Name: a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

Vi takker Hiroshi Kawamoto og Kyoko Masuda for vennlig å gi OP9/DLL1 cellelinje. Vi takker Alan B. Hoofring og Erina Z. Han for grafisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av intramural forsknings program for det amerikanske National Cancer Institute (ZIA BC010763) og kreft Moonshot program for Center for Cell-based Therapy ved NCI, NIH. Verket ble også støttet av Milstein Family Foundation.

Alle dyret eksperimenter ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer av National Cancer Institute (NCI) og utført i samsvar med NIH retningslinjer.
1. utarbeidelse av OP9/DLL1 celler for co-kultur med iPSC
<ol><li>Kultur OP9/DLL1 celler i OP9 Media (α-minimum essensielle medium [α-MEM] + 20% ikke-varme deaktivert fosterets storfe serum [FBS] + 1x penicillin-Streptomycin + askorbinsyre [50 ng/mL] og mono-thioglycerol [100 nM]) ved 37 ° c. Når OP9/DLL1 cellene nå 80-95% confluency, vask en gang med 1x magnesium, kalsium, og fenol rød gratis fosfat bufret saltvann (heretter referert til som PBS).</li>
	<li>Tilsett 4 mL 0,05% Trypsin og ruge i 5 min ved 37 ° c. Deretter legger du til 4 mL OP9 Media, distansere celle laget ved pipettering å lage en enkelt celle suspensjon.</li>
	<li>Overfør celle fjæringen til et 50 mL konisk rør gjennom en celle sil på 100 μm. Sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c, aspirer supernatanten og resuspend i 12 mL OP9 medium.</li>
	<li>Plate 2 mL OP9/DLL1 celle fjæring på en ny 10 cm celle-kultur Petri parabolen og legge til ytterligere 8 mL OP9 Media. Gjenta passasje hver 2-3 dager. Merk: Kvaliteten på FBS og kultur forholdene er avgjørende for å opprettholde utvidelsen av OP9/DLL1 celler uten å miste sin evne til å støtte iPSC differensiering. Derfor anbefales det å pre-evaluere mange FBS og passasje konsekvent på 80% confluency å hindre celle differensiering og senescence. Det er også viktig å gjøre nok frosset lager av OP9/DLL1 celler og tine et nytt lager hver 4-6 uker.</li>
</ol>2. in vitro differensiering av iPSC i umodne T celler
<ol><li>
På dag 0, begynner iPSC co-kultur på OP9/DLL1 confluent retter.
	<ol>
<li>Harvest iPSC som en enkelt celle suspensjon av trypsinization (5 min i 0,05% Trypsin ved 37 ° c), samle cellene, og sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.</li>
		<li>Aspirer de supernatanten og resuspend cellene ved 1,0 x 105 IPSC per 10 ml av OP9 medier. Plate 1,0 x 105 IPSC på en confluent OP9/DLL1 10 cm rett. Merk: OP9/DLL1 10 cm retter brukes til iPSC differensiering når de når 90-100% confluency. Forskjeller i confluency kan påvirke effektiviteten av iPSC differensiering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På dag 3, aspirer gamle medier og Erstatt med 10 mL fersk OP9 Media.</li>
	<li>
På dag 6, passasje celler.
	<ol>
<li>Vask hver 10 cm confluent OP9 rett med 10 mL PBS. Tilsett 3 mL 0,05% Trypsin per fat og ruge i 3 – 5 minutter ved romtemperatur (RT).</li>
		<li>Tilsett 4 mL OP9 Media og samle celler ved milde pipettering. Passere celler gjennom en 100 μm celle sil og sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten.</li>
		<li>Resuspend celler i 10 mL differensiering Media (OP9 Media med 5 ng/mL mus Flt3 ligand [FLT3L] og 5 ng/mL mus IL-7) og plate celle suspensjon på en ny 10 cm OP9/DLL1 confluent parabolen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På dag 9, aspirer gamle medier og erstatte med 10 mL fersk differensiering Media.</li>
	<li>
På dag 11 når cardiomyocytes er observert i iPSC kolonier, løsne mekanisk ikke-tilhenger celler ved pipettering og filtrere gjennom en 100 μm celle sil. Spin ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
	<ol>
<li>Aspirer supernatanten og resuspend i 24 mL differensiering Media. Plate iPSC i en confluent OP9/DLL1 6-brønn plate (4 mL/brønn).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
På dag 15, samle alle ikke-tilhenger celler og filtrere gjennom en 40 μm celle sil.
