Name: a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

Мы благодарим Хироси Кавамото и Кёко Масуда за любезное предоставление линии клеток OP9/DLL1. Мы благодарим Алана Б. Хуферинга и Эрину З. Он за графическую помощь. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы Национального института рака США (ЗИА BC010763) и рак Moonshot программы для Центра клеточной терапии в NCI, NIH. Работа также была поддержана Фондом семьи Мильштейнов.

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональными комитетами по уходу за животными и использованию Национального института рака (NCI) и проведены в соответствии с руководящими принципами NIH.
1. Подготовка клеток OP9/DLL1 для совместной культуры с iPSC
<ol><li>Культурные клетки OP9/DLL1 в op9-носителях (-минимальная необходимая среда »-MEM» - 20% ненагретная инактивированная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) 1x пенициллин-стрептомицин , аскорбиновая кислота (50 нг/мл) и моно-тиоглицерол (100 нм) при 37-c. Когда op9/DLL1 клетки достигают 80-95% конфлюкс, мыть один раз с 1x магния, кальция и фенола красный свободный фосфат буферный солен (в дальнейшем называют PBS).</li>
	<li>Добавьте 4 мл 0,05% трипсина и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Затем добавьте 4 мл носителей OP9, разъедините клеточный слой, прокладывая трубку, чтобы сделать одноклеточное суспензию.</li>
	<li>Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл через 100 мкм-ситечко. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию, аспирируй супернатант и повторно приостанавливай 12 мл носителей OP9.</li>
	<li>Плита 2 мл OP9/DLL1 клеточной подвески на новый 10 см клеточной культуры Петри блюдо и добавить дополнительные 8 мл OP9 средств массовой информации. Повторите проход каждые 2-3 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: Качество FBS и культурные условия имеют решающее значение для поддержания расширения OP9/DLL1 ячеек, не теряя при этом их способности поддерживать дифференциацию iPSC. Поэтому рекомендуется предварительно оценить много FBS и проход последовательно на 80% confluency для предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Важно также, чтобы сделать достаточно замороженных запасов OP9/DLL1 клеток и оттаивать новый запас каждые 4-6 недель.</li>
</ol>2. В экстракорпорании Дифференциация iPSC в незрелые Т-клетки
<ol><li>
На 0 день, начните iPSC совместной культуры на OP9/DLL1 конфлированные блюда.
	<ol>
<li>Урожай iPSC в виде одноклеточной подвески путем трипсинизации (5 мин в 0,05% трипсина при 37 градусах Цельсия), собирать клетки, и центрифуги на 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.</li>
		<li>Приготовьте супернатант и отдохните клетки на уровне 1,0 х 105 iPSC на 10 мл носителей OP9. Плита 1.0 x 105 iPSC на соплокую тарелку OP9/DLL1 10 см. ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда OP9/DLL1 10 см используется для дифференциации iPSC, когда они достигают 90-100% выпуклости. Различия в стоечности могут повлиять на эффективность дифференциации iPSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>На 3-й день, аспирируйте старые носители и заменить 10 мл свежих носителей OP9.</li>
	<li>
На 6-й день, проходные камеры.
	<ol>
<li>Вымойте каждый 10 см сливаOPили OP9 блюдо с 10 мл PBS. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина на блюдо и инкубировать в течение 3-5 мин при комнатной температуре (RT).</li>
		<li>Добавьте 4 мл носителей OP9 и соберите ячейки нежным пипеттингом. Пройдите клетки через 100 мкм ячейки ситечко и центрифуги на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта.</li>
		<li>Resuspend клетки в 10 мл дифференциации средств (OP9 СМИ с 5 нг /мл мыши Flt3 лиганд "FLT3L" и 5 нг /мл мыши IL-7) и пластины ячейки подвески на новый 10 см OP9/DLL1 слияние блюдо.</li>
	</ol>
</li>
	<li>На 9-й день, аспирации старых носителей и заменить 10 мл свежих средств дифференциации.</li>
	<li>
На 11 день, когда кардиомиоциты наблюдаются в колониях iPSC, механически отсоединяют неадекторные клетки путем пипетки и процеживают через 100 мкм клеточный ситечко. Спин при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
	<ol>
<li>Аспирация супернатанта и resuspend в 24 мл дифференциации средств массовой информации. Плита iPSC в сливочную 6-колодую пластину OP9/DLL1 (4 мл/колодец).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
На 15 день, собрать все неприсоединения клеток и фильтр через 40 мкм ячейки ситечко.
