Name: a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

Nous remercions Hiroshi Kawamoto et Kyoko Masuda d'avoir gentiment fourni la lignée cellulaire OP9/DLL1. Nous remercions Alan B. Hoofring et Erina Z. Il pour l'assistance graphique. Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros du National Cancer Institute des États-Unis (ZIA BC010763) et le cancer Moonshot programme pour le Center for Cell-based Therapy au NCI, NIH. Le travail a également été soutenu par la Fondation de la famille Milstein.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux du National Cancer Institute (NCI) et réalisées conformément aux lignes directrices des NIH.
1. Préparation des cellules OP9/DLL1 pour la co-culture avec iPSC
<ol><li>Culture Cellules OP9/DLL1 dans les milieux OP9 (milieu essentiel minimum [-MEM] - 20% non-chaleur inactivée sérique bovine inactivée [FBS] - 1x pénicilline-streptomycine - acide ascorbique [50 ng/mL] et mono-thioglycérol [100 nM]) à 37 oC. Lorsque les cellules OP9/DLL1 atteignent 80 à 95 % de confluence, lavez-les une fois avec 1x magnésium, calcium et phosphate sans phénol à saline (ci-après appelé PBS).</li>
	<li>Ajouter 4 ml de trypsine de 0,05 % et incuber 5 min à 37 oC. Ensuite, ajoutez 4 mL de support OP9, dissocier la couche cellulaire par pipetting pour faire une suspension de cellule unique.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml à travers une passoire cellulaire de 100 m. Centrifugeàeur à 300 x g pendant 5 min à 4 oC, aspirez le supernatant, et resuspend dans 12 mL de médias OP9.</li>
	<li>Plaque 2 mL de suspension de cellules OP9/DLL1 sur un nouveau plat Petri de culture cellulaire de 10 cm et ajouter 8 mL supplémentaires de support OP9. Répétez le passage tous les 2 à 3 jours. REMARQUE: La qualité du FBS et des conditions de culture est essentielle pour maintenir l'expansion des cellules OP9/DLL1 sans perdre leur capacité à soutenir la différenciation iPSC. Par conséquent, il est recommandé de pré-évaluer le sort de FBS et le passage uniformément à 80% de confluence pour empêcher la différenciation cellulaire et la sénescence. Il est également important de faire suffisamment de bouillon congelé de cellules OP9/DLL1 et de décongeler un nouveau stock toutes les 4 à 6 semaines.</li>
</ol>2. Différenciation in vitro de l'iPSC en cellules T immatures
<ol><li>
Le jour 0, commencez la co-culture iPSC sur les plats de confluent OP9/DLL1.
	<ol>
<li>Récoltez l'iPSC comme suspension à une seule cellule par trypsinisation (5 min dans 0,05 % de trypsine à 37 oC), collectez les cellules et centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
		<li>Aspirez les cellules supernatant et resuspend à 1.0 x 105 iPSC par 10 ml de médias OP9. Assiette 1,0 x 105 iPSC sur un plat confluent OP9/DLL1 de 10 cm. REMARQUE: Les plats OP9/DLL1 de 10 cm sont utilisés pour la différenciation iPSC lorsqu'ils atteignent 90 à 100 % de confluence. Les différences de confluence peuvent affecter l'efficacité de la différenciation iPSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le jour 3, aspirer les vieux médias et remplacer par 10 ml de nouveaux médias OP9.</li>
	<li>
Le jour 6, cellules de passage.
	<ol>
<li>Laver chaque plat OP9 confluent de 10 cm avec 10 ml de PBS. Ajouter 3 ml de trypsine de 0,05 % par plat et incuber pendant 3 à 5 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Ajouter 4 mL de support OP9 et collecter les cellules par pipetting douce. Passer les cellules à travers une passoire cellulaire de 100 m et une centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 10 mL de supports de différenciation (op9 média avec 5 ng/mL souris Flt3 ligand [FLT3L] et 5 ng/mL souris IL-7) et suspension de cellules de plaque sur un nouveau plat de 10 cm OP9/DLL1 confluent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le jour 9, aspirez les vieux médias et remplacez-les par 10 ml de supports de différenciation fraîche.</li>
	<li>
Le jour 11, lorsque les cardiomyocytes sont observés dans les colonies iPSC, détachez mécaniquement les cellules non adhérentes par pipetage et filtrez à travers une passoire cellulaire de 100 m. Faire tourner à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
	<ol>
<li>Aspirer le supernatant et resuspendre en 24 ml de médias de différenciation. Plaque iPSC dans une plaque de 6 puits OP9/DLL1 confluent (4 mL/puits).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Le jour 15, collectez toutes les cellules non adhérentes et filtrez à travers une passoire cellulaire de 40 m.