	<ol>
<li>Spin ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.</li>
		<li>Fortsett passaging ikke-tilhenger celler hver 3 – 4 dager ved å gjenta trinn 2.5.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.3D Tymusatrofi organ kultur for å generere iTE
<ol><li>Harvest mus fosterets tymusatrofi fliker og distribusjon av endogene lymfocytter ved deoxyguanosine (dGUO) behandling som tidligere beskrevet16.</li>
	<li>På dag 7 av dGUO behandling, ta fire nye 10 cm retter og fyll hver med 20 mL komplett Media (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamin + 1x natrium pyruvat + 1x minimum viktig medium med ikke-essensielle aminosyrer (MEM-NEAA) + 1x penicillin-Streptomycin + [1:1000] 2-mercapto etanol).</li>
	<li>Overfør alle nitrocellulose membraner med tymusatrofi fliker til 1 10 cm rett. Løsne de enkelte fliker fra membranen med tang, slik at de kan senkes i Media. Kast membraner. Ruge for 1 time ved RT.</li>
	<li>Overfør tymusatrofi fliker til en ny 10 cm rett med komplett Media og ruge for 1 time ved RT. Gjenta dette trinnet 2 ganger til.</li>
	<li>Ved hjelp av tang, fikse tymusatrofi fliker til parabolen (en om gangen), og med den andre hånden gjør en 100-200 μm dypt snitt i sentrum og strekker halve diameteren på flippen for å lette T celle stamfar migrasjon inn i flik.</li>
	<li>Overfør tymusatrofi fliker til en ny 10 cm parabol fylt med fullstendig differensiering Media (komplett Media + 5 ng/mL mus IL-7 + 5 ng/mL mus FLT3L + 5 ng/mL SCF).</li>
	<li>Alternativt, hvis du bruker 3D kultur plater med lavere og øvre nivå rutenett, fylle begge rutenett med sterile PBS å hindre fordampning og tørking av hengende dråper.</li>
	<li>Overfør 30 μL av komplett Media som inneholder en dGuo-behandlet tymusatrofi flik fra trinn 3,6 i hver brønn av 3D kultur plate.</li>
	<li>Samle ikke-tilhenger T avstamning celler (iPSC-avledet umodne T-celler) fra OP9/DLL1 co-kultur (dager 16-21) (trinn 2.6.2) og resuspend ved 2-5 x 103 T avstamning celler per 20 μL Media.</li>
	<li>Tilsett 20 μL av T avstamning celle suspensjon til hver tymusatrofi flik i 3D kulturen plate. Ruge over natten ved 37 ° c med 5% CO2.
</li>
	<li>Sett P200 Pipet til 30 μL og aspirer mediene etter pipettering flere ganger fra hver brønn for å fjerne alle cellene rundt tymusatrofi fliker. Kast medier og tilsett 30 μL av komplette medier. Gjenta denne prosedyren 5 – 7 ganger for å fjerne eventuelle ekstra umodne T-celler som ikke migrerer inn i fliker. Endre 25 – 30 μL av Media daglig etterpå.</li>
	<li>Bekreft dannelsen av en Halo av iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE) rundt fliker begynner på dag 4-5 av lys mikroskopi.</li>
	<li>Samle iTE daglig av pipettering media uten flik avbrudd. Bytt Media hver dag og fortsette samlingen opp til ca 12 dager.</li>
	<li>Høstet iTE-er er klare til bruk for molekylære analyser (figur 2, Figur 3, Figur 4og figur 5) eller in vivo transplantasjon.</li>
</ol>4. utarbeidelse av antigen presentere celler (APC)
<ol><li>Ofring en C57BL/6 musen av cervical forvridning og sted onto en laboratorium soaker mat idet beskrevet over.</li>
	<li>Fjern milten og plassere den på en 100 μm celle sil. Komprimere milten på sil ved hjelp av en 12 mL sprøyte stempel for å gjøre en enkelt celle suspensjon.</li>
	<li>Overfør celle fjæringen gjennom et sterilt 40 μm celle sil. Sentrifuger suspensjonen på 300 x g i 5 min ved 4 ° c til pellet cellene.</li>
	<li>Aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i 2 mL ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffer å utelukke røde blodlegemer (RBC). Ruge i 5 minutter ved RT.</li>
	<li>Slukke ACK lyse buffer ved å legge til 10 mL PBS. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.</li>
	<li>Aspirer den supernatanten og resuspend celle pellet i 10 mL av komplette medier og overføre til en 10 cm steril Petri parabolen.</li>
	<li>Irradiate splenocytes med 3500 rad ved hjelp av en bestråling enhet (γ-stråling) for å hindre celle spredning.</li>
	<li>Umiddelbart returnere bestrålt celler til en 37 ° c inkubator og kultur over natten.</li>
	<li>Bruk bestrålt celler som APC eller fryse i cellen bankmann.</li>
</ol>5. pulserende APC med antigen
<ol><li>Count Live bestrålt APC ved hjelp av en Neubauer hemocytometer og trypan blå farge. Ruge APC med peptider (hgp100) eller nucleoprotein i 30 min ved 37 ° c.</li>
	<li>Vask APC to ganger med 10 mL PBS for å fjerne ekstra peptid.</li>
	<li>Count iTE og bland med APC i en 1:1 ratio i komplette medier med 100 IU IL-2 og 5 ng/mL IL-7. Alikvot 100 μL av blandingen av celler (total konsentrasjon: 1 x 106 celler/ml) i hver brønn av en ultra-lav vedlegg U bunnen 96 brønn plate og kultur for 48 h ved 37 ° c.</li>
	<li>Etter 48 h, Overfør celler til en ny plate ved hjelp av en flerkanals pipette og passasje hver 2-3 dager etterpå.</li>
	<li>
På dag 3, analysere cytokin sekresjon profil ved farging cellene med intracellulære antistoff og analysere ved flyt flowcytometri (Figur 3).
