. a. r. l. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+(CETSA).">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li><li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery.">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li></ol>

Sonuçları bölümünde anlatıldığı gibi birkaç anahtar adım prosedürü vardır. İlk olarak, bir yüksek kaliteli benzeşme reaktif belirlemek önemlidir. Antikorlar istenen her hedef için küçük bir kütüphane eleme tavsiye ediyoruz. Birincil bir antikor seçildikten sonra da uygunsa, protein hedef farklı bağlama siteler için sistem doğrulamak önemlidir. Karşı tarama için tahlil sinyal ile Şekil 2C içinde ısı meydan ihmal olarak gösterildiği gibi müdahale bileşi...

Yeni ilaç veya kimyasal probları gözlenen farmakolojik etkisi veya fonksiyonel okuma hedef doluluk veya nişan canlı hücreleri1,2,3' te ölçülerini çift esastır geliştirirken. Bu veriler küçük molekül aslında istenen hedefine ulaştığından emin olmak için ve protein hedef seçimi4,5arkasında biyolojik hipotez doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, ilaç geliştirme sırasında artan karmaşıklık model sistemleri seçin ve bir ipucu klinik öncesi bileşik teyit için kullanılır. Bu preklinik sistemleri arasında çeviri biyoloji onaylamak için uyuşturucu-hedef nişan izleme ve biyoloji bu gelişim süreci boyunca eşlik eden kritik yöntemlerdir.
Uyuşturucu-hedef nişan geleneksel unfunctionalized küçük moleküller ve protein, uzaysal çözünürlük6,7ile tek hücre düzeyinde özellikle canlı hücrelerdeki izlemek için zor olmuştur. Bir son yöntem arasındaki etkileşim gözlemlemek için uyuşturucu değiştirilmemiş ve canlı hücrelerdeki protein olduğunu ligand kaynaklı istikrar yanıt bir ısı meydan okuma olarak yerli protein quantified8olduğu hücresel termal kayması tahlil (CETSA), 9,10. Bu süre bir ısı meydan okuma maruz kalan çözünür protein miktarının tarafından gerçekleştirilir. CETSA ilk açıklanması Batı leke tespiti için kullanıldı. Tarama kampanyalarını etkinleştirmek ve daha büyük bileşik koleksiyonları önceliklendirmek vurmak için çabaları CETSA deneyler iş çıkarma yeteneğini artırmak için birkaç homojen, mikroplaka tabanlı deneyleri10,11gelişmesine yol var. Ancak, bir bu yöntemler ile Şu anda en iyi hücre süspansiyonlar bileşik tedavi uygundur ve hücre lizis, mekansal bilgi kaybına yol önde gelen algılama gerektirir kısıtlamadır. CETSA-ebilmek var olmak deneysel olarak termal toplama sıcaklık (Tagg) ligand kaynaklı vardiyada küçük molekül tek bir konsantrasyon veya ligand konsantrasyonu protein tek bir ısıda dengelemek gerekli uygulanan. İkinci izotermal doz yanıt parmak bağımlılık belirli deneysel koşullar üzerinde bu ölçümlerin belirtmek için (ITDRF) olarak adlandırılır.
Bu iletişim kuralı CETSA immünfloresan (Eğer) antikor algılama yüksek içerikli mikroskobu12ile yapışık hücreleri kullanarak hedef nişan ölçmek için hedeftir. Bu yordamı hücre altı yerelleştirme korunması ile hedef angajman tek hücreli miktar için izin vermek için orijinal CETSA platform uzanır. Özellikle, önceki raporların çoğu, bu yordamda yüzey dekolmanı veya çamaşır böylece biz13ölçmek amacıyla kurulan bağlama dengeyi koruyarak ısı meydan okuma önce geçmeden canlı yapisan hücrelerde bileşik tedavi yapılır. Şu anda, yöntem bir hedef protein p38α için doğrulanır (MAPK14) içinde birkaç satır hücre ve bu yordamı paylaşarak teknik geniş erime Proteom uygulanabilir olduğunu umuyoruz. Biz bu protokolü tarama ilaç geliştirme boru hattı boyunca adapte edilebilir, aracılığıyla hedef nişan vivo içindeizleme için önceliklendirme vurmak tahmin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>for detaching cells and subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCS CellMask Red stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>H32712</td>
			<td>Cytoplasm stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56741</td>
			<td>for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) - high Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6429</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, breathable plate seal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3345</td>
			<td>for copound incubation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-p38 antibody [E229]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170099</td>
			<td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>736-2044</td>
			<td>imaging plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30127790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable aluminium seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24210-001</td>
			<td>for PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2228820</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1494</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH797804</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>PH797804</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1574</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB203580</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1202</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG 548</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3920</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWJ 67657</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2999</td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Skepinone</td>
			<td>CBCS compound collection</td>
			<td></td>
			<td>p38&#945; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>44244</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>used in antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-431 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATC-CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of compound plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PlateLoc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulk reagent dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Multidrop Combi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated liquid handling</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate washer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Hydrospeed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Thermocouple traceable lab thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High content imager</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells

