Name: a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

We bedanken Hiroshi Kawamoto en Kyoko Masuda voor het vriendelijk verstrekken van de OP9/DLL1-cellijn. Wij danken Alan B. Hoofring en Erina Z. Hij voor grafische hulp. Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het US National Cancer Institute (ZIA BC010763) en het Cancer moonshot-programma voor het centrum voor cel-based therapie bij de NCI, NIH. Het werk werd ook gesteund door de Milstein Family Foundation.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de instellingen voor de instelling van het Instituut voor dierenverzorging en-gebruik van het National Cancer Institute (NCI) en uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-richtlijnen.
1. bereiding van OP9/DLL1-cellen voor co-cultuur met iPSC
<ol><li>Cultuur OP9/DLL1-cellen in OP9 media (α-minimaal essentieel medium [α-MEM] + 20% niet-warmte geïnactiveerd foetaal runderserum [FBS] + 1x penicillaire-streptomycine + ascorbinezuur [50 ng/mL] en mono-thioglycerol [100 nM]) bij 37 °C. Wanneer OP9/DLL1-cellen 80 – 95% confluentie bereiken, moet u één keer wassen met 1x magnesium, calcium en fenolrood vrije fosfaat gebufferde zoutoplossing (hierna PBS genoemd).</li>
	<li>Voeg 4 mL 0,05% trypsine toe en inincuberen gedurende 5 min bij 37 °C. Voeg vervolgens 4 ml OP9 media toe, dissociëren de cellaag door Pipetteer om een enkele celsuspensie te maken.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 mL door middel van een celzeef van 100 μm. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, zuig het supernatant op en respendeer in 12 mL OP9 media.</li>
	<li>Plaat 2 mL OP9/DLL1-celsuspensie op een nieuwe 10 cm celcultuur Petri schaal en voeg extra 8 mL OP9 media toe. Herhaal de passage elke 2 – 3 dagen. Opmerking: De kwaliteit van de FBS en cultuur voorwaarden zijn essentieel om de uitbreiding van OP9/DLL1-cellen te behouden zonder verlies van hun vermogen om te ondersteunen iPSC differentiatie. Daarom is het aanbevolen om de lot van FBS en passage consequent vooraf te evalueren op 80% confluentie om celdifferentiatie en senescentie te voorkomen. Het is ook belangrijk om voldoende bevroren voorraad OP9/DLL1-cellen te maken en elke 4 – 6 weken een nieuwe kolf te ontdooien.</li>
</ol>2. in vitro differentiatie van iPSC in onrijpe T-cellen
<ol><li>
Begin op dag 0 met de co-cultuur van iPSC op OP9/DLL1-confluente gerechten.
	<ol>
<li>Oogst iPSC als een enkelvoudige celsuspensie door trypsinoisatie (5 min in 0,05% trypsine bij 37 °C), verzamel de cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Aspireren de supernatant en respenderen cellen op 1,0 x 105 IPSC per 10 ml van OP9 media. Plaat 1,0 x 105 IPSC op een CONFLUENT Health OP9/dll1-10 cm schotel. Opmerking: OP9/DLL1-10 cm gerechten worden gebruikt voor iPSC differentiatie wanneer ze 90-100% confluency bereiken. Verschillen in confluentie kunnen de efficiëntie van iPSC-differentiatie beïnvloeden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op dag 3, aspireren oude media en vervangen door 10 mL van verse OP9 media.</li>
	<li>
Op dag 6, passage cellen.
	<ol>
<li>Was elke 10 cm Confluent Health OP9 Dish met 10 mL PBS. Voeg 3 mL 0,05% trypsine per gerecht toe en incuberen gedurende 3 – 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Voeg 4 mL OP9 media toe en verzamel cellen door voorzichtig pipetteren. Geef cellen door een 100 μm celzeef en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi supernatant weg.</li>
		<li>Rebreng cellen in 10 mL differentiatie media (OP9 media met 5 ng/mL muis Flt3 ligand [FLT3L] en 5 ng/mL muis IL-7) en Plate Cell suspensie op een nieuwe 10 cm OP9/DLL1-Confluent Health gerecht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op dag 9, aspireren oude media en vervangen door 10 mL van verse differentiatie media.</li>
	<li>
Op dag 11 wanneer cardiomyocyten worden waargenomen in iPSC-kolonies, ontkoppel mechanisch niet-aanhangende cellen door pipetteren en filteren door een 100 μm-celzeef. Spin bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
	<ol>
<li>Aspireren de supernatant en respenderen in 24 mL differentiatie media. Plaat iPSC in een Confluent Health OP9/DLL1-6-well plate (4 mL/well).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verzamel op dag 15 alle niet-aanhandige cellen en filtreer door een 40 μm-celzeef.