	<ol>
<li>Faire tourner à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
		<li>Continuer à transmettre les cellules non adhérentes tous les 3 à 4 jours en répétant l'étape 2.5.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D Culture d'orgue thymique pour générer iTE
<ol><li>Récoltez les lobes thymiques foetaux de souris et déployez des lymphocytes endogènes par le traitement de la déoxyguanosine (dGUO) comme précédemment décrit16.</li>
	<li>Le jour 7 du traitement dGUO, prenez quatre nouveaux plats de 10 cm et remplissez chacun avec 20 ml de milieux complets (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] - 10 % FBS - 1x L-alanyl-L-glutamine - 1x pyruvate de sodium - 1x milieu essentiel minimum avec acides aminés non essentiels (MEM-NEAA) 1x pénicilline-streptomycine -[1:1000] éthanol 2 mercapto).</li>
	<li>Transférer toutes les membranes de nitrocellulose avec des lobes thymiques dans un plat de 10 cm. Détachez les lobes individuels de la membrane avec des forceps, ce qui leur permet d'être immergés dans les médias. Jeter les membranes. Incuber pour 1 h à RT.</li>
	<li>Transférer les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 cm avec un support complet et couver pendant 1 h à RT. Répétez cette étape 2 fois de plus.</li>
	<li>À l'aide de forceps, fixer les lobes thymiques au plat (un à la fois), et d'autre part faire une incision de 100 à 200 m de profondeur dans le centre et l'extension de la moitié du diamètre du lobe pour faciliter la migration de l'ancêtre des cellules T dans le lobe.</li>
	<li>Transférer les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 cm rempli d'un support de différenciation complet (média complet de 5 ng/mL souris IL-7 à 5 ng/mL souris FLT3L 5 ng/mL SCF).</li>
	<li>Optionnellement, si vous utilisez des plaques de culture 3D avec des grilles de niveau inférieur et supérieur, remplissez les deux grilles de PBS stérile pour empêcher l'évaporation et le séchage des gouttes suspendues.</li>
	<li>Transférer 30 l de support complet contenant un lobe thymique traité par dGuo de l'étape 3.6 dans chaque puits de plaque de culture 3D.</li>
	<li>Recueillir les cellules de lignée T non adhérentes (cellules T immatures dérivées de l'iPSC) à partir de la co-culture OP9/DLL1 (jours 16-21) (étape 2.6.2) et la ressurphase à 2-5 x 103 T cellules de lignée par 20 'L media.</li>
	<li>Ajouter 20 l de suspension de cellule de lignée T à chaque lobe thymique dans la plaque de culture 3D. Incuber toute la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2.
</li>
	<li>Définir la tuyauterie P200 à 30 L et aspirer le support après pipetting plusieurs fois de chaque puits pour enlever toutes les cellules entourant les lobes thymiques. Jetez les supports et ajoutez 30 l de supports complets. Répétez cette procédure 5 à 7 fois pour éliminer les lymphocytes T non plus immatures qui ne migrent pas dans les lobes. Changer 25 à 30 l de médias tous les jours par la suite.</li>
	<li>Confirmer la formation d'un halo d'émigrants thymiques dérivés de l'iPSC (iTE) autour des lobes à partir du jour 4-5 par microscopie légère.</li>
	<li>Recueillir iTE tous les jours par des médias pipetting sans perturbation lobe. Changez de média tous les jours et continuez à collectioner jusqu'à environ 12 jours.</li>
	<li>Les iTE récoltés sont prêts à être utilisés pour des analyses moléculaires (figure2, Figure 3, Figure 4et Figure 5) ou des expériences de transplantation in vivo.</li>
</ol>4. Préparation des cellules de présentation d'antigène (APC)
<ol><li>Sacrifiez une souris C57BL/6 par dislocation cervicale et placez sur un tapis de soaker de laboratoire comme décrit ci-dessus.</li>
	<li>Retirez la rate et placez-la sur une passoire cellulaire de 100 m. Comprimer la rate sur la passoire à l'aide d'un piston à seringue de 12 ml pour faire une suspension à une seule cellule.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire à travers une passoire stérile de 40 m. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 5 min à 4 oC pour granuler les cellules.</li>
	<li>Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 2 ml de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) pour exclure les globules rouges (RBC). Incuber pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Désinguer le tampon de lyse ACK en ajoutant 10 ml de PBS. Pelleter les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml de support complet et transférer dans un plat stérile Petri de 10 cm.</li>
	<li>Irradier les splenocytes avec 3500 rad à l'aide d'un dispositif d'irradiation (rayonnement) pour prévenir la prolifération cellulaire.</li>
	<li>Remettre immédiatement les cellules irradiées dans un incubateur et une culture de 37 oC pendant la nuit.</li>
	<li>Utilisez des cellules irradiées comme APC ou congelez-les dans le banquier cellulaire.</li>
</ol>5. Pulsing APC avec Antigène
<ol><li>Comptez en direct APC irradié à l'aide d'un hémocytomètre Neubauer et de colorant bleu trypan. Incuber APC avec des peptides (hgp100) ou nucléoprotéine pendant 30 min à 37 oC.</li>
	<li>Laver APC deux fois avec 10 ml de PBS pour enlever tout peptide supplémentaire.</li>
	<li>Comptez iTE et mélangez avec APC dans un rapport de 1:1 dans les médias complets avec 100 UI IL-2 et 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 l du mélange de cellules (concentration totale : 1 x 106 cellules/mL) dans chaque puits d'une plaque et d'une culture de puits U 96 ultra-faible d'attachement u 96 pendant 48 h à 37 oC.</li>
	<li>Après 48 h, transférer les cellules dans une nouvelle plaque à l'aide d'une pipette multicanal et passer tous les 2 à 3 jours par la suite.</li>
	<li>
Le jour 3, analyser le profil de sécrétion de cytokine en taclant les cellules avec un anticorps intracellulaire et analyser par cytométrie de flux (Figure 3).