	<ol>
<li>Tilsett 0,67 μL/mL protein transport hemmer (f.eks. GolgiStop) og ruge ved 37 ° c i 6 timer for å øke intracellulære akkumulering av cytokiner. Vask med 10 mL PBS.</li>
		<li>Resuspend celler i 3 mL kulde (4 ° c) PBS og tilsett langsomt 1 mL kald 4% paraformaldehyde (PFA) løsning.</li>
		<li>Etter 10 min, spinn ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c, kast supernatanten og vask med 10 ml PBS.</li>
		<li>Resuspend celler i 1 mL PBS + 1% FBS + 0,1% ioniske overflateaktivt middel, og plasser i 4 ° c i 10 – 15 min.</li>
		<li>Legg til antistoffer, Beskytt prøver fra lys og plasser i 4 ° c i 30 minutter.</li>
		<li>Snurr ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c, kast supernatanten og vask med 10 ml PBS.</li>
		<li>Snurr ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c og resuspend celler i 1 ml PBS. Cellene er klare til å analyseres i en strømnings flowcytometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reactivity+in+thymic+double-positive+cells+commits+cells+to+a+CD8+alpha+alpha+lineage+with+characteristics+of+innate+immune+cells.">Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells.</a> Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).</li><li>Themeli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor-targeted+human+T+lymphocytes+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+cancer+therapy.">Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).</li><li>Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+TCR+expression+and+aberrant+T+cell+development+in+mice+with+endogenous+prerearranged+T+cell+receptor+genes.">Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes.</a> Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Serwold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor-driven+lymphomagenesis+in+mice+derived+from+a+reprogrammed+T+cell.">T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+2-dGuo-treated+thymus+organ+cultures.">Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).</li><li>Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullary+thymic+epithelial+stem+cells:+role+in+thymic+epithelial+cell+maintenance+and+thymic+involution.">Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+L-selectin:+homing,+inflammation,+and+beyond.">Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Adolescence:+Maturation+Events+Beyond+Positive+Selection.">T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection.</a> Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).</li><li>Best, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+insights+into+the+CD8(+)+T+cell+response+to+infection+and+memory+T+cell+formation.">Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation.</a> Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).</li><li>Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+thymocyte+selection+in+vivo.">Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo.</a> International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).</li><li>Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+T+lymphocytes+in+fetal+thymus+organ+culture.">The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).</li><li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+CCR7+ligands+in+the+emigration+of+newly+generated+T+lymphocytes+from+the+neonatal+thymus.">Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus.</a> Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).</li><li>Watanabe, Y., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+T+cell+receptor+alpha+beta-bearing+T+cells+in+the+submersion+organ+culture+of+murine+fetal+thymus+at+high+oxygen+concentration.">Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration.</a> European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).</li></ol>

Forfattere Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen, og Nicholas P. Restifo er oppfinnere på ventende internasjonale patentsøknad PCT/US2017/65986, arkivert 13 desember 2017, med tittelen "metoder for å utarbeide en isolert eller renset befolkning på Tymusatrofi Emigrant Cells og metoder for behandling bruke samme. "

Bruke T-iPSC å regenerere tumor antigen-spesifikke T-celler kan overvinne mange av dagens hindringer ACT ved å generere små celler med forbedret utholdenhet. Selv om flere metoder bruker OP9/DLL1 co-kultur systemet har blitt rapportert å generere CD8 SP celler6,7,10,13 som uttrykker CD8 molekyler og tumor antigen-spesifikke TCRs, global Gene uttrykks mønstre og funksjonell analyse viser at disse extrathymically generert CD8 SP-celler er forskjellige fra naive T-celler (Figur 4). Her beskriver vi et 3D tymusatrofi kultur system som kan generere iPSC-avledede tymusatrofi nybyggere (iTE) med høy troskap og homogenitet fra murine T-iPSC. iTE ligne naiv T-celler i globale genet uttrykk mønster og i funksjonalitet, for eksempel minne formasjon og in vivo anti-tumor effekt mot etablerte tumor15.
Den klassiske FTOC systemet er en måte å recapitulate tymusatrofi utvalg in vitro. Det har vært brukt for å studere intra-tymusatrofi utvikling av thymocytes23, og det er noen rapporter om FTOC brukes til å generere RTE24. FTOC-systemet har imidlertid flere begrensninger. For å håndtere mangelen på oksygen i en kunstig organ kultur, flere grupper har brukt enten en semi-tørr membran basert kultur23, eller høy oksygen nedsenking kultur systemer25. Men ingen aktuelle metoder kan stadig generere en homogen befolkning på post-tymusatrofi T-celler. For å overkomme begrensningene i det klassiske FTOC-systemet, utviklet vi et 3D-tymusatrofi kultur system som gir tekniske forbedringer i forhold til konvensjonelle metoder15. For eksempel, ved hjelp av vår 3D tymusatrofi kultur metode, maksimal oksygen utveksling og fravær av overflate-flik mekanisk stress holde tymusatrofi fliker i et mer fysiologisk miljø. I tillegg langsiktig kultur tillater eldre T-celler til utgående naturlig fra tymusatrofi fliker. Endelig sanntid observasjon og mikro-manipulasjon aktivere Media utveksling og en konstant samling av iTE uten fysisk forstyrrer tymusatrofi fliker. Således, det 3D tymusatrofi kulturen metoden skaffer betydelig teknisk forbedringer likeledes idet en allé å studere thymically valgt naiv T-celler det var ikke tidligere anvendelig.