	<ol>
<li>Spin bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Doorgaan met het doorvoeren van niet-aanhangende cellen elke 3 – 4 dagen door te herhalen stap 2.5.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.3D Thymic orgel cultuur om iTE te genereren
<ol><li>Oogstmuis foetale Thymus lobben en implementeer endogene lymfocyten door deoxyguanosine (dguo) behandeling zoals eerder beschreven16.</li>
	<li>Op dag 7 van de behandeling met dguo, neem vier nieuwe gerechten van 10 cm en vul elk met 20 ml complete media (rosswell Park Memorial Institute media 1640 [rpmi 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamine + 1x natrium pyruvaat + 1x minimaal essentieel medium met niet-essentiële aminozuren (MEM-NEAA) + 1x penicillaire-streptomycine + [1:1000] 2-mercapto ethanol).</li>
	<li>Breng alle nitrocellulose membranen met Thymus lobben over in een schaal van 1 10 cm. Maak de afzonderlijke lobben van het membraan los met een tang, zodat ze in de media kunnen worden ondergedompeld. Gooi de membranen weg. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.</li>
	<li>Breng de thymus lobben over naar een nieuwe 10 cm schaal met volledige media en incuberen gedurende 1 uur bij RT. Herhaal deze stap nog 2 keer.</li>
	<li>Met behulp van een tang, Fixeer de thymus lobben op de schaal (een voor een), en met de andere hand een 100-200 μm diepe incisie in het midden en strek de helft van de diameter van de LOB om T cel voorlopercellen migratie in de kwal.</li>
	<li>Breng de thymus lobben over naar een nieuwe 10 cm schaal gevuld met volledige differentiatie media (volledige media + 5 ng/ml muis Il-7 + 5 ng/ml muis FLT3L + 5 ng/ml SCF).</li>
	<li>Als u 3D-cultuur platen met rasters op een lager en hoger niveau gebruikt, vult u beide rasters met steriele PBS in om de verdamping en droging van de hangende druppels te voorkomen.</li>
	<li>Breng 30 μL volledige media met één met dguo behandelde Thymus-LOB over van stap 3,6 in elke put van een 3D-kweek plaat.</li>
	<li>Verzamel niet-aanhandige T-Lineage cellen (door iPSC afgeleide onrijpe T-cellen) van OP9/DLL1-co-cultuur (dagen 16-21) (stap 2.6.2) en hervat de Lineage cellen met 2 – 5 x 103 t per medium van 20 μL.</li>
	<li>Voeg 20 μL T-Lineage celsuspensie toe aan elke Thymus-LOB in de 3D-kweek plaat. Incuberen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2.
</li>
	<li>Stel de P200 pipet in op 30 μL en zuig de media op na meerdere malen te hebben gepipetteer van elke put om alle cellen rond de thymus lobben te verwijderen. Gooi de media weg en Voeg 30 μL volledige media toe. Herhaal deze procedure 5 – 7 keer om eventuele extra onvolgroeide T-cellen die niet migreren naar de lobben te verwijderen. Verander daarna dagelijks 25 – 30 μL media.</li>
	<li>Bevestig de vorming van een Halo van de IPSC-afgeleide Thymus emigranten (iTE) rond de lobben beginnend op dag 4 – 5 door Lichtmicroscopie.</li>
	<li>Verzamel iTE dagelijks door Pipetteer media zonder kwab verstoring. Verander de media elke dag en ga verder met de verzameling tot ongeveer 12 dagen.</li>
	<li>Geoogste riet is klaar voor gebruik voor moleculaire analysen (Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5) of in vivo transplantatie experimenten.</li>
</ol>4. bereiding van antigeen cellen presenteren (APC)
<ol><li>Offer een C57BL/6 muis door cervicale dislocatie en plaats op een Lab Soaker mat zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Verwijder de milt en plaats deze op een celzeef van 100 μm. Comprimeer de milt op de zeef met behulp van een 12 mL zuiger van de spuit om een enkelvoudige celsuspensie te maken.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een steriel 40 μm celzeef. Centrifugeer de suspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c om de cellen te pellet.</li>
	<li>Zuig de supernatant op en hervat de celpellet in 2 mL ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer om rode bloedcellen (RBC) uit te sluiten. Inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.</li>
	<li>Quench de ACK-lysisbuffer door 10 mL PBS toe te voegen. Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.</li>
	<li>Aspireren de supernatant en rediëren van de celpellet in 10 mL volledige media en overbrengen naar een 10 cm steriele Petri schaal.</li>
	<li>Bestraleren splenocytes met 3500 Rad met behulp van een bestraling (γ-straling) om celproliferatie te voorkomen.</li>
	<li>Onmiddellijk de bestraalde cellen terug naar een incubator van 37 °C en een nacht cultuur.</li>
	<li>Gebruik bestraalde cellen als APC of Vries in Cell Banker.</li>
</ol>5. pulserende APC met antigeen
<ol><li>Tel Live bestraalde APC met behulp van een Neubauer hemocytometer en trypaanse blauwe kleurstof. Incuberen APC met peptiden (hgp100) of nucleoproteïne gedurende 30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Was APC tweemaal met 10 mL PBS om extra peptide te verwijderen.</li>
	<li>Tel iTE en meng met APC in een 1:1 verhouding in volledige media met 100 IU IL-2 en 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL van het mengsel van cellen (totale concentratie: 1 x 106 cellen/ml) in elke put van een ultra-lage aanbouw U onder 96 goed plaat en cultuur voor 48 h bij 37 °c.</li>
	<li>Na 48 h, breng de cellen naar een nieuwe plaat met behulp van een multichannel pipet en passage elke 2 – 3 dagen daarna.</li>
	<li>
Analyseer op dag 3 het cytokine-secretie profiel door de cellen te verkleuren met intracellulair antilichaam en analyseer door Flowcytometrie (Figuur 3).
