Name: a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

Vi takker Hiroshi Kawamoto og Kyoko Masuda for venligst at give OP9/filen DLL1 Cell line. Vi takker Alan B. Hoofring og Erina Z. Han for grafisk assistance. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af US National Cancer Institute (ZIA BC010763) og cancer Moonshot program for Center for celle-baserede terapi på NIC, NIH. Arbejdet blev også støttet af Milstein Family Foundation.

Alle dyreforsøg blev godkendt af det nationale kræft instituts (NIC) Institutionsudvalg for dyrepasning og-anvendelse og udført i overensstemmelse med NIH-retningslinjerne.
1. forberedelse af OP9/filen DLL1 celler til co-Culture med iPSC
<ol><li>Kultur OP9/filen DLL1 celler i OP9 medier (α-minimum essentiel medium [α-MEM] + 20% ikke-varme inaktiveret føtal bovint serum [FBS] + 1x penicillin-streptomycin + ascorbinsyre [50 ng/mL] og mono-thioglycerol [100 nM]) ved 37 °C. Når OP9/filen DLL1 celler når 80 – 95% konfluency, vaskes en gang med 1x magnesium, calcium, og phenol rød fri fosfat bufferet saltvand (i det følgende benævnt PBS).</li>
	<li>Tilsæt 4 mL 0,05% trypsin og Inkuber i 5 min ved 37 °C. Tilsæt derefter 4 mL OP9 medier, dissocier cellelaget ved pipettering for at lave en enkelt cellesuspension.</li>
	<li>Cellesuspensionen overføres til et 50 mL konisk rør gennem et 100 μm cellefilter. Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, Aspirér supernatanten, og resuspender i 12 mL OP9-medier.</li>
	<li>Plade 2 mL OP9/filen DLL1 cellesuspension på en ny 10 cm celle-kultur Petri skål og tilsæt yderligere 8 mL OP9 medier. Gentag passage hver 2 – 3 dage. Bemærk: Kvaliteten af FBS og kulturforhold er afgørende for at opretholde udvidelsen af OP9/filen DLL1 celler uden at miste deres evne til at støtte iPSC differentiering. Derfor anbefales det at pre-evaluere partiet af FBS og passage konsekvent ved 80% konfluency at forhindre Celledifferentiering og senescens. Det er også vigtigt at gøre nok frosne bestand af OP9/filen DLL1 celler og tø en ny bestand hver 4 – 6 uger.</li>
</ol>2. in vitro-differentiering af iPSC i umodne T-celler
<ol><li>
På dag 0, begynde IPSC Co-kultur på OP9/filen dll1 flydende retter.
	<ol>
<li>Høst iPSC som en enkelt cellesuspension ved trypsinisering (5 min i 0,05% trypsin ved 37 °C), Saml cellerne, og centrifugeres ved 300 x g i 5 min ved 4 °c.</li>
		<li>Aspirér supernatanten og resuspender cellerne ved 1,0 x 105 IPSC pr. 10 ml OP9-medier. Plade 1,0 x 105 IPSC på en KONFLYDENDE OP9/filen dll1 10 cm parabol. Bemærk: OP9/filen DLL1 10 cm retter bruges til iPSC differentiering, når de når 90 – 100% konfluency. Forskelle i konfluency kan påvirke effektiviteten af iPSC-differentiering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På dag 3 skal du aspirere gamle medier og udskifte med 10 mL friske OP9-medier.</li>
	<li>
På dag 6, passage celler.
	<ol>
<li>Vask hver 10 cm flydende OP9 skål med 10 ml PBS. Tilsæt 3 mL 0,05% trypsin pr. skål og Inkuber i 3 – 5 minutter ved stuetemperatur (RT).</li>
		<li>Tilsæt 4 mL OP9-medier, og Indsaml cellerne ved skånsom pipettering. Passere celler gennem en 100 μm celle sien og centrifugeres ved 300 x g i 5 min ved 4 °c. Kassér supernatanten.</li>
		<li>Resuspension af celler i 10 ml differentierings medie (OP9 medier med 5 ng/ml mus Flt3 ligand [FLT3L] og 5 ng/ml mus Il-7) og plade cellesuspension på en ny 10 cm OP9/filen dll1 flydende skål.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På dag 9 skal du aspirere gamle medier og udskifte med 10 mL friske differentierings medier.</li>
	<li>
På dag 11, når kardiomyocytter observeres i iPSC kolonier, mekanisk frigøre ikke-klæber celler ved pipettering og filtrere gennem en 100 μm celle sien. Spin ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c.
	<ol>
<li>Aspirér supernatanten, og genopsæt den i 24 mL differentierings medier. Plade IPSC ind i en flydende OP9/filen dll1 6-brønd plade (4 ml/brønd).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
På dag 15, indsamle alle ikke-klæber celler og filtrere gennem en 40 μm celle Strainer.