Küçük moleküller arasındaki etkileşimin amaçlanan protein hedefleri ile quantitating ilaç geliştirme, hedef doğrulama ve kimyasal sonda doğrulama için önemlidir. Bu fenomen protein hedef veya küçük molekül yapılmaksızın tedbir Teknik olarak zor olsa da özellikle değerli yöntemlerdir. Hücresel termal kayması tahlil (CETSA) hedef nişan canlı hücreler içinde izlemek için bir tekniktir. Burada, tek hücre düzeyinde hücre altı yerelleştirme koruyarak yüksek işlem hacmi ölçülerini sağlar orijinal CETSA iletişim kuralı bir uyarlaması açıklayın. Bizce bu protokolü CETSA uygulaması bileşik-hedef etkileşiminde, özellikle hücre türdeş olmayan nüfus derinlemesine karakterizasyonu için önemli gelişmeler sunar.

Şekil 1 ' de özetlenen protokolünü CETSA deneyleri tarafından yüksek içerik görüntüleme kalan çözünür protein tespiti ile yapışık hücreleri üzerinde çalıştırmak için temel iş akışını açıklar. Bu iş akışı bileşikleri veya reaktifler14plaka yerleşimini değiştirerek tüm gelişimin tahlil için kolayca adapte edilebilir. Birkaç beklenen kullanım örnekleri aşağıda için beklenen sonuçlar ayrın...

Watch this Scientific Journal Video about Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells at JoVE.com