	<ol>
<li>Ajouter 0,67 l/mL d'inhibiteur du transport protéique (p. ex. GolgiStop) et incuber à 37 oC pendant 6 h pour améliorer l'accumulation intracellulaire de cytokines. Laver avec 10 ml de PBS.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 3 ml de PBS froid (4 oC) et ajouter lentement 1 ml de solution froide de paraformaldéhyde (PFA).</li>
		<li>Après 10 min, faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 oC, jeter le supernatant et laver avec 10 ml de PBS.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 1 mL de PBS 1 % DE FBS et 0,1 % de surfactant nonionique, et placer dans 4 oC pendant 10 à 15 min.</li>
		<li>Ajouter les anticorps, protéger les échantillons de la lumière et les placer dans 4 oC pendant 30 min.</li>
		<li>Faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 oC, jeter le supernatant et laver avec 10 ml de PBS.</li>
		<li>Faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 oC et resuspendre les cellules dans 1 ml de PBS. Les cellules sont prêtes à être analysées dans un cytomètre de flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. 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Les auteurs Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen et Nicholas P. Restifo sont les inventeurs de la demande internationale de brevet en instance PCT/US2017/65986, déposée le 13 décembre 2017, intitulée « Methods of Preparing an Isolated or Purified Population of Thymic Emigrant Cells et les méthodes de traitement utilisant la même chose.

L'utilisation de T-iPSC pour régénérer les lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral peut surmonter bon nombre des obstacles actuels de l'ACT en générant de jeunes cellules avec une meilleure persistance. Bien que plusieurs méthodes utilisant le système de co-culture OP9/DLL1 aient été rapportées pour produire des cellules CD8 SP6,7,10,13 qui expriment des molécules cD8 et des TCR spécifiques à l'antigène tumoral, gène global les modèles d'expression et l'analyse fonctionnelle montrent que ces cellules CD8 SP régénérées par extrathymsont sont différentes des lymphocytes T naïfs (Figure 4). Ici, nous décrivons un système de culture thymique 3D qui peut produire des émigrants thymiques iPSC-dérivés (iTE) avec la fidélité et l'homogénéité élevées de T-iPSC murine. iTE ressemblent à des lymphocytes T naïfs dans le modèle global d'expression de gène et dans la fonctionnalité, telle que la formation de mémoire et l'effet anti-tumoral in vivo contre la tumeur établie15.
Le système FTOC classique est un moyen de récapituler la sélection thymique invitro. Il a été utilisé pour étudier le développement intra-thymique des thymocytes23, et il ya quelques rapports de FTOC utilisé pour générer RTE24. Cependant, le système FTOC comporte plusieurs limites. Pour faire face au manque d'oxygène dans une culture d'organe artificiel, plusieurs groupes ont utilisé soit une culture à base de membrane semi-sèche23, soit des systèmes de culture de submersion à haute teneur en oxygène25. Cependant, aucune méthode actuelle ne peut constamment générer une population homogène de lymphocytes T post-thymiques. Pour surmonter les limites du système FTOC classique, nous avons conçu un système de culture thymique 3D qui apporte des améliorations techniques par rapport aux méthodes conventionnelles15. Par exemple, en utilisant notre méthode de culture thymique 3D, l'échange maximal d'oxygène et l'absence de stress mécanique de surface-lobe maintiennent les lobes thymiques dans un environnement plus physiologique. En outre, la culture à long terme permet aux lymphocytes T matures d'sortir naturellement des lobes thymiques. Enfin, l'observation en temps réel et la micro-manipulation permettent l'échange de médias et une collection constante d'iTE sans déranger physiquement les lobes thymiques. Ainsi, la méthode de culture thymique 3D fournit des améliorations techniques significatives ainsi qu'une avenue pour étudier les lymphocytes T naïfs sélectionnés thymiquement qui n'étaient pas précédemment disponibles.
Il y a plusieurs points clés pour la génération réussie d'iTE utilisant ce système de culture thymique 3D. La qualité du FBS et des conditions de culture est essentielle pour maintenir l'expansion des cellules OP9/DLL1 sans perdre leur capacité à soutenir la différenciation iPSC. Par conséquent, nous recommandons la pré-évaluation du lot fbS aussi bien que le passage uniformément à la confluence de 80% pour empêcher la différenciation et la sénescence de cellules. En outre, une culture confluente OP9/DLL1 est nécessaire pour la différenciation in vitro de l'iPSC en cellules T immatures, car les différences de confluence peuvent affecter leur efficacité. Enfin, l'âge embryonnaire des lobes thymiques est crucial pour la génération d'iTE. Nous vous recommandons d'utiliser E14.5 - 15.5 lobes thymiques.