	<ol>
<li>Voeg 0,67 μL/mL eiwit transport remmer (bijv. GolgiStop) toe en inbroed bij 37 °C gedurende 6 uur om de intracellulaire accumulatie van cytokines te verbeteren. Wassen met 10 mL PBS.</li>
		<li>Respendeer cellen in 3 mL koude (4 °C) PBS en voeg langzaam 1 mL koude 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing toe.</li>
		<li>Na 10 min, spin cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c, gooi supernatant weg en was met 10 ml PBS.</li>
		<li>Respendeer cellen in 1 mL PBS + 1% FBS + 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof en plaats in 4 °C gedurende 10 – 15 minuten.</li>
		<li>Voeg antilichamen toe, Bescherm monsters tegen licht en plaats gedurende 30 minuten in 4 °C.</li>
		<li>Spin cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c, gooi supernatant weg en was met 10 ml PBS.</li>
		<li>Spin cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en respendeer cellen in 1 ml PBS. Cellen zijn klaar om te worden geanalyseerd in een flow cytometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reactivity+in+thymic+double-positive+cells+commits+cells+to+a+CD8+alpha+alpha+lineage+with+characteristics+of+innate+immune+cells.">Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells.</a> Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).</li><li>Themeli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor-targeted+human+T+lymphocytes+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+cancer+therapy.">Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).</li><li>Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+TCR+expression+and+aberrant+T+cell+development+in+mice+with+endogenous+prerearranged+T+cell+receptor+genes.">Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes.</a> Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Serwold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor-driven+lymphomagenesis+in+mice+derived+from+a+reprogrammed+T+cell.">T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+2-dGuo-treated+thymus+organ+cultures.">Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).</li><li>Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullary+thymic+epithelial+stem+cells:+role+in+thymic+epithelial+cell+maintenance+and+thymic+involution.">Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+L-selectin:+homing,+inflammation,+and+beyond.">Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Adolescence:+Maturation+Events+Beyond+Positive+Selection.">T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection.</a> Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).</li><li>Best, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+insights+into+the+CD8(+)+T+cell+response+to+infection+and+memory+T+cell+formation.">Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation.</a> Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).</li><li>Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+thymocyte+selection+in+vivo.">Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo.</a> International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).</li><li>Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+T+lymphocytes+in+fetal+thymus+organ+culture.">The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).</li><li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+CCR7+ligands+in+the+emigration+of+newly+generated+T+lymphocytes+from+the+neonatal+thymus.">Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus.</a> Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).</li><li>Watanabe, Y., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+T+cell+receptor+alpha+beta-bearing+T+cells+in+the+submersion+organ+culture+of+murine+fetal+thymus+at+high+oxygen+concentration.">Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration.</a> European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).</li></ol>

Auteurs Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen, en Nicholas P. Restifo zijn uitvinders in afwachting van internationale octrooiaanvraag PCT/US2017/65986, gearchiveerd op 13 december 2017, getiteld "methoden voor de voorbereiding van een geïsoleerde of gezuiverde populatie van Thymic emigrant cellen en behandelingsmethoden met hetzelfde. "

Met behulp van T-iPSC te regenereren tumor antigeen-specifieke T cellen kunnen veel van de huidige obstakels van ACT te overwinnen door het genereren van jonge cellen met verbeterde persistentie. Hoewel verschillende methoden met behulp van het OP9/dll1-co-Culture-systeem zijn gerapporteerd voor het genereren van CD8 SP-cellen6,7,10,13 die CD8 moleculen en tumor antigeen-specifieke tcrs uitdrukken, globaal gen expressie patronen en functionele analyse tonen aan dat deze extrathymically geregenereerde CD8 SP cellen verschillend zijn van naïeve T-cellen (Figuur 4). Hier beschrijven we een 3D Thymus cultuur systeem dat IPSC-afgeleide Thymus emigants (iTE) kan genereren met een hoge getrouwheid en homogeniteit van Murine T-IPSC. iET lijken op naïeve T-cellen in mondiale genexpressie patroon en in functionaliteit, zoals Geheugenvorming en in vivo anti-tumor effect tegen gevestigde tumor15.
Het klassieke ftoc-systeem is een manier om de selectie van Thymus in vitrote recapituleren. Het is gebruikt voor het bestuderen van intra-thymic ontwikkeling van thymocyten23, en er zijn een paar meldingen van ftoc wordt gebruikt voor het genereren van RTE24. Het FTOC-systeem heeft echter verschillende beperkingen. Om te gaan met het gebrek aan zuurstof in een kunstmatige orgel cultuur, hebben verschillende groepen ofwel een semi-droge membraan gebaseerde cultuur23, of hoge zuurstof onderdompeling cultuur systemen25. Geen enkele huidige methode kan echter voortdurend een homogene populatie van post-thymic T-cellen genereren. Om de beperkingen van het klassieke ftoc-systeem te overwinnen, hebben we een 3D Thymus cultuur systeem ontworpen dat technische verbeteringen biedt ten opzichte van conventionele methoden15. Bijvoorbeeld, met behulp van onze 3D Thymus cultuur methode, maximale zuurstof uitwisseling en de afwezigheid van oppervlakte-Lobe mechanische stress houden de thymus lobben in een meer fysiologische omgeving. Bovendien, lange termijn cultuur toelaat volwassen T cellen uit te uitgaande natuurlijk van de thymus lobben. Tot slot, real-time observatie en Micro-manipulatie maken media-uitwisseling en een constante collectie van iTE mogelijk zonder fysiek verstoren de thymus lobben. Zo biedt de 3D Thymus cultuur methode belangrijke technische verbeteringen, evenals een Avenue om thymically geselecteerde naïeve T-cellen te bestuderen die niet eerder beschikbaar waren.