Det er flere viktige punkter for den vellykkede generasjonen av iTE bruker denne 3D tymusatrofi kultur system. Kvaliteten på FBS og kultur forhold er avgjørende for å opprettholde utvidelsen av OP9/DLL1 celler uten å miste sin evne til å støtte iPSC differensiering. Derfor anbefaler vi forhånds evaluering av FBS mye samt gjennomgående passaging på 80% confluency for å hindre celle differensiering og senescence. I tillegg er en confluent OP9/DLL1 kultur kreves for in vitro differensiering av IPSC i umodne T-celler, som forskjeller i confluency kan påvirke deres effektivitet. Endelig er den embryonale alder av tymusatrofi fliker avgjørende for generering av iTE. Vi anbefaler å bruke E 14.5-15,5 tymusatrofi fliker.
Som med alle nye protokoller, denne metoden har begrensninger og er gjenstand for forbedring. Kulturen teknikken presenteres her genererer ca 1000 iTE per tymusatrofi flik per dag for en periode på to uker. Økt iTE-generering kan være mulig med ytterligere modifikasjoner, inkludert optimalisering av oksygen konsentrasjon, medie volum og type 3D-kultur plate. Addisjon eller flytting av cytokiner, likeledes idet endre inne cytokin konsentrasjonen, kunne også levere å forbedret iTE utbytte.
Gitt at 3D tymusatrofi kultur system som presenteres her kan generere tymusatrofi nybyggere i et helt ex vivo -system, kan denne teknikken brukes til en rekke immunologiske og adoptiv celle overføring forskningsprosjekter inkludert, men ikke begrenset til T celle differensiering, post-tymusatrofi T celle modning, og generering av antigen-spesifikke T-celler fra blodkreft stamfar eller stamceller. Selv om denne metoden ikke er direkte anvendelig på menneskelige prøver, iTE og 3D-tymusatrofi kultur system holder stort potensial for elucidating den molekylære mekanismer av positive og negative valg og kan forenkle opprettelsen av et kultur system som gjør generering av klinisk relevant tumor antigen-spesifikke naiv-lignende T-celler for ACT.

Adoptiv T celle terapi (ACT) kan være en effektiv behandling for noen pasienter med avansert kreft. Dessverre, mange pasienter ikke opplever tumor regresjon, og overførte celler ikke klarer å vedvare etter infusjon. Dette kan skyldes kvaliteten på de tilført T-cellene. En ACT musemodell viste at i forhold til naiv eller mindre differensiert sentrale minnet T-celler, uhelbredelig differensiert Effektor celler er mindre potente på grunn av dårlig in vivo utholdenhet1, en observasjon også støttet av kliniske data2, 3i denne.
I et forsøk på å forbedre effekten av dagens Act, t celle-avledet indusert Pluripotent stamceller (t-IPSC) har blitt studert omfattende4,5. Når T-celler er omprogrammeres i T-iPSC og re-differensiert i T-celler, den omorganisert konfigurasjon av TCR gener er arvet av T-iPSC, og deretter re-differensiert T-celler. Derfor er kapasiteten til T-iPSC å gjennomgå ubegrenset in vitro ekspansjon tillater effektiv reproduksjon av umodne T celler bærer neoantigen-spesifikke T celle reseptorer (TCR) når slike celler er konstruert fra tumor antigen-spesifikke T-celler6 ,7. Men den presise metoden for differensiering av T-iPSC i modne T-celler, som ville tillate produksjon av kreft antigen-spesifikke T-celler med en mindre differensiert fenotype og bedre anti-tumor potens, gjenstår å belyst.
T-IPSC differensiering ansette co-kulturen i OP9 murine stromal celler over-uttrykker menneskelig hakk ligand DLL1 er en veletablert metode for å produsere T celler in vitro6,7. I mus og mennesker, kan dette co-kultur systemet konsekvent differensiere IPSC, og dermed recapitulating utviklingsmessige hendelser fra blastocyst scenen til umodne T Cell Lineage trinn6,7. Til tross for disse bioteknologisk fremskritt, den fysiologiske differensiering etter CD4+CD8+ Double positive (DP) scenen er fortsatt vanskelig å oppnå. En av grunnene er at in vivo CD4+CD8-og CD4-CD8+ singel positive (SP) T- celler er generert i thymus, et organ ansvarlig for modning og valg av T-celler som har utenlandsk antigen-spesifisitet, men ikke automatisk reaktivitet8. Disse selektive prosessene defineres som henholdsvis positive og negative valg. Men de fleste av de molekylære mekanismer som er nødvendig for å modne T celler i thymus er fortsatt ikke fullt ut forstått, noe som gjør det vanskelig å rekonstruere denne prosessen in vitro. I et forsøk på å overvinne denne fysiologiske hinderet, har flere grupper stimulert av TCR komplekse ved hjelp av anti-CD3 antistoffer eller Agonistiske peptider. Disse in vitro teknikker generere celle produkter som uttrykker nøkkel T celle markører, som CD3, CD8αβ, TCRαβ, og CD62L, mens du fortsatt beholde tumor antigen-spesifisitet. Dessverre, T-celler generert av disse extrathymic metoder utgjør en bred heterogene befolkning av celler preget av ufullstendige positive valg, medfødt-lignende funksjoner, TCR ikke-spesifikk drap, manglende evne til minne formasjon, og ikke-vedvarende anti-tumor effekter i vivo8,9,10,11. Disse unormalt har reist bekymring for at slike celler kan utløse en rekke bivirkninger, inkludert lymfom og både hud og bein unormalt, hvis det brukes for terapeutiske programmer12,13,14 .