	<ol>
<li>Спин при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.</li>
		<li>Продолжайте пропускать неприсоединения клетки каждые 3-4 дня, повторяя шаг 2.5.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D Тимский орган культуры для создания iTE
<ol><li>Урожай мыши плода тимических долей и развертывания эндогенных лимфоцитов по дезоксигуанозина (dGUO) лечение, как ранее описано16.</li>
	<li>На 7-й день лечения dGUO, возьмите четыре новых 10 см блюд и заполнить каждый с 20 мл полных средств массовой информации (Россвелл Парк Мемориальный институт Сми 1640 "RPMI 1640" (MEM-NEAA) - 1x пенициллин-стрептомицин - 1:1000 2-меркапто этанол).</li>
	<li>Перенесите все мембраны нитроцеллюлозы с тимическими долей в одну 10-сантиметровую тарелку. Отсоедините отдельные доли от мембраны щипками, что позволяет их погружать в носители. Отбросьте мембраны. Инкубировать 1 ч на RT.</li>
	<li>Перенесите тимичные доли в новую 10-сантиметровую тарелку с полным носителем и инкубину в течение 1 ч на RT. Повторите этот шаг еще 2 раза.</li>
	<li>Используя щипцы, исправить тимьяна доли блюдо (по одному в то время), а с другой стороны сделать 100-200 мкм глубокий разрез в центре и расширение половины диаметра доли для облегчения Т-клеток-прародителей миграции в доле.</li>
	<li>Перенесите тимичные доли в новую 10-сантиметровую тарелку, наполненную полной дифференциацией (полные носители: 5 нг/мл мыши IL-7 , 5 нг/мл мыши FLT3L 5 нг/мл SCF).</li>
	<li>Дополнительно, при использовании 3D-культурных пластин с сетками нижнего и верхнего уровня, заполните обе сетки стерильными PBS, чтобы предотвратить испарение и сушку висячих капель.</li>
	<li>Передача 30 злицита полных носителей, содержащих одну дГУообработанную тимику с шага 3,6 в каждую скважину 3D-культурной пластины.</li>
	<li>Сбор неприсоединения T линии клеток (iPSC полученных незрелых Т-клеток) от OP9/DLL1 совместной культуры (дни 16-21) (шаг 2,6,2) и resuspend на 2-5 х 103 T линейных ячеек на 20 мульти-медиа.</li>
	<li>Добавьте 20 ЗЛ суспензии тлинейных клеток к каждой тимической доле в 3D-культуре пластины. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
</li>
	<li>Установите P200 pipet до 30 Зл и аспирировать средства массовой информации после pipetting несколько раз из каждого колодца, чтобы удалить все клетки, окружающие тимские доли. Отбросьте мультимедиа и добавьте 30 кл. полного носителя. Повторите эту процедуру 5-7 раз, чтобы удалить любые дополнительные незрелые Т-клетки, которые не мигрируют в доли. Изменение 25-30 Зл средств массовой информации ежедневно после этого.</li>
	<li>Подтвердите образование ореола тимических эмигрантов (iTE) по липучне, полученного в iTE, вокруг долей, начиная с 4-5 дня, с помощью световой микроскопии.</li>
	<li>Собирайте iTE ежедневно путем пипетки средств массовой информации без нарушения доли. Изменяйте носители каждый день и продолжайте сбор примерно до 12 дней.</li>
	<li>Собранные iTE готовы к использованию для молекулярного анализа(рисунок 2, Рисунок3, Рисунок 4, и Рисунок 5) или in vivo экспериментов по трансплантации.</li>
</ol>4. Подготовка антигенных клеток (APC)
<ol><li>Пожертвуйте мышью C57BL/6 путем вывиха шейки матки и поместите на лабораторный коврик, как описано выше.</li>
	<li>Удалите селезенку и поместите ее на 100 мкм ячейки ситечко. Сжать селезенку на ситечко с помощью 12 мл шприц поршень, чтобы сделать одну ячейку подвески.</li>
	<li>Перенесите суспензию клетки через стерильный 40 мкм-ситечко. Centrifuge подвески на 300 х г в течение 5 минут при 4 кв С, чтобы гранулы клеток.</li>
	<li>Усилите супернатант и повторно ежеклеточные гранулы в 2 мл лиза аммония-хлорида (ACK), чтобы исключить эритроциты (РБК). Инкубировать в течение 5 мин на RT.</li>
	<li>Утолить буфер lysis ACK, добавив 10 мл PBS. Пелле клетки центрифугации при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Аспирировать супернатант и resuspend клеточной гранулы в 10 мл полного носителя и передачи 10 см стерильной чашке Петри.</li>
	<li>Облучение спленоцитов с помощью 3500 рад с помощью облучения устройства (я-излучения) для предотвращения пролиферации клеток.</li>
	<li>Немедленно верните облученные клетки в инкубатор и культуру 37 градусов по Цельсию на ночь.</li>
	<li>Используйте облученные ячейки в качестве БТР или замораживание в ячейке банкира.</li>
</ol>5. Пульсирующий БТР с антигеном
<ol><li>Граф жить облученных БТР с помощью гемоцитометра Нойбауэр и trypan синий краситель. Инкубировать APC с пептидами (hgp100) или нуклеопротеином в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.</li>
	<li>Вымойте APC дважды с 10 мл PBS, чтобы удалить любой дополнительный пептид.</li>