Er zijn verschillende belangrijke punten voor de succesvolle generatie van iTE met behulp van dit 3D Thymus cultuur systeem. De kwaliteit van de FBS en cultuur voorwaarden is van cruciaal belang om de uitbreiding van OP9/DLL1-cellen te behouden zonder verlies van hun vermogen om de iPSC-differentiatie te ondersteunen. Daarom raden we aan vooraf te evalueren van de FBS-partij en consequent door te gaan met 80% confluentie om celdifferentiatie en senescentie te voorkomen. Daarnaast is een confluente OP9/dll1--cultuur vereist voor in vitro differentiatie van IPSC in onrijpe T-cellen, omdat verschillen in confluentie hun efficiëntie kunnen beïnvloeden. Tot slot is het embryonale tijdperk van de thymus lobben cruciaal voor de generatie van de iTE. We raden aan om e 14.5-15,5 Thymus lobben te gebruiken.
Zoals bij elk nieuw protocol, deze methode heeft beperkingen en is onderhevig aan verbetering. De hier gepresenteerde cultuurtechniek genereert ongeveer 1000 iTE per Thymus kwal per dag gedurende een periode van twee weken. Verhoging van de productie van de iTE mogelijk met verdere wijzigingen, met inbegrip van de optimalisatie van de zuurstofconcentratie, mediavolume, en het type van 3D-cultuur plaat. Toevoeging of verwijdering van cytokinen, evenals veranderingen in de concentratie van cytokine, kan ook bijdragen tot een verbeterde iTE opbrengst.
Gezien het feit dat het hier gepresenteerde 3D Thymus cultuur systeem Thymus emigranten kan genereren in een volledig ex vivo systeem, kan deze techniek worden toegepast op een verscheidenheid aan immunologische en adopterende celoverdrachts onderzoeksprojecten, waaronder, maar niet beperkt tot T celdifferentiatie, de rijping van de T-cel na de thymic en het genereren van antigeen-specifieke T-cellen van hematopoietische voorlopercellen of stam Hoewel deze methode niet rechtstreeks toepasbaar is op menselijke monsters, houden iTE en het 3D Thymus cultuur systeem een groot potentieel om de moleculaire mechanismen van positieve en negatieve selectie te verhelderend en kunnen de creatie van een cultuur systeem dat het mogelijk maakt de generatie van klinisch relevante tumor-antigeen-specifieke naïeve-achtige T-cellen voor ACT.

Adoptive T Cell Therapy (ACT) kan een effectieve behandeling zijn voor sommige patiënten met gevorderde kanker. Helaas, veel patiënten ervaren geen tumor regressie, en overgedragen cellen niet te blijven aanhouden na infusie. Dit kan te wijten zijn aan de kwaliteit van de geïnfundeerde T-cellen. Een ACT Mouse model toonde aan dat in vergelijking met naïeve of minder gedifferentieerde centraal geheugen T cellen, terminaal gedifferentieerde Effector cellen minder potent zijn als gevolg van slechte in vivo persistentie1, een observatie ook ondersteund door klinische gegevens2, 3.
In een poging om de werkzaamheid van de huidige Act te verbeteren, zijn door de cel afgeleide, geïnduceerde pluripotente stamcellen (t-IPSC) uitgebreid bestudeerd4,5. Wanneer T-cellen worden geherprogrammeerd in T-iPSC en opnieuw worden gedifferentieerd in T-cellen, wordt de opnieuw gerangschikte configuratie van TCR-genen overgenomen door T-iPSC en vervolgens de opnieuw gedifferentieerde T-cellen. Daarom maakt de capaciteit van T-iPSC om onbeperkte in-vitro expansie te ondergaan een efficiënte reproductie mogelijk van onvolgroeide T-cellen die de neoantigeen-specifieke T-cel receptoren (TCR) dragen wanneer dergelijke cellen zijn ontworpen uit tumor antigeen-specifieke T-cellen6 ,7. Echter, de precieze methode voor differentiatie van T-iPSC in volwassen T cellen, waardoor de productie van kanker antigeen-specifieke T cellen met een minder gedifferentieerde fenotype en betere anti-tumor potentie, nog moet worden opgehelderd.