Comme pour tout nouveau protocole, cette méthode a des limites et est sujette à amélioration. La technique de culture présentée ici génère environ 1000 iTE par lobe thymique par jour pendant une période de deux semaines. Une production accrue d'ITI peut être possible avec d'autres modifications, y compris l'optimisation de la concentration d'oxygène, du volume des médias et du type de plaque de culture 3D. L'addition ou l'élimination des cytokines, ainsi que des changements dans la concentration de cytokine, peuvent également contribuer à l'amélioration du rendement iTE.
Étant donné que le système de culture thymique 3D présenté ici peut générer des émigrants thymiques dans un système complètement ex vivo, cette technique peut être appliquée à une variété de projets de recherche sur le transfert de cellules immunologiques et adoptives, y compris, mais sans s'y limiter. différenciation cellulaire, maturation post-thymique des lymphocytes T, et génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène à partir d'ancêtres hématopoïétiques ou de cellules souches. Bien que cette méthode ne s'applique pas directement aux échantillons humains, l'iTE et le système de culture thymique 3D ont un grand potentiel pour élucider les mécanismes moléculaires de sélection positive et négative et peuvent faciliter la création d'un système de culture qui permet la génération des cellules Naïves naïfs-spécifiques d'antigène-spécifiques cliniquement pertinentes pour ACT.

La thérapie par cellules T adoptives (ACT) peut être un traitement efficace pour certains patients atteints d'un cancer avancé. Malheureusement, beaucoup de patients n'éprouvent pas la régression de tumeur, et les cellules transférées ne persistent pas après perfusion. Cela peut être dû à la qualité des lymphocytes T infusés. Un modèle de souris ACT a montré que par rapport aux cellules T de mémoire centrale naïfs ou moins différenciées, les cellules effectrices différenciées en phase terminale sont moins puissantes en raison d'une faible persistance in vivo1, une observation également étayée par des données cliniques2, 3.
Dans un effort pour améliorer l'efficacité de l'ACT actuel, les cellules souches pluripotentes induites par les lymphocytes T (T-iPSC) ont été étudiées en profondeur4,5. Lorsque les lymphocytes T sont reprogrammés en T-iPSC et redifférenciés en lymphocytes T, la configuration réarrangée des gènes TCR est héritée par T-iPSC, puis par les lymphocytes T redifférenciés. Par conséquent, la capacité de T-iPSC à subir une expansion in vitro illimitée permet la reproduction efficace de lymphocytes T immatures porteurs des récepteurs de cellules T spécifiques au néoantigène (TCR) lorsque ces cellules sont conçues à partir de cellules T spécifiques à l'antigène tumoral6 ,7. Cependant, la méthode précise pour la différenciation de T-iPSC en cellules T mûres, qui permettrait la production des cellules T antigène-spécifiques de cancer avec un phénotype moins différencié et une meilleure puissance anti-tumorale, reste à élucider.
La différenciation T-iPSC utilisant la co-culture des cellules stromales murines OP9 surexprimant l'homme Notch ligand DLL1 est une méthode bien établie pour produire des lymphocytes T in vitro6,7. Chez la souris et l'homme, ce système de co-culture peut constamment différencier iPSC, récapitulant ainsi les événements de développement du stade blastocyste jusqu'à l'étape immature de lignée de cellules T6,7. Malgré ces avancées biotechnologiques, la différenciation physiologique après l'étape CD4etCD8et double positif (DP) est encore difficile à réaliser. L'une des raisons est que in vivo CD4-CD8- et CD4-CD8- single positif (SP) lymphocytes T sont générés dans le thymus, un organe responsable de la maturation et la sélection des lymphocytes T qui ont l'antigène-spécificité étrangère, mais pas l'auto-réactivité8. Ces processus sélectifs sont définis comme une sélection positive et négative, respectivement. Cependant, la plupart des mécanismes moléculaires nécessaires à la maturation des lymphocytes T dans le thymus ne sont pas encore entièrement compris, ce qui rend difficile de reconstruire ce processus in vitro. Dans une tentative de surmonter cet obstacle physiologique, plusieurs groupes ont stimulé le complexe de TCR utilisant des anticorps anti-CD3 ou des peptides agonistes. Ces techniques in vitro génèrent des produits cellulaires qui expriment des marqueurs clés des lymphocytes T, comme le CD3, le CD8MD, le TCRMD et le CD62L, tout en conservant la spécificité de l'antigène tumoral. Malheureusement, les lymphocytes T générés par ces méthodes extrathymiques constituent une large population hétérogène de cellules caractérisées par une sélection positive incomplète, des caractéristiques innées, un tuat non spécifique du TCR, une incapacité à former la mémoire et effets antitumorals non persistants in vivo8,9,10,11. Ces anomalies ont soulevé des préoccupations que ces cellules pourraient déclencher une variété d'effets secondaires, y compris le lymphome et les anomalies de la peau et des os, si elles sont utilisées pour des applications thérapeutiques12,13,14 .