For å gjenskape de fysiologiske signalene som mangler i gjeldende in vitro differensiering systemer, tumor antigen-spesifikke T-iPSC ble differensiert ved hjelp av en høstet thymus. Den klassiske fosterets thymus organ kultur (FTOC) system, som ble utviklet for å studere intra-tymusatrofi utvikling av T-celler, ble forbedret ved hjelp av en 3D-kultur system som vellykket produserte T-celler som fullførte tymusatrofi utdanning. Disse post-tymusatrofi T-celler, som ble utpekt som iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE), utstilt naiv-lignende egenskaper15. iTE viste spredning, minne formasjon, og tilstrekkelig anti-tumor effekter i en musemodell mot etablerte b16 melanom svulster. Denne artikkelen beskriver i detalj protokollen av denne romanen FTOC systemet ved hjelp av en 3D-kultur system (figur 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">312693-72-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-Mercaptoethanol (1000X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">FBS</td>
			<td style="width:219px;">Gemini</td>
			<td style="width:344px;">100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Flt-3 ligand</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">hgp100</td>
			<td style="width:219px;">Genscript</td>
			<td style="width:344px;">282077-1, KVPRNQDWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-2</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">402-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-7</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM powder</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Nucleoprotein</td>
			<td style="width:219px;">Global Peptides</td>
			<td style="width:344px;">ASNENMETM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Puromycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stemfactor LIF, Mouse Recombinant</td>
			<td style="width:219px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:344px;">03-0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Cell Culture Vessels and others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">10 cm dish</td>
			<td style="width:219px;">Corning, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:344px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">12ML Syringe</td>
			<td style="width:219px;">Covidien&#160;Monoject</td>
			<td style="width:344px;">22-652-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">6 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 100um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 40um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Forceps</td>
			<td style="width:219px;">DUMONT</td>
			<td style="width:344px;">0108-5PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Lab soaker mat</td>
			<td style="width:219px;">Versi-Dry</td>
			<td style="width:344px;">Cat. EF2175CX 74018-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Membrane filters ( 0.8 &#956;m, 47diam)&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Whatman</td>
			<td style="width:344px;">WHA7408004&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Perfecta3D Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">HDP1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">U Bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">CD3-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEF-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td style="width:219px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">SCRC-1040; RRID:MGI:5007926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">OP9/N-DLL1</td>
			<td style="width:219px;">Riken Bioresource center</td>
			<td style="width:344px;">Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental mouse models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Charles River</td>
			<td style="width:344px;">Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">C57BL/6N</td>
			<td style="width:219px;">NCI/Charles River</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-1 mice</td>
			<td style="width:219px;">Overwijk et al.</td>
			<td style="width:344px;">J Exp Med 198(4):569-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-aTCR</td>
			<td style="width:219px;">Biolegend</td>
			<td style="width:344px;">109202; RRID:AB_313425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:219px;">abcam</td>
			<td style="width:344px;">ab11089; RRID:AB_369097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD4</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553730; RRID:AB_395014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD44</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">559250; RRID:AB_398661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.1</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553775; RRID:AB_395043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553772; RRID:AB_395041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD62L</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">560516; RRID:AB_1645257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD69</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">552879; RRID:AB_394508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8a</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557959; RRID:AB_396959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8b</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">550798; RRID:AB_393887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-H-2Kb</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553570; RRID:AB_394928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IFN-g&#160;</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557998; RRID:AB_396979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">554428; RRID:AB_395386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRb</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35-5961-81; RRID:AB_469741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRVb13</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553204; RRID:AB_394706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TNFa</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557644; RRID:AB_396761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants

Arven etter pre-omorganisert T celle reseptorer (TCRs) og deres epigenetic foryngelse gjøre indusert pluripotent stilk cellen (iPSC)-avledet T celler en lovende kilde for adoptivforeldre T celle terapi (ACT). Men, klassisk in vitro metoder for å produsere generert T-celler fra iPSC resultere i enten medfødt-like eller uhelbredelig differensiert T-celler, som er phenotypically og funksjonelt skiller fra naive T-celler. Nylig, en roman tredimensjonale (3D) tymusatrofi kultur system ble utviklet for å generere en homogen undergruppe av CD8αβ+ antigen-spesifikke T-celler med en naiv t celle-lignende funksjonell fenotype, inkludert kapasitet for spredning, minne formasjon , og tumor undertrykkelse in vivo. Denne protokollen unngår avvikende utviklingsmessige skjebne, noe som åpner for generering av klinisk relevante iPSC-avledede T-celler, utpekt som iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE), samtidig som det gir et potent verktøy for å belyse de påfølgende funksjonene som er nødvendige for T celle modning etter tymusatrofi utvalg.