	<ol>
<li>Spin ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c.</li>
		<li>Fortsæt med at passaging ikke-klædige celler hver 3 – 4 dage ved at gentage trin 2.5.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.3D Thymisk organ kultur til at generere iTE
<ol><li>Høst mus føtale thyminsyre lapper og implementere endogene lymfocytter af deoxyguanosin (dguo) behandling som tidligere beskrevet16.</li>
	<li>På dag 7 i dGUO-behandling skal du tage fire nye 10 cm retter og fylde hver med 20 mL komplette medier (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamin + 1x natrium pyruvat + 1x minimum vigtigt medium med ikke-essentielle aminosyrer (MEM-NEAA) + 1x penicillin-streptomycin + [1:1000] 2-mercapto ethanol).</li>
	<li>Overfør alle nitrocellulose membraner med thymisk lapper til 1 10 cm parabol. Løstag de enkelte lapper fra membranen med tang, så de kan nedsænkes i medierne. Kassér membranerne. Inkuber i 1 time ved RT.</li>
	<li>Overfør de thymiske lapper til en ny 10 cm skål med komplette medier og Inkuber i 1 time ved RT. Gentag dette trin 2 gange mere.</li>
	<li>Ved hjælp af pincet, fastgør de thymiske lapper til skålen (en ad gangen), og med den anden hånd gøre en 100-200 μm dybe snit i midten og udvide halvdelen diameteren af lobe at lette T celle stamfader migration i lap.</li>
	<li>Overfør de thymiske lapper til en ny 10 cm skål fyldt med komplette differentierings medier (komplet Media + 5 ng/mL mus IL-7 + 5 ng/mL mus FLT3L + 5 ng/mL SCF).</li>
	<li>Eventuelt, hvis du bruger 3D-kultur plader med lavere og øvre niveau gitre, fylde begge gitre med sterile PBS for at forhindre fordampning og tørring af de hængende dråber.</li>
	<li>Overfør 30 μL komplet medie indeholdende én dGuo-behandlet thymisk lap fra trin 3,6 til hver brønd i 3D-kultur pladen.</li>
	<li>Indsaml ikke-overtrædende T-Lineage celler (iPSC-afledte umodne T-celler) fra OP9/filen DLL1 Co-Culture (dag 16-21) (trin 2.6.2) og resuspension ved 2 – 5 x 103 T Lineage celler pr. 20 μl medie.</li>
	<li>Der tilsættes 20 μL T Lineage cellesuspension til hver thymisk lap i 3D-kultur pladen. Inkuber natten over ved 37 °C med 5% CO2.
</li>
	<li>Sæt P200 pipet til 30 μL, og Aspirer mediet efter pipettering flere gange fra hver brønd for at fjerne alle cellerne omkring de thymiske lapper. Kassér mediet, og tilsæt 30 μL komplet medie. Gentag denne procedure 5 – 7 gange for at fjerne eventuelle ekstra umodne T-celler, som ikke migrerer ind i lobes. Skift 25 – 30 μL af medierne dagligt derefter.</li>
	<li>Bekræft dannelsen af en glorie af iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE) omkring de lapper, der begynder på dag 4 – 5 ved let mikroskopi.</li>
	<li>Saml iTE dagligt ved pipette Rings medier uden afbrydelse af lobe. Skift medie hver dag, og Fortsæt indsamlingen op til ca. 12 dage.</li>
	<li>Høstet iTE er klar til brug til molekylære analyser (figur 2, figur 3, figur 4og figur 5) eller in vivo-transplantations eksperimenter.</li>
</ol>4. fremstilling af antigen præsentations celler (APC)
<ol><li>Ofrer en C57BL/6 mus ved livmoderhalsen dislokation og Placer på en lab soaker mat som beskrevet ovenfor.</li>
	<li>Fjern milten og Placer den på et 100 μm cellefilter. Komprimer milten på straineren ved hjælp af et 12 mL sprøjte stempel for at lave en enkelt cellesuspension.</li>
	<li>Overfør cellesuspensionen gennem en steril 40 μm celle-si. Centrifugér suspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c for at pille cellerne.</li>
	<li>Opsug supernatanten og resuspension celle pellet i 2 mL ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysis buffer til at udelukke røde blodlegemer (RBC). Inkuber i 5 minutter ved RT.</li>
	<li>Du slukker for ACK lysis-bufferen ved at tilføje 10 mL PBS. Cellerne centrifugeres ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c.</li>
	<li>Aspirér supernatanten og resuspender celle pellet i 10 mL komplette medier og Overfør til en 10 cm steril Petri skål.</li>
	<li>Irradiate splenocytter med 3500 rad ved hjælp af en bestrålings anordning (γ-stråling) for at forhindre celle spredning.</li>
	<li>Straks returnere de bestrålede celler til en 37 °C inkubator og Kulturnatten over.</li>
	<li>Brug bestrålede celler som APC eller fryse i Cell banker.</li>
</ol>5. pulserende APC med antigen
<ol><li>Tæl levende bestrålet APC ved hjælp af en Neubauer hemocytometer og trypan og et blå farvestof. Du inkubere APC med peptider (hgp100) eller nucleoprotein i 30 min ved 37 °C.</li>
	<li>Du skal vaske APC to gange med 10 mL PBS for at fjerne ekstra peptid.</li>
	<li>Tæl iTE og bland med APC i en 1:1 ratio i komplette medier med 100 IU IL-2 og 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL af blandingen af celler (total koncentration: 1 x 106 celler/ml) i hver brønd af en ultra-lav fastgørelse U bund 96 brønd plade og kultur for 48 h ved 37 °c.</li>
	<li>Efter 48 h, Overfør celler til en ny plade ved hjælp af en multikanals pipette og passage hver 2 – 3 dage derefter.</li>
	<li>
På dag 3 analyseres cytokinsekretions profilen ved farvning af cellerne med intracellulært antistof og analysér ved flowcytometri (figur 3).