T-IPSC-differentiatie met de co-cultuur van OP9 muriene stromale cellen die de menselijke inkeping aan ligand dll1-uiten, is een gevestigde methode om T-cellen in vitro6,7te produceren. Bij muizen en mensen kan dit co-cultuur systeem IPSC consequent differentiëren, waardoor ontwikkelings gebeurtenissen van de blastocyst fase worden geherformueerd tot de onvolgroeide T Cell Lineage stage6,7. Ondanks deze biotechnologische ontwikkelingen is de fysiologische differentiatie na de CD4+CD8+ Double positive (DP) fase nog steeds moeilijk te bereiken. Een van de redenen is dat in vivo CD4+CD8- en CD4-CD8+ enkelvoudige positieve (SP) T-cellen worden gegenereerd in de thymus, een orgaan dat verantwoordelijk is voor de rijping en selectie van t-cellen die buitenlandse antigeen-specificiteit hebben, maar niet automatisch reactiviteit8. Deze selectieve processen worden respectievelijk gedefinieerd als positieve en negatieve selectie. Echter, de meeste van de moleculaire mechanismen die nodig zijn voor volwassen T cellen in de thymus zijn nog steeds niet volledig begrepen, waardoor het moeilijk is om dit proces in vitro reconstrueren. In een poging om deze fysiologische hindernis te overwinnen, hebben verschillende groepen het TCR-complex gestimuleerd met anti-CD3 antilichamen of agonist peptiden. Deze in vitro technieken genereren celproducten die de belangrijkste T-celmarkeringen uitdrukken, zoals CD3, CD8αβ, TCRαβ en CD62L, terwijl ze de tumor antigeen-specificiteit nog behouden. Helaas, T cellen gegenereerd door deze extrathymic methoden vormen een brede heterogene populatie van cellen gekenmerkt door onvolledige positieve selectie, aangeboren-achtige functies, TCR niet-specifieke doden, onvermogen voor Geheugenvorming, en niet-aanhoudende anti-tumor effecten in vivo8,9,10,11. Deze afwijkingen hebben bezorgdheid geuit dat dergelijke cellen een verscheidenheid aan bijwerkingen kunnen veroorzaken, waaronder lymfoom en zowel huid-als botafwijkingen, indien gebruikt voor therapeutische toepassingen12,13,14 .
Voor het opnieuw maken van de fysiologische signalen ontbreekt in de huidige in vitro differentiatie systemen, tumor antigen-specifieke T-iPSC werden gedifferentieerd met behulp van een geoogste Thymus. Het klassieke foetale Thymus orgel Culture (FTOC) systeem, dat werd ontworpen om de intra-thymische ontwikkeling van T-cellen te bestuderen, werd verbeterd door gebruik te maken van een 3D-cultuur systeem dat succesvol T-cellen produceerde die het thymische onderwijs voltooiden. Deze post-Thymus T-cellen, die werden aangewezen als Thymus emigants (iTE) van IPSC, vertoonden naïeve eigenschappen15. iTE toonde proliferatie, Geheugenvorming, en adequate anti-tumor effecten in een muismodel tegen gevestigde B16 melanoom tumoren. Dit artikel beschrijft in detail het Protocol van dit roman FTOC-systeem met behulp van een 3D-cultuur systeem (Figuur 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">312693-72-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-Mercaptoethanol (1000X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">FBS</td>
			<td style="width:219px;">Gemini</td>
			<td style="width:344px;">100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Flt-3 ligand</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">hgp100</td>
			<td style="width:219px;">Genscript</td>
			<td style="width:344px;">282077-1, KVPRNQDWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-2</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">402-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-7</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM powder</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Nucleoprotein</td>
			<td style="width:219px;">Global Peptides</td>
			<td style="width:344px;">ASNENMETM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Puromycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stemfactor LIF, Mouse Recombinant</td>
			<td style="width:219px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:344px;">03-0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Cell Culture Vessels and others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">10 cm dish</td>
			<td style="width:219px;">Corning, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:344px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">12ML Syringe</td>
			<td style="width:219px;">Covidien&#160;Monoject</td>
			<td style="width:344px;">22-652-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">6 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 100um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 40um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Forceps</td>
			<td style="width:219px;">DUMONT</td>
			<td style="width:344px;">0108-5PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Lab soaker mat</td>
			<td style="width:219px;">Versi-Dry</td>
			<td style="width:344px;">Cat. EF2175CX 74018-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Membrane filters ( 0.8 &#956;m, 47diam)&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Whatman</td>
			<td style="width:344px;">WHA7408004&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Perfecta3D Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">HDP1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">U Bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">CD3-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEF-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td style="width:219px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">SCRC-1040; RRID:MGI:5007926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">OP9/N-DLL1</td>
			<td style="width:219px;">Riken Bioresource center</td>
			<td style="width:344px;">Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental mouse models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Charles River</td>
			<td style="width:344px;">Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">C57BL/6N</td>
			<td style="width:219px;">NCI/Charles River</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-1 mice</td>
			<td style="width:219px;">Overwijk et al.</td>
			<td style="width:344px;">J Exp Med 198(4):569-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-aTCR</td>
			<td style="width:219px;">Biolegend</td>
			<td style="width:344px;">109202; RRID:AB_313425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:219px;">abcam</td>
			<td style="width:344px;">ab11089; RRID:AB_369097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD4</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553730; RRID:AB_395014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD44</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">559250; RRID:AB_398661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.1</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553775; RRID:AB_395043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553772; RRID:AB_395041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD62L</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">560516; RRID:AB_1645257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD69</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">552879; RRID:AB_394508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8a</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557959; RRID:AB_396959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8b</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">550798; RRID:AB_393887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-H-2Kb</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553570; RRID:AB_394928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IFN-g&#160;</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557998; RRID:AB_396979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">554428; RRID:AB_395386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRb</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35-5961-81; RRID:AB_469741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRVb13</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553204; RRID:AB_394706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TNFa</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557644; RRID:AB_396761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants

De overname van pre-herschikt T cel receptoren (TCRs) en hun epigenetische verjonging maken geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide T cellen een veelbelovende bron voor adoptie T Cell Therapy (ACT). Klassieke in vitro methoden voor de productie van geregenereerde T-cellen van iPSC resulteren echter in ofwel aangeboren of terminaal gedifferentieerde T-cellen, die fenotypisch en functioneel verschillend zijn van naïeve T-cellen. Onlangs werd een nieuw driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem ontwikkeld om een homogene subset van CD8αβ+ antigeen-specifieke t-cellen te genereren met een naïef t-cel-achtig functioneel fenotype, inclusief de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming , en tumor onderdrukking in vivo. Dit protocol vermijdt afwijkende ontwikkelings-faten, waardoor het mogelijk is om klinisch relevante T-cellen met IPSC te genereren, aangewezen als IPSC-afgeleide Thymus emigants (iTE), terwijl het ook een krachtig hulpmiddel biedt om de volgende functies te verhelmaken die nodig zijn voor T-cel rijping na Thymus selectie.