Co-kultivert fosterets thymuses var delt å analysere om iPSC-avledet T avstamning celler kan migrere inn i tymusatrofi fliker. Unseeded kontroll fliker hadde et vev arkitektur preget av en astrocytt-lignende tymusatrofi epitel Web17, utplassert av endogene CD3+ celler. På den annen side, tymusatrofi fliker seeded med iPSC-avledet umodne T-celler ble repopulated med CD3+ mononukleære celler, indikerer migrering av IPSC-avledet umodne T-celler i fliker (figur 2A).
T-celler som utvandret til og modnet innenfor tymusatrofi mikromiljøet senere egressed som iTE. For å teste sine fenotypiske karakterisering, flyt analytiske analyse av C57BL6 thymocytes, Pmel iPSC-avledet umodne T-celler (extrathymic), og celler som egressed fra tymusatrofi fliker (iTE) ble utført. Extrathymic T-celler på OP9/DLL1 viste CD4+CD8+ (DP) T celler og CD8αSP T celler uten uttrykk for den positive markering markør MHC-i, mens iTE hadde en klar befolkning på CD8αSP MHC-i+ T Cell fenotype, indikerer deres vellykket passasje gjennom positive valg før egressing fra tymusatrofi fliker. iTE konsekvent uttrykke MHC-I og CD62L, som er markører forbundet med høy proliferativ kompetanse, cytokin produksjon, perifere overlevelse, og lymfoide homing18,19,20. Denne fenotype er konsistent med m2 SP-thymocytes som er den mest modne bestanden av enkelt positive T-celler i thymus20, noe som tyder på at iTE har gått gjennom en normal tymusatrofi utviklingsmessige program (Figur 3). Å overvåke effektiviteten av iTE generasjon, celler som hadde egressed fra individuelle tymusatrofi fliker ble isolert. På dag 7, tymusatrofi fliker generert et gjennomsnitt på 1 x 103 Live CD8SP CD 45.1+ CD3+ iTE per dag (Figur 3B). En tilsvarende hastighet på iTE produksjon er observert fra dag 6 til dag 12 av 3D tymusatrofi co-kultur.
Antigen-avhengig aktivering og sekresjon av cytokiner ble analysert for å observere funksjonelle egenskaper thymically utdannet iPSC-avledet umodne T-celler. I nærvær av en irrelevant peptid (nucleoprotein), Pmel-iTE ikke løslate betydelige mengder av TNF-α, IL-2, eller IFN-γ. Når stimulert med beslektet peptid for Pmel T-celler (hgp100), Pmel-iTE sluppet robuste mengder TNF-α og IL-2, mens også produsere lave mengder IFN-γ (Figur 4), som indikerer at Thymically utdannet iTE kan gjenkjenne sine beslektet peptid og skiller effektor cytokiner med en profil som ligner på naturlige nylige tymusatrofi nybyggere (RTE).
For å undersøke transcriptional forskjellene mellom iPSC-avledet T avstamning celler differensiert på OP9/DLL1 med eller uten tymusatrofi utdanning (dvs. iTE versus extrathymic T-celler), RNA-SEQ analyse ble utført på disse to populasjoner og sammenlignet til at av DP T avstamning celler differensiert ved hjelp OP9/DLL1 (DP) og primære naiv CD8+ Pmel T celler. Uttrykket av 102 gener som spiller avgjørende roller i T Cell Ontogenese, thymocyte aktivisering, og hukommelse formasjon ble analysert15,20,21,22. En rektor komponent analyse av de fire studert populasjoner viste at extrathymically generert DP og CD8SP T-celler gruppert sammen, mens iTE gruppert nærmere naive T-celler (figur 5). Kollektivt disse dataene viser at iTE har en fenotype nærmere naiv T-celler enn do T avstamning celler generert av extrathymic metoder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg"> Figur 1 : Skjematisk oversikt over differensiering av IPSC til iTE bruker OP9/DLL1 og 3D tymusatrofi kultur. Protokollen omfatter tre separate differensiering trinn; (Venstre) fra IPSC celler til blodkreft avstamning celler på OP9/DLL1 (dag 0 til 6), (midten) fra blodkreft avstamning celler til UMODNE T celler på OP9/DLL1 med cytokiner (dag 6 til 16 – 21), og (høyre) fra umodne T-celler (dag 16-21) til iTE ved hjelp av en 3D tymusatrofi kultur system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg"> Figur 2 : Immuno-Histochemistry av tymusatrofi fliker seeded med IPSC-avledet umodne T-celler. Topp: H & E farging av en tymusatrofi flik med og uten seeding av iPSC-avledet umodne T-celler. Fra andre topp til bunn: konfokalmikroskopi bilder av delt fliker beiset med DAPI (nucleus), CD3 (T-celle), og slå sammen. Skala bars = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg"> Figur 3 : iTE viser en post-Tymusatrofi T celle fenotype. (A) FACS analyser av thymocytes, extrathymic T-celler (OP9/DLL1 co-kultur system) og Pmel-iTE. Levende celler var gated på congenic CD45+. CD8 SP populasjoner ble videre analysert for CD62L og MHC-I uttrykket. (B) gjennomsnittlig antall CD8SP CD 45.1 iTE produsert over natten per flik 7 dager etter pre-seeding. Data ble samlet inn fra 12 uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg"> Figur 4 : iTE produserer ulike cytokiner ved antigen-spesifikk stimulering. FACS analyser av intra-Cellular produksjon av cytokiner av iTE. iTE var co-kultivert med APCs pre-lastet med irrelevante (nucleoprotein) eller beslektet (hgp100) peptid i tre dager. Tallene vist i øvre høyre kvadranter indikere prosenter av iTE produsere cytokin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg"> Figur 5 : Hel-transcriptome analyse avslører et skifte i iTE genet uttrykk mot en NAIV CD8 + T celle program. Prinsippet komponent analyse (PCA) av RNA-SEQ data fra DP, extrathymic CD8 SP, iTE, og naive T celler. (Analyse av 102 gener knyttet til tymusatrofi differensiering ved hjelp av offentlig database GSE105110) 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensjonal Tymusatrofi kultur system for å generere murine indusert pluripotent Stem Cell-avledet tumor antigen-spesifikke Tymusatrofi nybyggere

Denne artikkelen beskriver en ny metode for å generere tumor antigen-spesifikke indusert pluripotent stilk cellen avledet tymusatrofi nybyggere (iTE) av en tre-dimensjonale (3D) tymusatrofi kultur system. iTE er en homogen undergruppe av T-celler nært knyttet til naive T-celler med kapasitet for spredning, minne formasjon, og tumor undertrykkelse.