	<ol>
<li>Tilsæt 0,67 μL/mL protein transport hæmmer (f. eks. GolgiStop) og Inkuber ved 37 °C i 6 timer for at øge den intracellulære akkumulering af cytokiner. Vask med 10 mL PBS.</li>
		<li>Resuspension af celler i 3 mL kold (4 °C) PBS og tilsæt langsomt 1 mL kold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning.</li>
		<li>Efter 10 min, spin ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 °c, kassér supernatanten og vask med 10 ml PBS.</li>
		<li>Resuspendér cellerne i 1 mL PBS + 1% FBS + 0,1% nonioniske overfladeaktive, og Placer dem i 4 °C i 10 – 15 minutter.</li>
		<li>Tilsæt antistoffer, Beskyt prøverne mod lys og Placer dem i 4 °C i 30 minutter.</li>
		<li>Drej cellerne ned ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c, kassér supernatanten, og vask med 10 ml PBS.</li>
		<li>Drej cellerne ned ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c, og resuspender cellerne i 1 ml PBS. Cellerne er klar til at blive analyseret i et flow-cytometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reactivity+in+thymic+double-positive+cells+commits+cells+to+a+CD8+alpha+alpha+lineage+with+characteristics+of+innate+immune+cells.">Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells.</a> Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).</li><li>Themeli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor-targeted+human+T+lymphocytes+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+cancer+therapy.">Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).</li><li>Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+TCR+expression+and+aberrant+T+cell+development+in+mice+with+endogenous+prerearranged+T+cell+receptor+genes.">Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes.</a> Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Serwold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor-driven+lymphomagenesis+in+mice+derived+from+a+reprogrammed+T+cell.">T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+2-dGuo-treated+thymus+organ+cultures.">Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).</li><li>Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullary+thymic+epithelial+stem+cells:+role+in+thymic+epithelial+cell+maintenance+and+thymic+involution.">Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+L-selectin:+homing,+inflammation,+and+beyond.">Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Adolescence:+Maturation+Events+Beyond+Positive+Selection.">T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection.</a> Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).</li><li>Best, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+insights+into+the+CD8(+)+T+cell+response+to+infection+and+memory+T+cell+formation.">Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation.</a> Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).</li><li>Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+thymocyte+selection+in+vivo.">Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo.</a> International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).</li><li>Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+T+lymphocytes+in+fetal+thymus+organ+culture.">The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).</li><li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+CCR7+ligands+in+the+emigration+of+newly+generated+T+lymphocytes+from+the+neonatal+thymus.">Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus.</a> Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).</li><li>Watanabe, Y., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+T+cell+receptor+alpha+beta-bearing+T+cells+in+the+submersion+organ+culture+of+murine+fetal+thymus+at+high+oxygen+concentration.">Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration.</a> European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).</li></ol>

Forfattere Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen, og Nicholas P. Restifo er opfindere på verserende internationale patentansøgning PCT/US2017/65986, arkiveret December 13, 2017, med titlen "metoder til at forberede en isoleret eller renset population af thymic emigrant celler og metoder til behandling ved hjælp af det samme. "

Ved hjælp af T-iPSC at regenerere tumor antigen-specifikke T-celler kan overvinde mange af de nuværende forhindringer af ACT ved at generere unge celler med forbedret vedholdenhed. Selv om flere metoder ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system er blevet rapporteret til at generere CD8 SP-celler6,7,10,13 , der udtrykker CD8 molekyler og tumor antigen-specifikke tcrs, global gen udtryks mønstre og funktionel analyse viser, at disse extrathymically regenereret CD8 SP-celler er forskellige fra naive T-celler (figur 4). Her beskriver vi et 3D-thymisk kultur system, der kan generere iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE) med høj pålidelighed og homogenitet fra murine T-iPSC. iTE ligne naive T-celler i globale genekspression mønster og i funktionalitet, såsom hukommelse dannelse og in vivo anti-tumor effekt mod etablerede tumor15.
Det klassiske FTOC-system er en måde at rekapitulere thymisk udvælgelse in vitro. Det har været brugt til at studere intra-thymisk udvikling af thymocytter23, og der er et par rapporter om ftoc bliver brugt til at generere rte24. FTOC-systemet har dog flere begrænsninger. For at håndtere den manglende ilt i en kunstig organ kultur, har flere grupper brugt enten en semi-tør membranbaseret kultur23, eller høj ilt nedsænkning kultur systemer25. Men, ingen nuværende metoder kan konstant generere en homogen population af post-thymic T-celler. For at overvinde begrænsningerne i det klassiske FTOC-system designede vi et 3D-thymisk kultur system, der giver tekniske forbedringer i forhold til konventionelle metoder15. For eksempel, ved hjælp af vores 3D thyminsyre kultur metode, maksimal ilt udveksling og fraværet af overflade-lap mekanisk stress holde thyminsyre lapper i et mere fysiologisk miljø. Derudover tillader langsigtet kultur modne T-celler at udgå naturligt fra de thymiske lobes. Endelig muliggør realtids observation og mikromanipulation medieudveksling og en konstant samling af iTE uden fysisk at forstyrre de thymiske lapper. Således giver 3D thyminsyre-dyrkningsmetoden betydelige tekniske forbedringer samt en mulighed for at studere thymidisk udvalgte naive T-celler, der ikke tidligere var tilgængelige.