	<li>Подсчитайте iTE и смешайте с БТР в соотношении 1:1 в полных носителях с 100 МЕ Ил-2 и 5 нг/мл Ил-7. Aliquot 100 л смеси клеток (общая концентрация: 1 х 106 клеток/мл) в каждую скважину ультра-низкой привязанности U bottom 96 хорошо пластины и культуры для 48 ч при 37 градусов по Цельсию.</li>
	<li>После 48 ч, передача клеток на новую пластину с помощью многоканального пипетки и проход каждые 2-3 дней после этого.</li>
	<li>
На 3-й день проанализируйте профиль секреции цитокинов, окрашивая клетки внутриклеточными антителами и анализируйте с помощью цитометрии потока(рисунок 3).
	<ol>
<li>Добавьте 0,67 л/мл ингибитора переноса белка (например, GolgiStop) и инкубировать при 37 градусах По цельсии в течение 6 ч для усиления внутриклеточного накопления цитокинов. Вымойте 10 мл PBS.</li>
		<li>Приостановите работу клеток в 3 мл холодного (4 кВ) PBS и медленно добавьте 1 мл холодного 4% параформальдегида (PFA).</li>
		<li>После 10 мин, спина вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин при 4 кв С, отбросить супернатант и вымыть с 10 мл PBS.</li>
		<li>Переплетить клетки в 1 мл PBS - 1% FBS - 0,1% неионического сурфактанта, и поместить в 4 кв. м в течение 10-15 мин.</li>
		<li>Добавить антитела, защитить образцы от света и поместить в 4 градуса по Цельсию в течение 30 мин.</li>
		<li>Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 минут при 4 кв С, отбросить супернатант, и мыть с 10 мл PBS.</li>
		<li>Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 минут при 4 КС и resuspend клеток в 1 мл PBS. Клетки готовы к анализу в цитометре потока.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reactivity+in+thymic+double-positive+cells+commits+cells+to+a+CD8+alpha+alpha+lineage+with+characteristics+of+innate+immune+cells.">Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells.</a> Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).</li><li>Themeli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor-targeted+human+T+lymphocytes+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+cancer+therapy.">Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).</li><li>Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+TCR+expression+and+aberrant+T+cell+development+in+mice+with+endogenous+prerearranged+T+cell+receptor+genes.">Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes.</a> Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Serwold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor-driven+lymphomagenesis+in+mice+derived+from+a+reprogrammed+T+cell.">T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+2-dGuo-treated+thymus+organ+cultures.">Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).</li><li>Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullary+thymic+epithelial+stem+cells:+role+in+thymic+epithelial+cell+maintenance+and+thymic+involution.">Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+L-selectin:+homing,+inflammation,+and+beyond.">Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond.</a> Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Adolescence:+Maturation+Events+Beyond+Positive+Selection.">T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection.</a> Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).</li><li>Best, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+insights+into+the+CD8(+)+T+cell+response+to+infection+and+memory+T+cell+formation.">Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation.</a> Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).</li><li>Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+thymocyte+selection+in+vivo.">Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo.</a> International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).</li><li>Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+T+lymphocytes+in+fetal+thymus+organ+culture.">The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).</li><li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+CCR7+ligands+in+the+emigration+of+newly+generated+T+lymphocytes+from+the+neonatal+thymus.">Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus.</a> Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).</li><li>Watanabe, Y., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+T+cell+receptor+alpha+beta-bearing+T+cells+in+the+submersion+organ+culture+of+murine+fetal+thymus+at+high+oxygen+concentration.">Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration.</a> European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).</li></ol>

Авторы Рауль Визкардо, Николас Д. Клемен и Николас. Рестифо являются изобретателями на рассмотрении международной патентной заявки PcT/US2017/65986, поданной 13 декабря 2017 года под названием Методы подготовки изолированного или очищенного населения тимических эмигрантских клеток и методы лечения с использованием того же ".