Pour recréer les signaux physiologiques manquants dans les systèmes actuels de différenciation in vitro, t-iPSC antigène-spécifique de tumeur ont été différenciés utilisant un thymus moissonné. Le système classique de culture d'organe de thymus foetal (FTOC), qui a été conçu pour étudier le développement intra-thymique des cellules T, a été amélioré en utilisant un système de culture 3D qui a produit avec succès des cellules T qui ont complété l'éducation thymique. Ces lymphocytes T post-thymiques, qui ont été désignés comme émigrants thymiques dérivés de l'iPSC (iTE), présentaient des propriétés naïves15. iTE a montré la prolifération, la formation de mémoire, et les effets antitumorals proportionnels dans un modèle de souris contre les tumeurs établies de mélanome de B16. Cet article décrit en détail le protocole de ce nouveau système FTOC à l'aide d'un système de culture 3D (figure 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">312693-72-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-Mercaptoethanol (1000X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">FBS</td>
			<td style="width:219px;">Gemini</td>
			<td style="width:344px;">100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Flt-3 ligand</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">hgp100</td>
			<td style="width:219px;">Genscript</td>
			<td style="width:344px;">282077-1, KVPRNQDWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-2</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">402-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-7</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM powder</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Nucleoprotein</td>
			<td style="width:219px;">Global Peptides</td>
			<td style="width:344px;">ASNENMETM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Puromycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stemfactor LIF, Mouse Recombinant</td>
			<td style="width:219px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:344px;">03-0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Cell Culture Vessels and others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">10 cm dish</td>
			<td style="width:219px;">Corning, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:344px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">12ML Syringe</td>
			<td style="width:219px;">Covidien&#160;Monoject</td>
			<td style="width:344px;">22-652-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">6 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 100um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 40um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Forceps</td>
			<td style="width:219px;">DUMONT</td>
			<td style="width:344px;">0108-5PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Lab soaker mat</td>
			<td style="width:219px;">Versi-Dry</td>
			<td style="width:344px;">Cat. EF2175CX 74018-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Membrane filters ( 0.8 &#956;m, 47diam)&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Whatman</td>
			<td style="width:344px;">WHA7408004&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Perfecta3D Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">HDP1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">U Bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">CD3-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEF-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td style="width:219px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">SCRC-1040; RRID:MGI:5007926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">OP9/N-DLL1</td>
			<td style="width:219px;">Riken Bioresource center</td>
			<td style="width:344px;">Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental mouse models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Charles River</td>
			<td style="width:344px;">Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">C57BL/6N</td>
			<td style="width:219px;">NCI/Charles River</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-1 mice</td>
			<td style="width:219px;">Overwijk et al.</td>
			<td style="width:344px;">J Exp Med 198(4):569-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-aTCR</td>
			<td style="width:219px;">Biolegend</td>
			<td style="width:344px;">109202; RRID:AB_313425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:219px;">abcam</td>
			<td style="width:344px;">ab11089; RRID:AB_369097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD4</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553730; RRID:AB_395014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD44</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">559250; RRID:AB_398661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.1</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553775; RRID:AB_395043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553772; RRID:AB_395041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD62L</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">560516; RRID:AB_1645257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD69</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">552879; RRID:AB_394508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8a</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557959; RRID:AB_396959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8b</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">550798; RRID:AB_393887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-H-2Kb</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553570; RRID:AB_394928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IFN-g&#160;</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557998; RRID:AB_396979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">554428; RRID:AB_395386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRb</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35-5961-81; RRID:AB_469741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRVb13</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553204; RRID:AB_394706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TNFa</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557644; RRID:AB_396761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants

L'héritage des récepteurs pré-arrangés de cellules T (TCRs) et de leur rajeunissement épigénétique font des cellules souches pluripotentes induites (iPSC)-dérivées des cellules T une source prometteuse pour la thérapie de cellules T adoptives (ACT). Cependant, les méthodes in vitro classiques pour produire des lymphocytes T régénérés à partir d'iPSC donnent lieu à des lymphocytes T innés ou différenciés en phase terminale, qui sont phénotypiquement et fonctionnellement distincts des lymphocytes T naïfs. Récemment, un nouveau système de culture thymique tridimensionnel (3D) a été développé pour générer un sous-ensemble homogène de cellules T spécifiques à l'antigène CD8MD avec un phénotype fonctionnel naïf ressemblant à une cellule T, y compris la capacité de prolifération, la formation de la mémoire. , et la suppression tumorale in vivo. Ce protocole évite les destins développementaux aberrants, permettant la génération de lymphocytes T cliniquement pertinents dérivés de l'iPSC, désignés comme émigrants thymiques dérivés de l'iPSC (iTE), tout en fournissant un outil puissant pour élucider les fonctions ultérieures nécessaires. pour la maturation des lymphocytes T après sélection thymique.