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Generasjonen av iPSC-avledede tyromiske emigranter av en 3D-thymisk organkultur er den første in vivo-metoden som regenererer homogen populasjon av tumorantigenspesifikke naive T-celler. De viktigste fordelene er iTE er mer fysiologisk relevant, og denne metoden mer er mer potent enn noen annen in vivo differensialmetode for å produsere stadig en bestemt T-celler. iTE er homogen opprørt av CD8 alfa-beta anti-genous spesifikke T-celler med en naiv T celle-lignende funksjonell fenotype, inkludert kapasitet for spredning, remodiformasjon, og tumor undertrykkelse in vivo.Å demonstrere prosedyren vil være doktor Rafiqul Islam en post-doc i laboratoriet mitt. For å begynne kultur OP9 / DLL1 celler i OP9 media på 37 grader Celsius. Når cellene når 80 til 95 prosent samløpet, vask dem en gang med en X magnesium, kalsium og fenol rødfri PBS.Tilsett fire milliliter punkt null fem prosent trypsin og inkuber på 37 grader celsius i fem minutter. Deretter legger du til fire milliliter OP9-medier og pipet for å fjerne tilknytningen til cellelaget og lage en enkelt cellesuspensjon. Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 50 milliliter gjennom en 100 mikrometercellesil.Sentrifuge ved 300 G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Aspirer suppurate og re-suspendere cellene i 12 milliliter OP9 media. Deretter plate to milliliter av OP9 / DLL1 celle suspensjon i en ny 10 centimeter celle kultur Petri parabolen.Legg til ytterligere åtte milliliter OP9-medier. Gjenta dette avsnittet hver to til tre dager. På dag null høste de induserte pluripotente stamcellene som en enkelt celle suspensjon ved trypsinisering.Samle cellene og sentrifuge ved 300 G ved fire grader celsius i fem minutter. Aspirer de overnaturante og re-suspendere IPC-ene med en tetthet på 100 000 celler per 10 milliliter OP9-medier. Deretter plate 100,000 celler på en samløpet OP9 / DLL1 10 centimeter parabolen.Fortsett inkubasjonen med 37 grader celsius med fem prosent karbondioksid. På dag tre aspirerer det gamle mediet og erstatter det med 10 milliliter friske OP9-medier. På dag seks vask hver 10 centimeter samtidig OP9 rett med 10 milliliter PBS.Legg til tre milliliter punkt null fem prosent trypsin til hver tallerken. Og inkuber i tre til fem minutter ved romtemperatur. Tilsett fire milliliter OP9-medier og rør forsiktig for å samle cellene.Før cellene gjennom en 100 mikrometercellesil og sentrifuge ved 300 G og fire grader celsius i fem minutter. Kast deretter det overnaturlige. Re-suspendere cellene i 10 milliliter differensiering media.Plate celle suspensjon på en ny 10 centimeter OP9 / DLL1 confluent parabolen. Fortsett inkubasjonen ved 37 grader celsius med fem prosent karbondioksid. På dag ni aspirerer du de gamle mediene og erstatter det med 10 milliliter friske differensieringsmedier.Fortsett å inkubere cellene ved 37 grader celsius og fem prosent CO2. På dag 11 når kardiomyocytter observeres i iPSC kolonier bruker en pipet til mekanisk løsne ikke-tilhengerceller. Filtrer cellene gjennom en 100 mikrometercellesil og sentrifuge ved 300 G og fire grader celsius i fem minutter.Etter dette aspirerer du overnatanten og re-suspenderer cellene i 24 milliliter differensieringsmedier. Plate iPSC er i en sammenføyd OP9 / DLL1 seks brønnplate. Inkuber cellene ved 37 grader celsius med fem prosent karbondioksid.På dag 15 samler du alle ikke-tilholdende celler og filtrerer dem gjennom en 40 mikrometercellesil. Sentrifuge ved 300 G og ved fire grader celsius i fem minutter. Fortsett å passere de ikke-tilhengerne hver tredje til fjerde dag som tidligere beskrevet.På dag sju av DGWO-behandlingen tar du ut fire nye 10 centimeter retter. Fyll hver tallerken med 20 milliliter komplette medier. Overfør alle nitrocellulosemembranene med thymic lobes i en 10 centimeter tallerken.Bruk tang, koble de enkelte fliker fra membranen Slik at de kan senkes ned i media. Inkuber humle i en time ved romtemperatur. Deretter overfører du thymic lobes til en ny 10 centimeter rett med komplette medier.Og inkubere i en time ved romtemperatur. Gjenta denne overføringen og inkubasjonen ytterligere to ganger. Ved hjelp av tang, fest thymic lobes til parabolen mens du bruker den andre hånden til å lage en 100 til 200 mikrometer dypt snitt i midten og utvide halvparten