Co-gekweekte foetale thymuses werden gesectioneerd om te analyseren of IPSC-afgeleide T-Lineage cellen kunnen migreren naar de thymus lobben. Niet-geseede controle lobben hadden een weefsel architectuur gekenmerkt door een astrocyten-achtige thymische epitheel web17, ingezet van endogene CD3+ cellen. Aan de andere kant werden Thymus lobben gesest met door IPSC afgeleide onrijpe t-cellen herbevolkt met CD3+ mononucleaire cellen, wat duidt op migratie van onrijpe t-cellen die zijn afgeleid van IPSC in de lobben (Figuur 2A).
T-cellen die in de thymus-micro omgeving zijn gemigreerd en gerijpt, worden vervolgens als iTE de. Voor het testen van hun fenotypische karakterisering, flowcytomtrische analyse van C57BL6 thymocyten, Pmel iPSC-afgeleide onrijpe T-cellen (extrathymic), en cellen die uit thymische lobben (iTE) zijn geegresseerd, werden uitgevoerd. Extrathymic T-cellen op OP9/DLL1-vertoonden CD4+CD8+ (DP) t-cellen en CD8αSP t-cellen zonder expressie van de positieve selectiemarkering MHC-i, terwijl iTE een duidelijke populatie had van CD8αSP MHC-i+ T-cel fenotype, met vermelding van hun succesvolle passage door positieve selectie voorafgaand aan egressing uit de thymus lobben. iTE consequent Express MHC-I en CD62L, die zijn markers in verband met hoge proliferatieve competentie, cytokine productie, perifere overleving, en lymfoïde homing18,19,20. Dit fenotype is consistent met m2 SP thymocyten die de meest volwassen populatie zijn van enkele positieve T-cellen in de thymus20, wat suggereert dat iTE is overgegaan door een normaal thymisch ontwikkelingsprogramma (Figuur 3). Om de efficiëntie van het genereren van de eicellen te monitoren, werden cellen die uit individuele Thymus lobben waren geïsoleerd. Op dag 7 genereerde Thymus lobben een gemiddelde van 1 x 103 Live CD8SP cd 45,1+ CD3+ iTE per dag (Figuur 3B). Van dag 6 tot dag 12 van de 3D Thymus co-cultuur wordt een vergelijkbare productiesnelheid waargenomen.
Antigeen-afhankelijke activering en secretie van cytokines werden geanalyseerd om de functionele eigenschappen van niet-volwassen T-cellen te observeren die door thymicaal opgeleide iPSC zijn verkregen. In aanwezigheid van een irrelevante peptide (nucleoproteïne), heeft Pmel-iTE geen significante hoeveelheden TNF-α, IL-2 of IFN-γ vrijgegeven. Wanneer geprikkeld met de verwant peptide voor pmel T-cellen (hgp100), bracht pmel-ITE robuuste hoeveelheden TNF-α en Il-2 uit, terwijl hij ook lage hoeveelheden IFN-γ (Figuur 4) produceerde, wat aangeeft dat thymicaal opgeleide iTE hun verwant peptide kan herkennen en afscheiden Effector cytokines met een profiel dat lijkt op die van natuurlijke recente Thymus emigants (RTE).