Der er flere vigtige punkter for den vellykkede generation af iTE ved hjælp af denne 3D thyminsyre kultur system. Kvaliteten af FBS og kulturforhold er afgørende for at opretholde udvidelsen af OP9/filen DLL1 celler uden at miste deres evne til at støtte iPSC differentiering. Derfor anbefaler vi præ-evaluering af FBS-partiet samt konsekvent passaging ved 80% konfluency for at forhindre Celledifferentiering og senescens. Derudover kræves der en flydende OP9/filen dll1-kultur til in vitro -differentiering af IPSC i umodne T-celler, da forskelle i konfluency kan påvirke deres effektivitet. Endelig er den foster alder af thyminsyre lapper afgørende for generering af iTE. Vi anbefaler at bruge e 14.5-15,5 thyminsyre lobes.
Som med enhver ny protokol, denne metode har begrænsninger og er underlagt forbedringer. Den kultur teknik, der præsenteres her, genererer ca. 1000 iTE pr. thymisk lap pr. dag i en periode på to uger. Øget iTE generation kan være muligt med yderligere ændringer, herunder optimering af ilt koncentration, medie volumen, og type af 3D kultur plade. Tilsætning eller fjernelse af cytokiner samt ændringer i cytokinkoncentrationen kan også bidrage til forbedret iTE-udbytte.
Da det 3D-thymiske kultur system, der præsenteres her, kan generere thymisk emigranter i et helt ex vivo -system, kan denne teknik anvendes på en række immunologiske og adoptivcelle overførsels forskningsprojekter, herunder, men ikke begrænset til, T Celledifferentiering, post-thymisk T-celle modning og generering af antigen specifikke T-celler fra hæmatopoietiske stamceller. Selv om denne metode ikke er direkte anvendelig på humane prøver, iTE og 3D thyminsyre kultur system har et stort potentiale for at belyse de molekylære mekanismer af positive og negative udvælgelse og kan lette skabelsen af et kultur system, der gør det muligt generation af klinisk relevante tumor antigen-specifikke naive-lignende T-celler for ACT.

Adoptiv T celleterapi (ACT) kan være en effektiv behandling for nogle patienter med fremskreden kræft. Desværre, mange patienter oplever ikke tumorregression, og overførte celler undlader at fortsætte efter infusion. Dette kan skyldes kvaliteten af de inbrugte T-celler. En ACT-musemodel viste, at i forhold til naive eller mindre differentierede centrale hukommelses-T-celler er terminalt differentierede Effector-celler mindre potente på grund af dårlig in vivo-persistens1, en observation, der også understøttes af kliniske data2, 3.
I et forsøg på at forbedre effekten af den nuværende handling, t celle-afledte inducerede pluripotente stamceller (t-IPSC) er blevet undersøgt i udstrakt grad4,5. Når T-celler omprogrammeres til T-iPSC og re-differentieret i T-celler, nedarves den omarrangerede konfiguration af TCR-gener af T-iPSC og efterfølgende de re-differentierede T-celler. Derfor giver T-iPSC mulighed for ubegrænset in vitro-ekspansion en effektiv reproduktion af umodne T-celler, der bærer de neoantigen-specifikke T-celle receptorer (TCR), når sådanne celler er konstrueret fra tumor antigen specifikke T-celler6 ,7. Men den præcise metode til differentiering af T-iPSC i modne T-celler, som ville gøre det muligt at fremstilling af kræft antigen-specifikke T-celler med en mindre differentieret fænotype og bedre anti-tumor styrke, er stadig at blive belyst.
T-IPSC differentiering beskæftiger Co-kultur af OP9 murine stromale celler over-udtrykker menneskelig notch ligand filen dll1 er en veletableret metode til at producere T-celler in vitro6,7. I mus og mennesker, kan dette Co-kultur system konsekvent differentiere IPSC, og dermed rekapitulere udviklingsmæssige begivenheder fra blastocyst scenen indtil den umodne T Cell Lineage fase6,7. På trods af disse bioteknologiske fremskridt er den fysiologiske differentiering efter CD4+CD8+ Double positive (DP)-stadiet stadig svær at opnå. En af grundene er, at in vivo CD4+CD8- og CD4-CD8+ enkelt positive (SP) T celler genereres i thymus, et organ med ansvar for modning og udvælgelse af T-celler, der har fremmede antigen-specificitet, men ikke auto-reaktivitet8. Disse selektive processer defineres som henholdsvis positivt og negativt valg. Men de fleste af de molekylære mekanismer, der er nødvendige for at modne T-celler i thymus, er stadig ikke fuldt forstået, hvilket gør det vanskeligt at rekonstruere denne proces in vitro. I et forsøg på at overvinde denne fysiologiske hurdle, flere grupper har stimuleret TCR kompleks ved hjælp af anti-CD3 antistoffer eller agonist peptider. Disse in vitro-teknikker genererer celleprodukter, som udtrykker vigtige T-celle markører, som CD3, CD8αβ, TCRαβ og CD62L, mens de stadig bevarer tumor antigen-specificitet. Desværre, T-celler genereret af disse extrathymic metoder udgør en bred heterogene population af celler karakteriseret ved ufuldstændig positiv udvælgelse, medfødte-lignende funktioner, TCR ikke-specifikke drab, manglende evne til hukommelse dannelse, og ikke-persistente anti-tumor effekter in vivo8,9,10,11. Disse anomalier har givet anledning til bekymring for, at sådanne celler kan udløse en række bivirkninger, herunder lymfom og både hud-og knogle anomalier, hvis de anvendes til terapeutiske anvendelser12,13,14 .