av diameteren på lobe for å lette T celle stamfar migrasjon inn i lobe.Overfør thymic lobes til en ny 10 centimeter rett fylt med komplett differensieringsmedie. Hvis du bruker 3D-kulturplater med nedre og øvre nivå rutenett, fyll begge gitter med steril PPS for å hindre fordampning og tørking av hengende dråper. Deretter overfører du 30 mikroliter med komplette medier som inneholder en DGWO behandlet thymisk lobe til hver brønn av 3D-kulturplaten.Samle de ikke-tilhengerne T-avstamningscellene fra OP9/DLL1-samkulturen. Og re-suspendere cellene med en tetthet på 2000 til 5000 T celle avstamning celler per 20 mikroliter av medier. Tilsett 20 mikroliter av T-avstamningscellefjæringen til hver thymic lobe i 3D-kulturplaten.Inkuber over natten ved 37 grader celsius med fem prosent karbondioksid. Neste dag setter du P200-pipetten til 30 mikroliter. Pipet mediet i hver godt opp og ned flere ganger for å fjerne alle cellene rundt thymic lobes.Deretter aspirerer du mediet fra hver brønn og erstatter det med 30 mikroliter med komplette medier. Gjenta denne prosessen, pipeting, fjerning, og erstatte media fem til syv ganger for å fjerne eventuelle ekstra umodne T-celler som ikke migrerer inn i lobene. Fortsett å inkubere lobene, og sørg for å endre 25 til 30 mikroliter medier daglig.På dag fire eller fem bruker du lett mikroskopi for å bekrefte dannelsen av en glorie av iPSC-avledede tyromiske emigranter rundt flikene. Samle iTE's daglig ved å pipe medier uten lobe avbrudd. Endre mediet hver dag og fortsett samlingen opptil ca. 12 dager.Høstet iTE er klar til bruk for molekylær analyse eller in vivo transplantasjon eksperimenter. I denne studien er co-kultiverte fosterthymuses seksjonert for å analysere om iPSC avledet T celle avstamning celler kan migrere inn i thymic fliker. Un-seeded kontroll fliker har en vev arkitektur preget av en astrocytt-lignende thymic epitel web utplassert av endogene CD3 positive celler.Men thymic lobes seeded med iPSC avledede umodne T-celler befolkes med CD3 positive mononukleære celler som indikerer migrering av iPSC avledede umodne T-celler inn i flene. T-celler som migrerer inn i, og modnes, innenfor det thymiske mikromiljøet, deretter utgående som iTE. Flow cytometrisk analyse brukes deretter til å teste fenotypisk karakterisering av ulike celler.Ekstra thymic T-celler viser CD4, CD8 doble positive T-celler og CD8 alfa enkelt positive T-celler uten uttrykk for den positive utvalgsmarkøren, MHC Class One, mens iTE er en homogen populasjon av CD8 alfa enkelt positiv MHC Klasse En positiv T-celle fenotype som indikerer deres vellykkede passasje gjennom positivt utvalg før egressing fra thymic lobe. iTE har antigenspesifisitet mot kognatepeptid. iTE co-kultivert med antigen presentere celler forhåndslastet med en irrelevant peptid som nukleoprotein ikke vises i en cellulær produksjon av cytokiner.Men iTE co-kultur antigen presentere celler pre-pulserende med cognate peptid GP100, produsere intracellulært TNF alfa interleukin ii og interferon gamma. Husk at åpen linje celle kultur er en sterkt avhengig av ABS sporet. Generert iTE kan brukes i alle andre analyser som arbeider med konvensjonelle T-celler.For eksempel, T celle clearing analyse, cytokin produksjon analyse, in vivo tumor regresjon studier, T celle differensiering studie, et cetera. Denne teknologien kan brukes på mange immunologiske eller et slikt prosjekt. Inkludert en T-cellediensjon, pulstid T-cellemodning og generering av antigenspesifikk T-celle fra hematocrit stamfar eller stamcelle.Etter å ha sett denne videoen betrakteren bør forstå hvordan å generere indusert pluripotent, stamcelle avledet, tumor antigen spesifikke thymic emigranter ved hjelp av en 3D thymic organ kultur system.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murine ortotopiske Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musemodell av Fatigue indusert av Peripheral Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fullt Human tumor-baserte Matrix i tredimensjonale spheroid Invasion analysen

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analysere tumor- og vevsfordeling av målantigenspesifikt terapeutisk antistoff

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensjonal modell av sfæroider for å studere kolonkreft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...