Om de transcriptionele verschillen tussen de met iPSC afgeleide T-Lineage cellen te onderzoeken, gedifferentieerd op OP9/DLL1-met of zonder thymische educatie (d.w.z. iTE versus Extrathymic T-cellen), werd de RNA-SEQ-analyse uitgevoerd op deze twee populaties en vergeleken naar die van DP T Lineage cellen gedifferentieerd met behulp van OP9/DLL1-(DP) en primaire naïeve CD8+ Pmel T cellen. De uitdrukking van 102 genen die cruciale rollen spelen in T-cel ontogeny, thymocyte activatie en Geheugenvorming werden geanalyseerd15,20,21,22. Een hoofdcomponent analyse van die vier onderzochte populaties toonde aan dat extrathymically gegenereerde DP en CD8SP T cellen gegroepeerd, terwijl iTE geclusterd dichter bij naïeve T-cellen (Figuur 5). Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat iTE een fenotype dichter bij naïeve T-cellen heeft dan T-Lineage cellen die worden gegenereerd door extrathymic methoden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg"> Figuur 1 : Schematisch overzicht van de differentiatie van IPSC naar iTE met behulp van OP9/dll1-en 3D Thymus cultuur. Het protocol omvat drie afzonderlijke differentiatie stappen; (Links) van IPSC cellen naar hematopoietische Lineage cellen op OP9/dll1-(dag 0 tot 6), (Midden) van hematopoietische Lineage cellen tot onvolgroeide t-cellen op OP9/dll1-met cytokines (dag 6 tot 16 – 21), en (rechts) van onvolgroeide t-cellen (dag 16 – 21) tot met behulp van een 3D Thymus cultuur systeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg"> Figuur 2 : Immuno-histochemie van Thymus lobben, geseede met door IPSC afgeleide onrijpe T-cellen. Top: H & E kleuring van een Thymus kwal met en zonder zaaien van onrijpe T-cellen met IPSC. Van tweede boven naar beneden: confocale beelden van de gesectioneerde lobben gekleurd met DAPI (Nucleus), CD3 (T-cel) en samenvoegen. Schaal staven = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg"> Figuur 3 : iTE toont een post-thymic T-cel fenotype. A) FACS analyses van thymocyten, extrathymische T cellen (OP9/dll1-co-Culture System) en pmel-iTE. De levende cellen werden op congene CD45+gesloten. CD8 SP populaties werden verder geanalyseerd voor CD62L en MHC-I expressie. B) gemiddeld aantal CD8SP cd 45,1 iTE dat 's nachts per kwab wordt geproduceerd 7 dagen na pre-seeding. Gegevens werden verzameld uit 12 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg"> Figuur 4 : iTE produceert verschillende cytokinen door antigeen-specifieke stimulatie. FACS analyses van intra cellulaire productie van cytokines door iTE. iTE werden co-gekweekt met apc's vooraf geladen met irrelevante (nucleoproteïne) of verwant (hgp100) peptide voor drie dagen. De getallen die worden weergegeven in rechtsboven kwadranten geven de percentages van de productie van cytokine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg"> Figuur 5 : Whole-transcriptome analyse onthult een verschuiving in iTE genexpressie naar een naïeve CD8 + T-celprogramma. Principe component Analysis (PCA) van RNA-SEQ-gegevens van DP, extrathymic CD8 SP, iTE en naïeve T-cellen. (Analyse van 102 genen gerelateerd aan Thymus differentiatie met behulp van openbare database GSE105110) 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

De generatie van iPSC-afgeleide thymic emigranten door een 3D thymische orgaancultuur is de eerste in vivo methode die homogene populatie van tumorantigen-specifieke naïeve-achtige T-cellen regenereert. De belangrijkste voordelen zijn de iTE zijn meer fysiologisch relevant, en deze methode meer potent dan elke andere in vivo differentiële methode om voortdurend een specifieke T-cellen te produceren. iTE is homogeen ontdaan van CD8 alfa-bèta anti-genous specifieke T-cellen met een naïef T-celachtig functioneel fenotype, inclusief de capaciteit voor proliferatie, remodiformatie en tumoronderdrukking in vivo.Het demonstreren van de procedure zal Doctor Rafiqul Islam een post-doc in mijn laboratorium. Om te beginnen met cultuur OP9/DLL1 cellen in OP9 media op 37 graden Celsius. Wanneer de cellen bereiken 80 tot 95 procent samenvloeiing, was ze een keer met een X magnesium, calcium, en fenol rood vrije PBS.Voeg vier milliliter punt nul vijf procent trypsine en incubeer op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens vier milliliter OP9-media en pipet toe om de cellaag los te koppelen en een enkele celopening te maken. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 milliliter door een celzeef van 100 micrometer.Centrifuge op 300 G en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspirate de suppurate en re-suspend de cellen in 12 milliliter van OP9 media. Dan plaat twee milliliter van de OP9/DLL1 cel suspensie in een nieuwe 10 centimeter cel cultuur Petri schotel.Voeg nog eens acht milliliter OP9-media toe. Herhaal deze passage om de twee tot drie dagen. Op dag nul oogst de geïnduceerde pluripotente stamcellen als een enkele cel suspensie door trypsinisatie.Verzamel de cellen en centrifuge op 300 G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en opnieuw opschorten de IPC's op een dichtheid van 100,000 cellen per 10 milliliter op9 media. Dan plaat 100, 000 cellen op een confluent OP9/DLL1 10 centimeter schotel.Doorgaan met incubatie op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide. Op dag drie aspirate de oude media en vervang het door 10 milliliter verse OP9 media. Op dag zes wassen elke 10 centimeter confluent OP9 schotel met 10 milliliter PBS.Voeg drie milliliter punt nul vijf procent trypsine aan elk gerecht. En drie tot vijf minuten uitbroeden bij kamertemperatuur. Voeg vier milliliter OP9-media toe en je de cellen voorzichtig verzamelen.Geef de cellen door een 100 micrometer celzeef en centrifuge op 300 G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi dan de supernatant weg. Schort de cellen opnieuw op in 10 milliliter differentiatiemedia.Plaats de celopsuspensie op een nieuwe op9/DLL1 confluent schotel van 10 centimeter. Doorgaan met incubatie bij 