Des thymus foetaux co-cultivés ont été sectionnés pour analyser si les cellules de lignée T iPSC-dérivées peuvent migrer dans les lobes thymiques. Les lobes témoins non ensedus avaient une architecture tissulaire caractérisée par une toile épithéliale thymique de l'astrocyte17, déployée de cellules endogènes CD3. D'autre part, les lobes thymiques ensemancés avec des lymphocytes T immatures dérivés de l'iPSC ont été repeuplés avec des cellules mononucléaires CD3, ce qui indique la migration des lymphocytes T immatures dérivés de l'iPSC dans les lobes (Figure 2A).
Les lymphocytes T qui ont migré et mûri dans le microenvironnement thymique ont par la suite quitté l'iTE. Pour tester leur caractérisation phénotypique, l'analyse cytométrique de flux des thymocytes c57BL6, des cellules T immatures dérivées de Pmel iPSC (extrathymique), et des cellules qui ont eded des lobes thymiques (iTE) a été exécutée. Les lymphocytes T extrathymiques sur OP9/DLL1 ont montré des cellules T CD4etCD8 et CD8-SP sans expression du marqueur de sélection positif MHC-I, alors que l'iTE avait une population claire de phénotype de cellules CD8-SP MHC-I, ce qui indique leur passage réussi par la sélection positive avant d'égresser des lobes thymiques. iTE exprime constamment MHC-I et CD62L, qui sont des marqueurs associés à la compétence de prolifération élevée, la production de cytokine, la survie périphérique, et le homing lymphoïde18,19,20. Ce phénotype est compatible avec les thymocytes M2 SP qui sont la population la plus mature de cellules T positives simples dans le thymus20, ce qui suggère que iTE ont fait la transition à travers un programme de développement thymique normal (Figure 3). Pour surveiller l'efficacité de la génération d'iTE, les cellules qui avaient edgeed des lobes thymiques individuels ont été isolées. Le jour 7, les lobes thymiques ont généré en moyenne 1 x 103 CD45.1 CD45.1en direct, CD3et iTE par jour (figure3B). Un taux similaire de production d'ITT est observé du jour 6 au jour 12 de la co-culture thymique 3D.
L'activation et la sécrétion antigène-dépendantes des cytokines ont été analysées pour observer les propriétés fonctionnelles des cellules T immatures iPSC-dérivées thymically instruites. En présence d'un peptide non pertinent (nucléoprotéine), Pmel-iTE n'a pas libéré de quantités significatives de TNF-, D'IL-2 ou d'IFN. Lorsqu'il est stimulé avec le peptide cognate pour les lymphocytes T Pmel (hgp100), Pmel-iTE a libéré des quantités robustes de TNF-et IL-2, tout en produisant de faibles quantités d'IFN-( figure4), indiquant que l'iTE thymiquement éduqué peut reconnaître leur peptide cognate et sécréte effector cytokines avec un profil ressemblant à celui des émigrants thymiques naturels récents (RTE).
Pour examiner les différences transcriptionnelles entre les cellules t dérivées de l'iPSC différenciées sur OP9/DLL1 avec ou sans éducation thymique (c.-à-d. iTE par rapport aux lymphocytes T extrathymiques), l'analyse RNA-seq a été effectuée sur ces deux populations et comparée à celle des cellules de lignée DP T différenciées à l'aide de cellules T OP9/DLL1 (DP) et de CD8 naïves primaires. L'expression de 102 gènes qui jouent des rôles cruciaux dans l'ontogenèse des lymphocytes T, l'activation du thymocyte et la formation de la mémoire ont été analysées15,20,21,22. Une analyse principale des composants de ces quatre populations étudiées a démontré que les cellules DP et CD8SP T générées par extrathymique se sont regroupées, tandis que l'ITE s'est regroupée plus près des lymphocytes T naïfs (figure5). Collectivement, ces données démontrent que l'iTE a un phénotype plus proche des cellules T naïfs que les cellules de lignée T générées par des méthodes extrathymiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg"> Figure 1 : Aperçu schématique de la différenciation de l'iPSC à iTE utilisant la culture thymique OP9/DLL1 et 3D. Le protocole comporte trois étapes de différenciation distinctes; (Gauche) des cellules iPSC aux cellules de lignée hématopoïétique sur OP9/DLL1 (jour 0 à 6), (Moyen) des cellules de lignée hématopoïétiqueaux aux cellules T immatures sur OP9/DLL1 avec des cytokines (jour 6 à 16-21), et (droite) des cellules T immatures (jour 16-21) à iTE à l'aide d'un système de culture thymique 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg"> Figure 2 : Immuno-histochimie des lobes thymiques enseiscés avec les lymphocytes T immatures iPSC-dérivés. En haut : coloration d'un lobe thymique avec et sans ensemencement de lymphocytes T immatures dérivés de l'iPSC. Du deuxième en bas : images confocales des lobes sectionnés tachés de DAPI (noyau), CD3 (cellule T) et fusionnent. Barres d'échelle de 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg"> Figure 3 : iTE montrent un phénotype post-thymique de cellule T. (A) Les analyses FACS des thymocytes, des lymphocytes T extrathymiques (système de co-culture OP9/DLL1) et Pmel-iTE. Les cellules vivantes ont été fermées sur le CD45congénique. Les populations de CD8 SP ont été analysées plus en détail pour l'expression CD62L et MHC-I. (B) Nombre moyen de CD8SP CD45.1 iTE produit pendant la nuit par lobe 7 jours après le pré-ensemencement. Les données ont été recueillies à partir de 12 expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg"> Figure 4 : iTE produit diverses cytokines par stimulation antigène-spécifique. Analyse facS de la production intracellulaire de cytokines par iTE. iTE ont été co-cultivés avec des APC préchargés avec non pertinent (nucléoprotéine) ou cognate (hgp100) peptide pendant trois jours. Les nombres indiqués dans les quadrants supérieurs droit indiquent les pourcentages de cytokine productrice d'ITT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg"> Figure 5 : L'analyse de la transcription complète révèle un changement dans l'expression du gène iTE vers un CD8 naïf + Programme de lymphocytes T. Analyse des composants principaux (PCA) des données d'ARN-seq de DP, Extrathymic CD8 SP, iTE, et naïfs lymphocytes T. (Analyse de 102 gènes liés à la différenciation thymique à l'aide de la base de données publique GSE105110) 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

Cet article décrit une nouvelle méthode pour produire des émigrants thymiques pluripotents induits par l'antigène-spécifique de tumeur (iTE) par un système de culture thymique tridimensionnel (3D). iTE sont un sous-ensemble homogène de lymphocytes T étroitement liés aux lymphocytes T naïfs avec la capacité de prolifération, de formation de mémoire, et de suppression de tumeur.