Использование T-iPSC для регенерации опухолевых антиген-специфических Т-клеток может преодолеть многие из нынешних препятствий ACT путем создания молодых клеток с улучшенной настойчивостью. Хотя несколько методов с использованием OP9/DLL1 совместной культуры системы, как сообщается, генерировать CD8 SP-клеток6,7,10,13, которые выражают CD8 молекул и опухолевых антигенов конкретных TCRs, глобальный ген шаблоны выражения и функциональный анализ показывают, что эти экстратимически регенерированные клетки CD8 SP отличаются от наивных Т-клеток(рисунок 4). Здесь мы описываем 3D тимическую систему культуры, которая может генерировать iPSC полученных тимических эмигрантов (iTE) с высокой точностью и однородность из murine T-iPSC. iTE напоминают наивные Т-клетки в глобальной модели экспрессии генов и в функциональности, таких как формирование памяти и противоопухолевый эффект in vivo против установленной опухоли15.
Классическая система FTOC является способом повторения тимического отбора in vitro. Он был использован для изучения внутритимического развития тимоцитов23, и Есть несколько сообщений fTOC используется для создания RTE24. Тем не менее, система FTOC имеет ряд ограничений. Для того чтобы отсутсвие кислорода в искусственничной культуре органа, несколько групп использовали или semi-сухую культуру основанной мембраны23,или системы культуры субмерии кислорода25. Однако никакие современные методы не могут постоянно генерировать однородную популяцию посттимических Т-клеток. Чтобы преодолеть ограничения классической системы FTOC, мы разработали 3D тимическую систему культуры, которая обеспечивает технические усовершенствования по сравнению с обычными методами15. Например, использование нашего метода 3D тимической культуры, максимального обмена кислородом и отсутствия поверхностно-логов механического стресса держать тимские доли в более физиологической среде. Кроме того, долгосрочная культура позволяет зрелым Т-клеткам естественным образом выйти из тимических долей. Наконец, наблюдение в реальном времени и микроманипуляции позволяют обмениваться средствами массовой информации и постоянной коллекции iTE без физического нарушения тимических долей. Таким образом, метод 3D тимической культуры обеспечивает значительные технические усовершенствования, а также возможность изучения тимически выбранных наивных Т-клеток, которые ранее не были доступны.
Есть несколько ключевых моментов для успешного поколения iTE с помощью этой 3D тимской системы культуры. Качество УСЛОВИй FBS и культуры имеет решающее значение для поддержания расширения OP9/DLL1 ячеек, не теряя при этом их способности поддерживать дифференциацию iPSC. Поэтому мы рекомендуем предварительной оценки fbS много, а также последовательно прохождения на 80% confluency для предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Кроме того, культура слияния OP9/DLL1 необходима для дифференциации iPSC в незрелые Т-клетки, так как различия в выпуклости могут повлиять на их эффективность. Наконец, эмбриональный возраст тимических долей имеет решающее значение для поколения iTE. Рекомендуем использовать E14.5 - 15,5 тыс. долей.