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Bu yöntem, kimyasal biyoloji ve ilaç keşfi nde anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Mesela, bileşiğiniz hedef proteine bağlanır mı? Bu tekniğin başlıca avantajları, yapışık hücrelerin ayrılmasına gerek olmamasıdır.Ve mekansal lokalizasyon görüntüleme ile belirlenebilir. Bu yöntemi hücre hatlarında uygulamış olsak da, bu yöntemi birincil kültürler ve kokültürler gibi diğer hücre sistemlerine de uygulamak mümkündür. Hücreleri tohumlamadan önce, bir doku kültürü kaputuna siyah 384 kuyulu görüntüleme test plakaları yerleştirin ve her plakanın her iki ucunda üç adet 3,5 milimetre çapında delik açmak için standart bir matkap kullanmadan önce plakaları alüminyum folyo ile kaplayın.Plakalar hazır olduğunda, 5 ila 10 mililitre PBS ile A-431 hücre kültürünü yıkamak için aseptik tekniği kullanın. Ve hücreler ayrışana kadar hücreleri 37 derecede iki mililitre tripsin ile kuluçkaya yatırın. Sayma sonra, 5 kez 10 kültür orta mililitre başına 4 hücreleri hücreleri seyreltmek ve her bir deneme plakaher bir kuyuya hücrelerin 40 mikrolitre tohum.Yavaşça iyi dipleri arasında hücrelerin homojen bir dağılımını sağlamak için tohumlama sonra yan yana her plaka sallayarak. Plaka kenarı etkilerini en aza indirmek için, hücrelerin 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit iki ila üç gün boyunca özel bir nemlendirilmiş odaya plakaları yerleştirmeden önce laminar akış kaputunun arka oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hakemlik plakaları altında yerleşmek için izin verin. Deney günü, her kuyudan orta aspire etmek için bir tabak yıkama kullanın.Ve uygun deneysel kuyulara uygun deneysel konsantrasyonda 30 mikrolitre lik ilgi bileşiğinde ekleyin. Bileşik işlenmiş istinat plakalarını nefes alabilen plaka mühürleriyle kapatın. Ve plakaları 30 dakika lığına hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.Hücreleri bir ısı sorununa maruz bırakmak için, önce su banyosunu uygun deneysel sıcaklığa ayarlayın ve kuyuların içindeki sıcaklığı izlemek için bir termokupl termometre ile birlikte, her biri orta ve aynı hacimde aynı hacimde bir kalıp plakası içeren mühürsüz bir kukla plakayı banyoya yerleştirin. Uygun deneysel sıcaklığa ulaşıldığında, her bir deney plakasından nefes alabilen mührü çıkarın ve su banyosunda sonraki ısıtma sırasında kuyulara su sızmamasını sağlamak için plakaları sıkı yapışkan alüminyum folyo ile yeniden kapatın. Plaka çerçevesi içinde delinmiş delikleri erişilebilir tutmak.Plakaların altından kalan havayı zorlamak için su yüzeyine doğru açılı plakaların dipleri ile, banyoya yeni bir kukla plaka ve banyo yerleştirin ve yeni kukla plaka sıcaklığını izlemeye başlayın. Plakanın eşit bir şekilde ısıtılması, istinat performansı için çok önemlidir. Altında sıkışmış hiçbir hava kabarcıkları vardır su banyosu nda plaka yerleştirmek için dikkat edin.Üç dakika sonra, hemen kendi analiz önce beş dakika boyunca oda sıcaklığında su ikinci bir su banyosunda plakaları soğutun. Hücreleri görüntülemek için, ilk oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçka için doğrudan deneme plakaları için% 16 paraformaldehit 10 mikrolitre ekleyin. Fiksasyon döneminin sonunda hücreleri plaka yıkayucuüzerinde 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için %0,1 NP40'lık 20 mikrolitre ekleyin.Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi hücreleri yıkayın. Ve oda sıcaklığında bir saat için% 1 sığır serum albumin veya BSA 15 mikrolitre ile hücreleri bloke. Daha sonra, bloke serum aspire için plaka yıkayıcını kullanın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara ilgi birincil antikor 10 mikrolitre ekleyin.Kuluçka sonunda, her kuyuyu 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikordan 10 mikrolitre ile etiketlayın. Hücrelerin nükleer boyama için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her kuyuya uygun bir nükleer boya 10 mikrolitre ekleyin. Ve pbs hücreleri gösterildiği gibi yıkayın.Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her kuyuda 10 mikrolitre hücre maskesi ile etiketleyin. Ardından PBS ile son bir yıkama. Sonra her kuyuya 60 mikrolitre taze PBS dağıtın ve plakaları görüntülemeye kadar alüminyum folyo ile kapatın.Hücreleri görüntülemek için, otomatik lazer otofokus kullanarak 10 kat hedefi altında uygun floresan kanalları kullanarak yüksek içerikli görüntüleyicide her biri için dört görüntü yakalayın ve satın alma sırasında binning uygulayın. Ardından görüntüleri meta verilerle birlikte 16 bit gri tonlama nokta-tiff dosyaları olarak saklayın. Hedef proteinde ligand bağlanması ile indüklenebilecek konformasyonel değişikliklerle antikor tanıma sı bozulmamalıdır.Örneğin, BIRB796 uzun bir kapalı oranı vardır ve hedef nişan quantification sadece bir antijen alma adımı uygulayarak mümkündür. Pozitif ve negatif kontrol bileşikleri ile tedavi hücreler için bu temsili termal toplama eğrisi deneyi çeşitli sıcaklıklarda bileşikler ile hücrelerin tedavisinden sonra tipik protein stabilizasyon aralıkları göstermektedir. Burada tipik bir izomal doz-yanıt parmak izi deneydeneysel bileşik farklı dozlarda yanıt olarak protein stabilizasyonu temsili aralıkları göstermek için gösterilmiştir.Hedef proteinin yeni bağlayıcılarını belirlemek için bileşik tarama için izotermal ısı zorluklarının uygulanması, hedef protein stabilizasyonunu doğrulamak için isabetlerin izotermal doz yanıtı parmak izi öncesinde, tek bir konsantrasyonda çok sayıda bileşiğin analizini sağlar. Bu prosedürü denerken, ısı mücadelesinin uzunluğu ve sıcaklığı gibi tam deneysel koşulların bileşiklerin gözlenen gücünü etkilediğini unutmamak önemlidir. Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.Ve bu prosedürü uygularken kurumsal güvenlik yönergelerine uymak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Cyanobacterium Synechocystis Phycobiliprotein içeriğinde spektrofotometrik tayini

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Chemoprobe tabanlı bağışıklık sistemini kullanarak KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçümü

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Yaşayan Bitki Hücrelerinde Förster Rezonans Enerji Transferi Ölçümleri

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...