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

La génération d’émigrants thymiques dérivés de l’iPSC par une culture d’organe thymique 3D est la première méthode in vivo régénérant la population homogène des cellules T naïves spécifiques à l’antigène tumoral. Les principaux avantages sont l’iTE sont plus physiologiquement pertinents, et cette méthode plus est plus puissant que toute autre méthode différentielle in vivo pour produire constamment une cellule T spécifique. l’iTE est le renversement homogène des cellules T spécifiques d’anti-genous alpha-bêta de CD8 avec un phénotype fonctionnel naïf de cellule T-comme, y compris la capacité de prolifération, de remodiformation, et de suppression de tumeur in vivo.Démontrer la procédure sera le Docteur Rafiqul Islam un post-doc dans mon laboratoire. Pour commencer la culture OP9/DLL1 cellules dans les médias OP9 à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules atteignent 80 à 95 pour cent de confluence, lavez-les une fois avec un X magnésium, calcium, et phénol rouge PBS libre.Ajouter quatre millilitres de point zéro cinq pour cent trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite quatre millilitres de supports op9 et de pipet pour dissocier la couche cellulaire et faire une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire à cellules de 100 micromètres.Centrifugeuse à 300 G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez les cellules suppurées et suspendez à nouveau les cellules en 12 millilitres de supports OP9. Puis plaque deux millilitres de la suspension cellulaire OP9/DLL1 dans une nouvelle boîte de 10 centimètres de culture cellulaire Petri.Ajoutez huit millilitres supplémentaires de supports OP9. Répétez ce passage tous les deux ou trois jours. Le jour zéro récolte les cellules souches pluripotentes induites comme une suspension cellulaire unique par trypsinisation.Recueillir les cellules et la centrifugeuse à 300 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez le supernatant et suspendez les CIP à une densité de 100 000 cellules par 10 millilitres de médias OP9. Ensuite, plaquez 100 000 cellules sur un plat confluent OP9/DLL1 de 10 centimètres.Poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le troisième jour aspirer les anciens médias et le remplacer par 10 millilitres de nouveaux médias OP9. Le sixième jour laver chaque plat OP9 confluent de 10 centimètres avec 10 millilitres de PBS.Ajouter trois millilitres de trypsine point zéro cinq pour cent à chaque plat. Et incuber pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Ajouter quatre millilitres de supports OP9 et pipet doucement pour recueillir les cellules.Passez les cellules à travers une passoire et une centrifugeuse de cellules de 100 micromètres à 300 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis jetez le surnatant. Suspendre à nouveau les cellules en 10 millilitres de médias de différenciation.Plaquez la suspension cellulaire sur un nouveau plat confluent OP9/DLL1 de 10 centimètres. Poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le neuvième jour, aspirez les vieux médias et remplacez-les par 10 millilitres de médias de différenciation frais.Continuer à couver les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2. Le jour 11, lorsque des cardiomyocytes sont observés dans les colonies d’iPSC, utilisez un pipet pour détacher mécaniquement les cellules non adhérentes. Filtrer les cellules à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et centrifugeuse à 300 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Après cela, aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules en 24 millilitres de médias de différenciation. Plaquez l’iPSC dans une plaque de puits OP9/DLL1 confluente. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.Le jour 15, recueillir toutes les cellules non adhérentes et les filtrer à travers une passoire à cellules de 40 micromètres. Centrifugeuse à 300 G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Continuer à passer les cellules non adhérentes tous les trois à quatre jours comme décrit précédemment.Au septième jour du traitement DGWO, sortez quatre nouveaux plats de 10 centimètres. Remplissez chaque plat de 20 millilitres de supports complets. Transférer toutes les membranes de nitrocellulose avec des lobes thymiques dans un plat de 10 centimètres.