Как и в случае с любым новым протоколом, этот метод имеет ограничения и подлежит совершенствованию. Представленная здесь техника культуры в течение двух недель составляет около 1000 iTE на тимическую мебу. Увеличение генерации iTE может быть возможно с дальнейшими изменениями, включая оптимизацию концентрации кислорода, объема мультимедиа и типа 3D-культурной пластины. Добавление или удаление цитокинов, а также изменения концентрации цитокинов, также может способствовать повышению урожайности iTE.
Учитывая, что 3D тимическая система культуры, представленная здесь, может генерировать тимических эмигрантов в полностью ex vivo системы, этот метод может быть применен к различным иммунологических и приемных клеток передачи научно-исследовательских проектов, включая, но не ограничивайтесь T дифференциация клеток, посттимичное созревание Т-клеток и генерация антиген-специфических Т-клеток гематопоиетического прародителя или стволовых клеток. Хотя этот метод непосредственно не применим к пробам человека, iTE и система 3D тимской культуры имеют большой потенциал для выяснения молекулярных механизмов положительного и отрицательного отбора и могут способствовать созданию системы культуры, которая позволяет поколение клинически релевантных опухолевых антигенов конкретных наивных Т-клеток для АКТ.

Приемная Т-клеточная терапия (ACT) может быть эффективным лечением для некоторых пациентов с запущенным раком. К сожалению, многие пациенты не испытывают регрессии опухоли, и переданные клетки не сохраняются после инфузии. Это может быть связано с качеством настояний Т-клеток. Модель мыши ACT показала, что по сравнению с наивными или менее дифференцированными центральными клетками памяти Т, неизлечимо дифференцированные клетки-эффекторы менее мощные из-за плохой настойчивости in vivo1, наблюдение также поддерживается клиническими данными2, 3.
В целях повышения эффективности текущего ACT, Т-клеток, полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (T-iPSC) были изучены широко4,5. Когда Т-клетки перепрограммируются в T-iPSC и вновь дифференцированы в Т-клетки, перестроенная конфигурация генов TCR наследуется T-iPSC, а затем и повторно дифференцированных Т-клеток. Таким образом, способность T-iPSC пройти неограниченное расширение in vitro позволяет эффективное размножение незрелых Т-клеток, несущих неоантиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR), когда такие клетки разработаны из опухолевых антиген-специфических Т-клеток6 ,7. Тем не менее, точный метод дифференциации T-iPSC в зрелые Т-клетки, которые позволили бы производство рака антиген-специфических Т-клеток с менее дифференцированным фенотипом и лучшей противоопухолевой потенцией, еще предстоит выяснить.
T-iPSC дифференциации с использованием совместной культуры OP9 мурин стромальных клеток чрезмерного выражения человека Notch ligand DLL1 является устоявшимся методом для производства Т-клеток в пробирке6,7. У мышей и людей, эта система совместной культуры может последовательно дифференцировать iPSC, тем самым реквалитулируя события развития от стадии бластоциста до незрелой линии Т-клеток стадии6,7. Несмотря на эти биотехнологические достижения, физиологическая дифференциация после этапа CD4иCD8и двойного положительного (DP) этапа по-прежнему трудно достичь. Одна из причин заключается в том, что in vivo CD4иCD8- и CD4-CD8- одиночные положительные (SP) Т-клетки генерируются в тимусе, органе, ответственном за созревание и отбор Т-клеток, которые имеют чужую антиген-специфичность, но не автореактивность8. Эти селективные процессы определяются как положительный и отрицательный отбор, соответственно. Тем не менее, большинство молекулярных механизмов, необходимых для созревания Т-клеток в тимусе до сих пор полностью не изучены, что затрудняет реконструкцию этого процесса в пробирке. В попытке преодолеть это физиологическое препятствие, несколько групп стимулировали комплекс TCR с использованием анти-CD3 антител или агонист пептидов. Эти методы in vitro генерируют клеточные продукты, которые выражают ключевые маркеры Т-клеток, такие как CD3, CD8, TCR и CD62L, сохраняя при этом специфичность опухолевых антигенов. К сожалению, Т-клетки, генерируемые этими экстрагимичными методами, представляют собой широкую неоднородную популяцию клеток, характеризующуюся неполным положительным отбором, врожденными особенностями, неспецифическим убийством TCR, неспособностью к формированию памяти и непостоянные противоопухолевыеэффекты in vivo 8,9,10,11. Эти аномалии вызвали опасения, что такие клетки могут вызвать различные побочные эффекты, в том числе лимфомы и кожи и костной аномалии, если используется для терапевтических приложений12,13,14 .