For at genskabe de fysiologiske signaler, der mangler i de nuværende in vitro-differentierings systemer, blev tumor antigen-specifik T-iPSC differentieret ved hjælp af en høstet thymus. Den klassiske føtale thymus organ kultur (ftoc) system, som var designet til at studere intra-thymisk udvikling af t-celler, blev forbedret ved hjælp af en 3D-kultur system, som med succes producerede t-celler, der afsluttede thyminsyre uddannelse. Disse post-thymiske T-celler, som blev udpeget som iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE), udviste naive lignende egenskaber15. iTE viste spredning, hukommelse dannelse, og passende anti-tumor effekter i en musemodel mod etablerede B16 melanom tumorer. Denne artikel beskriver i detaljer protokollen for denne roman FTOC system ved hjælp af en 3D kultur system (figur 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">312693-72-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-Mercaptoethanol (1000X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">FBS</td>
			<td style="width:219px;">Gemini</td>
			<td style="width:344px;">100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Flt-3 ligand</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">hgp100</td>
			<td style="width:219px;">Genscript</td>
			<td style="width:344px;">282077-1, KVPRNQDWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-2</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">402-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-7</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM powder</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Nucleoprotein</td>
			<td style="width:219px;">Global Peptides</td>
			<td style="width:344px;">ASNENMETM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Puromycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stemfactor LIF, Mouse Recombinant</td>
			<td style="width:219px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:344px;">03-0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Cell Culture Vessels and others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">10 cm dish</td>
			<td style="width:219px;">Corning, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:344px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">12ML Syringe</td>
			<td style="width:219px;">Covidien&#160;Monoject</td>
			<td style="width:344px;">22-652-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">6 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 100um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 40um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Forceps</td>
			<td style="width:219px;">DUMONT</td>
			<td style="width:344px;">0108-5PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Lab soaker mat</td>
			<td style="width:219px;">Versi-Dry</td>
			<td style="width:344px;">Cat. EF2175CX 74018-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Membrane filters ( 0.8 &#956;m, 47diam)&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Whatman</td>
			<td style="width:344px;">WHA7408004&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Perfecta3D Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">HDP1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">U Bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">CD3-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEF-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td style="width:219px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">SCRC-1040; RRID:MGI:5007926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">OP9/N-DLL1</td>
			<td style="width:219px;">Riken Bioresource center</td>
			<td style="width:344px;">Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental mouse models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Charles River</td>
			<td style="width:344px;">Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">C57BL/6N</td>
			<td style="width:219px;">NCI/Charles River</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-1 mice</td>
			<td style="width:219px;">Overwijk et al.</td>
			<td style="width:344px;">J Exp Med 198(4):569-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-aTCR</td>
			<td style="width:219px;">Biolegend</td>
			<td style="width:344px;">109202; RRID:AB_313425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:219px;">abcam</td>
			<td style="width:344px;">ab11089; RRID:AB_369097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD4</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553730; RRID:AB_395014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD44</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">559250; RRID:AB_398661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.1</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553775; RRID:AB_395043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553772; RRID:AB_395041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD62L</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">560516; RRID:AB_1645257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD69</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">552879; RRID:AB_394508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8a</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557959; RRID:AB_396959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8b</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">550798; RRID:AB_393887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-H-2Kb</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553570; RRID:AB_394928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IFN-g&#160;</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557998; RRID:AB_396979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">554428; RRID:AB_395386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRb</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35-5961-81; RRID:AB_469741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRVb13</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553204; RRID:AB_394706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TNFa</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557644; RRID:AB_396761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants

Arv af præ-omarrangerede T celle receptorer (TCRs) og deres epigenetiske foryngelse gøre induceret pluripotente stamcelle (iPSC)-afledte T-celler en lovende kilde til adoptivt celleterapi (ACT). Klassiske in vitro-metoder til fremstilling af regenererede T-celler fra iPSC resulterer dog i enten medfødte eller terminalt differentierede T-celler, som er phenotypisk og funktionelt adskilte fra naive T-celler. For nylig blev et nyt tredimensionelt (3D) thymisk kultur system udviklet til at generere en homogen delmængde af CD8αβ+ antigen-specifikke t-celler med en naiv t celle-lignende funktionel fænotype, herunder kapaciteten til spredning, hukommelses dannelse og tumor suppression in vivo. Denne protokol undgår afvigende udviklingsmæssige skæbner, der muliggør generering af klinisk relevante iPSC-afledte T-celler, udpeget som iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE), samtidig med at der gives et potent værktøj til at belyse de efterfølgende funktioner, der er nødvendige for T celle modning efter thymisk udvælgelse.