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide. Op dag negen, aspirate de oude media en vervang het door 10 milliliter van verse differentiatie media.Blijf de cellen uitbroeden bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Op dag 11 wanneer cardiomyocyten worden waargenomen in iPSC kolonies gebruik maken van een pipet om mechanisch los niet-aanhangende cellen. Filtreer de cellen door een 100 micrometer celzeef en centrifuge op 300 G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Na deze, aspirate de supernatant en opnieuw opschorten van de cellen in 24 milliliter van differentiatie media. Plaat van de iPSC's in een confluent OP9/DLL1 zes put plaat. Broed de cellen op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide.Verzamel op dag 15 alle niet-aanhangende cellen en filtreer ze door een celzeef van 40 micrometer. Centrifuge op 300 G en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Doorgaan met het doorgeven van de niet-aanhangende cellen om de drie tot vier dagen zoals eerder beschreven.Neem op dag zeven van dgwo-behandeling vier nieuwe gerechten van 10 centimeter. Vul elk gerecht met 20 milliliter complete media. Breng alle nitrocellulosemembranen met thymische lobben over in één schaal van 10 centimeter.Met behulp van tangen, los de individuele lobben van het membraan Waardoor ze worden ondergedompeld in de media. Broed de kwabben een uur lang bij kamertemperatuur. Breng vervolgens de thymische lobben over naar een nieuwe schaal van 10 centimeter met volledige media.En een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur. Herhaal deze overdracht en incubatie nog twee keer. Met behulp van tangen, bevestig de thymische lobben aan de schotel, terwijl met behulp van de andere hand om een 100 tot 200 micrometer diepe incisie in het midden te maken en de helft van de diameter van de kwab uit te breiden om T-cel voorloper migratie in de kwab te vergemakkelijken.Breng de thymische lobben naar een nieuwe schaal van 10 centimeter gevuld met volledige differentiatiemedia. Bij gebruik van 3D-kweekplaten met roosters op lager en hoger niveau, vul beide roosters met steriele PPS om verdamping en droging van de hangende druppels te voorkomen. Volgende overdracht 30 microliters van volledige media met een DGWO behandeld thymische kwab in elke put van de 3D-cultuur plaat.Verzamel de niet-aanhangende T-lijncellen uit de CO-cultuur OP9/DLL1. En schort de cellen opnieuw op met een dichtheid van 2.000 tot 5.000 T cellijncellen per 20 microliter media. Voeg 20 microliter van de T-lijncelsuspensie toe aan elke thymische kwab in de 3D-kweekplaat.Incubeer 's nachts bij 37 graden celsius met vijf procent kooldioxide. Zet de volgende dag de P200 pipet op 30 microliter. Pipet de media in elke put op en neer meerdere malen om alle cellen rond de thymische lobben te verwijderen.Dan aspirate de media van elke put en vervang het van 30 microliters van complete media. Herhaal dit proces, pipeting, verwijderen, en het vervangen van de media vijf tot zeven keer om eventuele extra onvolwassen T-cellen die niet migreren naar de lobben te verwijderen. Doorgaan met het uitbroeden van de lobben, zorg ervoor dat 25 tot 30 microliter van de media per dag te veranderen.Gebruik op dag vier of vijf lichte microscopie om de vorming van een halo van door iPSC afgeleide thymische emigranten rond de kwabben te bevestigen. Verzamel de iTE's dagelijks door media te pipetten zonder lobieverstoring. Verander elke dag de media en zet de collectie tot ongeveer 12 dagen voort.Geoogste iTE's zijn klaar voor moleculaire analyse of in vivo transplantatie-experimenten. In deze studie worden co-gekweekte foetale thymuses gesectied om te analyseren of iPSC afgeleide T-cellijncellen kunnen migreren naar de thymische kwabben. Niet-gezaaide controle lobben hebben een weefsel architectuur gekenmerkt door een astrocyten-achtige thymische epitheel web ingezet van endogene CD3 positieve cellen.Thymische kwabben die met iPSC afgeleide onrijpe T-cellen zijn gezaaid, worden echter opnieuw bevolkt met CD3-positieve mononucleaire cellen die aangeven dat er uit iPSC afgeleide onrijpe T-cellen in de lobben worden geïmpregneerd. T-cellen die migreren naar, en rijpen, binnen de thymische micro-omgeving vervolgens uitgang als iTE. Flow cytometrische analyse wordt vervolgens gebruikt om de fenotypische karakterisering van verschillende cellen te testen.Extra thymische T-cellen tonen CD4, CD8 dubbel positieve T-cellen en CD8 alpha single positieve T-cellen zonder expressie van de positieve selectiemarkering, MHC Class One terwijl iTE een homogene populatie is van CD8 alpha single positieve MHC Class One positief T-cel fenotype dat hun succesvolle passage door positieve selectie aangeeft voordat uit de thymische kwab wordt gestoten. iTE hebben antigeen-specificiteit tegen cognate peptide. iTE co-gekweekt met antigeen presenteren cellen voorgeladen met een irrelevant peptide als nucleoproteïne niet laten zien in een cellulaire productie van cytokinen.Maar iTE co-cultuur antigeen presenteren cellen pre-gepulseerd met cognate peptide GP100, produceren intracellularly TNF alpha interleukine ii en interferon gamma. Houd er rekening mee dat de open lijncelcultuur sterk afhankelijk is van de ABS-sleuf. Gegenereerde iTE kan worden gebruikt in elke andere test die werkt met conventionele T-cellen.Bijvoorbeeld, T cel clearing test, cytokine productie test, in vivo tumor regressie proeven, T cel differentiatie studie, et cetera. Deze technologie kan worden toegepast op vele immunologische of dergelijke projecten. Inclusief een T-celdifferentiatie, pulstiming T-celrijping en de generatie van antigeenspecifieke T-cel uit hematocrietvererver of stamcel.Na het bekijken van deze video moet de kijker begrijpen hoe te genereren geïnduceerde pluripotente, stamcel afgeleid, tumor antigeen specifieke thymic emigranten met behulp van een 3D thymic orgaancultuur systeem.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...