À l’aide de forceps, détachez les lobes individuels de la membrane, ce qui leur permet d’être immergés dans les médias. Incuber les lobes pendant une heure à température ambiante. Transférer ensuite les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 centimètres avec un média complet.Et incuber pendant une heure à température ambiante. Répétez ce transfert et l’incubation deux fois de plus. À l’aide de forceps, fixer les lobes thymiques au plat tout en utilisant l’autre main pour faire une incision profonde de 100 à 200 micromètres au centre et étendre la moitié du diamètre du lobe pour faciliter la migration progénitrice des cellules T dans le lobe.Transférer les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 centimètres rempli de supports de différenciation complets. Si vous utilisez des plaques de culture 3D avec des grilles de niveau inférieur et supérieur, remplissez les deux grilles de Stéril PPS pour éviter l’évaporation et le séchage des gouttes suspendues. Prochain transfert 30 microlitres de supports complets contenant un lobe thymique traité par DGWO dans chaque puits de la plaque de culture 3D.Recueillir les cellules de lignée T non adhérentes de la co-culture OP9/DLL1. Et re-suspendre les cellules à une densité de 2000 à 5000 cellules T par 20 microlitres de médias. Ajouter 20 microlitres de la suspension cellulaire de lignée T à chaque lobe thymique dans la plaque de culture 3D.Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le lendemain, réglez le pipet P200 à 30 microlitres. Pipet le média dans chaque puits de haut en bas à plusieurs reprises pour enlever toutes les cellules entourant les lobes thymiques.Ensuite, aspirez les médias de chaque puits et remplacez-les de 30 microlitres de supports complets. Répétez ce processus, pipeting, enlever, et le remplacement du média cinq à sept fois pour enlever toutes les cellules T immatures supplémentaires qui ne migrent pas dans les lobes. Continuez à couver les lobes, en vous assurant de changer 25 à 30 microlitres de médias par jour.Le quatrième ou cinquième jour, utilisez une microscopie légère pour confirmer la formation d’un halo d’émigrants thymiques dérivés de l’iPSC autour des lobes. Recueillir le quotidien de l’iTE en pipeting médias sans perturbation du lobe. Changez les médias tous les jours et continuez la collecte jusqu’à environ 12 jours.Les iTE récoltés sont prêts à être utilisés pour des expériences d’analyse moléculaire ou de transplantation in vivo. Dans cette étude, les thymus foetaux co-cultivés sont sectionnés pour analyser si les cellules de lignée de cellules T dérivées d’iPSC peuvent migrer dans les lobes thymiques. Les lobes de commande non ensemencés ont une architecture tissulaire caractérisée par un web épithélial thymique astrocyte-comme déployé des cellules positives endogènes de CD3.Toutefois, les lobes thymiques ensemencés avec des lymphocytes T immatures dérivés de l’iPSC sont repeuplés avec des cellules mononucléaires positives CD3 indiquant la migration des lymphocytes T immatures dérivés de l’iPSC dans les lobes. Les cellules T qui migrent dans le microenvironnement thymique et mûrissent par la suite sous forme d’iTE. L’analyse cytométrique de flux est alors employée pour tester la caractérisation phénotypique de diverses cellules.Les lymphocytes T thymiques supplémentaires présentent des lymphocytes T CD4, CD8 double positifs et des lymphocytes T positifs alpha cd8 alpha sans expression du marqueur de sélection positif, classe 1 du MHC, tandis que les iTE sont une population homogène de phénotype positif de cellules T MHC alpha unique de classe 1 cd8 indiquant leur passage réussi par sélection positive avant l’évacuation du lobe thymique. iTE ont l’antigène-spécificité contre le peptide cognate. iTE co-cultivé avec des cellules présentant des antigènes préchargés avec un peptide non pertinent que la nucléoprotéine ne montrent pas dans une production cellulaire de cytokines.Cependant l’antigène de co-culture d’iTE présentant des cellules pré-pulsées avec le peptide cognate GP100, produisent intracellulairement TNF alpha interleukin ii et gamma d’interféron. S’il vous plaît rappelez-vous que la culture cellulaire en ligne ouverte est fortement dépendante de la fente ABS. ITE généré peut être utilisé dans n’importe quel autre essai de travail avec les cellules T conventionnelles.Par exemple, l’analyse de compensation des lymphocytes T, l’analyse de production de cytokine, les essais de régression tumorale in vivo, l’étude de différenciation des lymphocytes T, et cetera. Cette technologie peut être appliquée à de nombreux projets immunologiques ou tels. Y compris une différenciation des cellules T, la maturation des cellules T par impulsions et la génération de cellules T spécifiques aux antigènes à partir d’un ancêtre hématocrit ou d’une cellule souche.Après avoir regardé cette vidéo, le spectateur doit comprendre comment générer induit pluripotent, dérivé de cellules souches, émigrants thymiques spécifiques à l’antigène tumoral en utilisant un système de culture d’organes thymiques 3D.

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