Co-dyrkede føtale thymuser blev sektioneret til at analysere, om iPSC-afledte T Lineage celler kan migrere til de thymiske lobes. Unseeded Control lapper havde en vævs arkitektur karakteriseret ved en astrocyt-lignende thymisk epitel web17, indsat af endogene CD3+ celler. På den anden side blev thymisk lapper seedet med IPSC-afledte umodne t-celler blev genbefolket med CD3+ mononukleare celler, hvilket indikerer migration af IPSC-afledte umodne t-celler i lapper (figur 2A).
T-celler, der migrerede ind i og modnet inden for det thymiske mikromiljø efterfølgende egressed som iTE. For at teste deres fænotypiske karakterisering, flow cytometrisk analyse af C57BL6 thymocytter, pmel IPSC-afledte umodne T celler (extrathymic), og celler, der egressed fra thyminsyre lapper (iTE) blev udført. Extrathymic T-celler på OP9/filen DLL1 viste CD4+CD8+ (DP) t-celler og CD8αSP t-celler uden udtryk for den positive selektions markør MHC-i, hvorimod iTE havde en klar population af CD8αSP MHC-i+ T-celle fænotype, hvilket indikerer deres vellykket passage gennem positiv udvælgelse før egressing fra de thymiske lobes. iTE konsekvent Express MHC-I og CD62L, som er markører forbundet med høj proliferativ kompetence, cytokin produktion, perifer overlevelse, og lymfoide homing18,19,20. Denne fænotype er i overensstemmelse med m2 SP thymocytter, der er den mest modne population af enkelt positive T-celler i thymus20, hvilket tyder på, at iTE har skiftet gennem et normalt thymisk udviklingsprogram (figur 3). For at overvåge effektiviteten af iTE generation, celler, der havde egressed fra individuelle thyminsyre lapper blev isoleret. På dag 7 genererede thyminsyre lapper i gennemsnit 1 x 103 Live CD8SP CD 45.1+ CD3+ iTE pr. dag (figur 3B). En tilsvarende rate af iTE produktion observeres fra dag 6 til dag 12 af 3D thymisk Co-kultur.
Antigen-afhængig aktivering og sekretion af cytokiner blev analyseret for at observere de funktionelle egenskaber af thymidisk uddannede iPSC-afledte umodne T-celler. Ved tilstedeværelse af et irrelevant peptid (nucleoprotein) frigiver Pmel-iTE ikke signifikante mængder TNF-α, IL-2 eller IFN-γ. Når Pmel-iTE stimuleres med det cognate peptid til Pmel T-celler (hgp100), frigives de robuste mængder TNF-α og IL-2, samtidig med at der produceres lave mængder af IFN-γ (figur 4), hvilket indikerer, at thymidisk uddannet IT kan genkende deres cognate peptid og udskiller Effector cytokiner med en profil, der ligner de naturlige nylige thymiske emigranter (RTE).
For at undersøge de transkriptionelle forskelle mellem de iPSC-afledte T-Lineage-celler, der var differentieret på OP9/filen DLL1 med eller uden thymisk uddannelse (dvs. iTE versus extrathymiske t-celler), blev RNA-SEQ-analysen udført på disse to populationer og sammenlignede til at af DP T Lineage celler differentieret ved hjælp af OP9/filen DLL1 (DP) og primære naive CD8+ Pmel T celler. Udtrykket af 102 gener, der spiller afgørende roller i T Cell ontogeny, thymocyte aktivering, og hukommelse dannelse blev analyseret15,20,21,22. En hovedkomponent analyse af disse fire undersøgte populationer viste, at extrathymically genererede DP og CD8SP T-celler grupperet sammen, mens iTE grupperet tættere på naive T-celler (figur 5). Samlet set viser disse data, at iTE har en fænotype tættere på naive T-celler end de celler, der genereres af extrathymiske metoder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg"> Figur 1 : Skematisk oversigt over differentieringen af iPSC til iTE ved hjælp af OP9/filen dll1 og 3D thymisk kultur. Protokollen omfatter tre særskilte differentierings trin; (Venstre) fra IPSC celler til hæmatopoietiske Lineage celler på OP9/filen dll1 (dag 0 til 6), (midten) fra hæmatopoietiske Lineage celler til UMODNE t celler på OP9/filen dll1 med cytokiner (dag 6 til 16 – 21), og (højre) fra umodne t-celler (dag 16 – 21) til ved hjælp af et 3D-thymisk kultur system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg"> Figur 2 : Immuno-histokemi af thymisk lapper seedet med IPSC-afledte umodne T-celler. Overdel: H & E farvning af en thymisk lap med og uden såning af iPSC-afledte umodne T-celler. Fra anden top til bund: konfokale billeder af de sekerede lapper farvet med dapi (Nucleus), CD3 (T Cell), og Merge. Skala stænger = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg"> Figur 3 : iTE viser en post-thymisk T-celle fænotype. A) FACS-analyser af thymocytter, extrathymiske T-celler (OP9/filen dll1-Co-Culture-system) og pmel-iTE. Levende celler blev gated på congenic CD45+. CD8 SP-populationer blev yderligere analyseret for CD62L og MHC-I-ekspression. (B) gennemsnitligt antal CD8SP CD 45.1 iTE produceret natten over pr. lap 7 dage efter forsåning. Der blev indsamlet data fra 12 uafhængige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg"> Figur 4 : iTE producerer forskellige cytokiner ved antigen-specifik stimulation. FACS analyser af intra-cellulære produktion af cytokiner ved iTE. iTE blev co-dyrket med APCs pre-loaded med irrelevant (nucleoprotein) eller cognate (hgp100) peptid i tre dage. De tal, der vises i øvre højre kvadranter, angiver procentdelen af iTE, der producerer cytokin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg"> Figur 5 : Hel-transkriptome analyse afslører et skift i iTE genekspression mod en naiv CD8 + T Cell program. Princip komponent analyse (PCA) af RNA-SEQ-data fra DP, extrathymic CD8 SP, iTE og naive T-celler. (Analyse af 102 gener relateret til thymisk differentiering ved hjælp af offentlig database GSE105110) 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">Klik venligst her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensionel Thymisk kultur system til at generere murine induceret pluripotente stamcelle-afledte tumor antigen-specifikke Thymisk emigranter

Denne artikel beskriver en ny metode til at generere tumor antigen-specifikke induceret pluripotente stamcelle-afledte thymisk emigranter (iTE) af en tredimensionel (3D) thymisk kultur system. iTE er en homogen delmængde af T-celler tæt relateret til naive T-celler med kapacitet til spredning, hukommelse dannelse, og tumor suppression.

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Generationen af iPSC-afledte thymiske emigranter ved en 3D thymisk organkultur er den første in vivo-metode, der regenererer homogen population af tumorantigenspecifikke naive-lignende T-celler. De vigtigste fordele er iTE er mere fysiologiske relevante, og denne metode mere er mere potent end enhver anden in vivo differentialmetode til at producere konstant en specifik T-celler. iTE er homogen ked af CD8 alpha-beta anti-genous specifikke T-celler med en naiv T-celle-lignende funktionel fænotype, herunder evnen til spredning, remodiformation, og tumor undertrykkelse in vivo.Demonstration af proceduren vil være Doctor Rafiqul Islam en post-doc i mit laboratorium. At begynde kultur OP9/DLL1 celler i OP9 medier ved 37 grader Celsius. Når cellerne nå 80 til 95 procent sammenløbet, vaske dem én gang med en X magnesium, calcium, og phenol rød fri PBS.Tilføj fire milliliter punkt nul fem procent trypsin og inkubere ved 37 grader celsius i fem minutter. Tilføj derefter fire milliliter OP9-medier og pipet for at fjerne tilknytningen af cellelaget og foretage en enkelt cellesuspension. Cellesuspensionen overføres til et konisk rør på 50 milliliter gennem en 100 mikrometercellesting.Centrifuge ved 300 G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Inspirer suppurate og re-suspendere cellerne i 12 milliliter OP9 medier. Derefter plade to milliliter af OP9/DLL1 celle suspension i en ny 10 centimeter cellekultur Petriskål.Tilføj yderligere otte milliliter OP9-medier. Gentag denne passage hver anden til tre dage. På dag nul høst den inducerede pluripotente stamceller som en enkelt celle suspension ved trypsinization.Indsamle celler og centrifuge ved 300 G ved fire grader celsius i fem minutter. Inspirer supernatanten og re-suspendere IPC's på en tæthed på 100, 000 celler pr 10 milliliter OP9 medier. Derefter plade 100, 000 celler på et sammenløb OP9/DLL1 10 centimeter skål.Fortsæt inkubation ved 37 grader celsius med fem procent kuldioxid. På dag tre aspirere de gamle medier og erstatte det med 10 milliliter friske OP9 medier. På dag seks vaskes hver 10 centimeter sammenløbet OP9 skål med 10 milliliter PBS.Tilføj tre milliliter punkt nul fem procent trypsin til hver skål. Og inkubere i tre til fem minutter ved stuetemperatur. Tilføj fire milliliter OP9-medier og rør forsigtigt for at indsamle cellerne.Cellerne gennem en 100 mikrometercelles si og centrifuge ved 300 G og fire grader celsius i fem minutter. Kassér derefter supernatanten. Re-suspendere cellerne i 10 milliliter differentiering medier.Plade celle suspension på en ny 10 centimeter OP9/DLL1 sammenløb fad. Fortsæt inkubation ved 37 grader celsius med fem procent kuldioxid. På dag ni, aspirere de gamle medier og erstatte det med 10 milliliter frisk differentiering medier.Fortsæt inkubering af cellerne ved 37 grader celsius og fem procent CO2. På dag 11, når kardiomyocytter er observeret i iPSC kolonier bruge en pipet til mekanisk løsrive ikke-klæbende celler. Cellerne filtreres gennem en 100 mikrometercelles si og centrifugeres ved 300 G og fire grader celsius i fem minutter.Derefter aspirere supernatanten og re-suspendere cellerne i 24 milliliter differentieringsmedier. Plade iPSC's i et sammenløb OP9/DLL1 seks brøndplade. Inkuber cellerne ved 37 grader celsius med fem procent kuldioxid.På dag 15 indsamles alle ikke-klæbende celler, og de filtreres gennem en 40 mikrometercellestudse. Centrifuge ved 300 G og ved fire grader celsius i fem minutter. Fortsæt med at overføre de ikke-klæbende celler hver tredje til fjerde dag som tidligere beskrevet.På dag syv af DGWO behandling, tage fire nye 10 centimeter retter. Fyld hver skål med 20 milliliter komplette medier. Overfør alle de nitrocellulosemembraner med thymic lapper i en 10 centimeter skål.Ved hjælp af snaft, løsrive de enkelte lapper fra membranen Giver dem mulighed for at blive nedsænket i medierne. Inkuber lappen i en time ved stuetemperatur. Derefter overføre thymic lapper til en ny 10 centimeter skål med komplette medier.Og inkuber i en time ved stuetemperatur. Gentag denne overførsel og inkubation yderligere to gange. Brug scepenps, fastgør thymic lapper til fadet, mens du bruger den anden hånd til at gøre en 100 til 200 mikrometer dybt snit i midten og udvide halvdelen af diameteren af lap for at lette T celle stamfader migration i lap.Overfør thymic lapper til en ny 10 centimeter skål fyldt med komplet differentiering medier. Hvis du bruger 3D-kulturplader med lavere og øvre niveau gitre, skal begge gitre fyldes med sterile PPS for at forhindre fordampning og tørring af de hængende dråber. Næste overførsel 30 mikroliter af komplette medier, der indeholder en DGWO behandlet thymic lap i hver brønd af 3D kultur plade.Indsaml de ikke-klæbende T-afstamningsceller fra OP9/DLL1-samkulturen. Og re-suspendere cellerne på en tæthed på 2, 000 til 5, 000 T celle afstamning celler pr 20 mikroliter af medier. Der tilsættes 20 mikroliter af T-afstamningscelleaffjedringen til hver thymic lap i 3D-kulturpladen.Inkubere natten over ved 37 grader celsius med fiver procent kuldioxid. Den næste dag, indstille P200 pipet til 30 mikroliter. Pipet medierne i hver brønd op og ned flere gange for at fjerne alle cellerne omkring thymic lapper.Derefter aspirere medierne fra hver brønd og erstatte det af 30 mikroliter af komplette medier. Gentag denne proces, pipetning, fjernelse, og udskiftning af medierne fem til syv gange for at fjerne eventuelle ekstra umodne T-celler, som ikke migrerer ind i lapperne. Fortsæt inkubering af lapper, og sørg for at ændre 25 til 30 mikroliter af medierne dagligt.På dag fire eller fem, bruge lys mikroskopi for at bekræfte dannelsen af en glorie af iPSC-afledte thymiske emigranter omkring lapperne. Saml iTE's daglige ved pipeting medier uden lap forstyrrelser. Skift mediet hver dag, og fortsæt samlingen op til ca. 12 dage.Høstede iTE'er er klar til brug til molekylær analyse eller in vivo transplantation eksperimenter. I denne undersøgelse, co-kulturperle føtal thymuses er opdelt til analyseret, om iPSC afledt T-celle afstamning celler kan migrere ind i thymic lapper. Un-seedede kontrol lapper har en vævsarkitektur karakteriseret ved en astrocyt-lignende thymic epitel web indsat af endogene CD3 positive celler.Men thymiske lapper seedet med iPSC afledt umodne T-celler er genbefolket med CD3 positive mononukleare celler, der angiver migration af iPSC afledt umodne T-celler i lapperne. T-celler, der migrerer ind i og modnes inden for det thymiske mikromiljø, der efterfølgende udsendes som iTE. Flow cytometrisk analyse bruges derefter til at teste fænoypisk karakterisering af forskellige celler.Ekstra thymic T-celler viser CD4, CD8 dobbelt positive T-celler og CD8 alpha enkelt positive T-celler uden udtryk for den positive markeringsmarkør, MHC Klasse One, mens iTE er en homogen population af CD8 alpha enkelt positiv MHC klasse En positiv T-celle fænotype, der angiver deres vellykkede passage gennem positiv udvælgelse før udtrædelse fra thymic lap. iTE har antigen-specificitet mod cognate peptid. iTE co-dyrket med antigen præsentere celler præinstalleret med et irrelevant peptid som nukleoprotein viser ikke i en cellulær produktion af cytokiner.Men iTE co-kultur antigen præsenterer celler pre-pulserende med cognate peptid GP100, producere intracellulær TNF alpha interleukin ii og interferon gamma. Husk, at open line cellekultur er stærkt afhængig af ABS slot. Genereret iTE kan bruges i enhver anden analyse arbejder med konventionelle T-celler.For eksempel, T celle clearing assay, cytokin produktion assay, in vivo tumor regression forsøg, T celle differentiering undersøgelse, et cetera. Denne teknologi kan anvendes på mange immunologiske eller sådanne projekt. Herunder en T-celledifferentiering, pulstiming T-cellemodning og generering af antigenspecifik T-celle fra hæmatokritæfader eller stamcelle.Efter at have set denne video seeren bør forstå, hvordan man genererer induceret pluripotent, stamceller afledt, tumor antigen specifikke thymic emigranter ved hjælp af en 3D thymic organkultur system.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Muse ortotopisk Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En mus Model af træthed induceret af perifere Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom ved hjælp af Li-Fraumeni syndrom Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller-celler

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fuldt humant tumor-baserede matrix i tredimensionale Spheroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse af tumor og væv distribution af Target Antigen specifikke terapeutiske antistof

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tre-dimensionel model af sfæroider til undersøgelse tyktarmskræft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...