Чтобы воссоздать физиологические сигналы, отсутствующие в текущих системах дифференциации in vitro, антиген-специфический T-iPSC опухолевого антигена были дифференцированы с помощью собранного тимуса. Классическая система органов тимуса плода (FTOC), которая была разработана для изучения внутритимического развития Т-клеток, была усовершенствована с помощью 3D-системы культуры, которая успешно производила Т-клетки, которые завершили тимическое образование. Эти пост-тимические Т-клетки, которые были обозначены как iPSC полученных тимских эмигрантов (iTE), выставлены наивные свойства15. iTE показал пролиферацию, формирование памяти и адекватные противоопухолевые эффекты в мышиной модели против установленных опухолей меланомы B16. Эта статья подробно описывает протокол этой новой системы FTOC с использованием 3D-системы культуры(рисунок 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">312693-72-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">2-Mercaptoethanol (1000X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">FBS</td>
			<td style="width:219px;">Gemini</td>
			<td style="width:344px;">100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Flt-3 ligand</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">hgp100</td>
			<td style="width:219px;">Genscript</td>
			<td style="width:344px;">282077-1, KVPRNQDWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-2</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">402-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Interleukin-7</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEM powder</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Nucleoprotein</td>
			<td style="width:219px;">Global Peptides</td>
			<td style="width:344px;">ASNENMETM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Puromycin</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:219px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:219px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Stemfactor LIF, Mouse Recombinant</td>
			<td style="width:219px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:344px;">03-0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Cell Culture Vessels and others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">10 cm dish</td>
			<td style="width:219px;">Corning, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:344px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">12ML Syringe</td>
			<td style="width:219px;">Covidien&#160;Monoject</td>
			<td style="width:344px;">22-652-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">6 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 100um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Cell strainer 40um</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Forceps</td>
			<td style="width:219px;">DUMONT</td>
			<td style="width:344px;">0108-5PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Lab soaker mat</td>
			<td style="width:219px;">Versi-Dry</td>
			<td style="width:344px;">Cat. EF2175CX 74018-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Membrane filters ( 0.8 &#956;m, 47diam)&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Whatman</td>
			<td style="width:344px;">WHA7408004&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Perfecta3D Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">HDP1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">U Bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:219px;">Corning/Coster</td>
			<td style="width:344px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">CD3-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">MEF-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td style="width:219px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">SCRC-1040; RRID:MGI:5007926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">OP9/N-DLL1</td>
			<td style="width:219px;">Riken Bioresource center</td>
			<td style="width:344px;">Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-iPSC</td>
			<td style="width:219px;">Vizcardo et al., Cell Report 2018</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Experimental mouse models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Charles River</td>
			<td style="width:344px;">Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">C57BL/6N</td>
			<td style="width:219px;">NCI/Charles River</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Pmel-1 mice</td>
			<td style="width:219px;">Overwijk et al.</td>
			<td style="width:344px;">J Exp Med 198(4):569-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-aTCR</td>
			<td style="width:219px;">Biolegend</td>
			<td style="width:344px;">109202; RRID:AB_313425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:219px;">abcam</td>
			<td style="width:344px;">ab11089; RRID:AB_369097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD4</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553730; RRID:AB_395014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD44</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">559250; RRID:AB_398661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.1</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553775; RRID:AB_395043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD45.2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553772; RRID:AB_395041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD62L</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">560516; RRID:AB_1645257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD69</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">552879; RRID:AB_394508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8a</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557959; RRID:AB_396959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-CD8b</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">550798; RRID:AB_393887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-H-2Kb</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553570; RRID:AB_394928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IFN-g&#160;</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557998; RRID:AB_396979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">554428; RRID:AB_395386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRb</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">35-5961-81; RRID:AB_469741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TCRVb13</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">553204; RRID:AB_394706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:275px;">Anti-TNFa</td>
			<td style="width:219px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:344px;">557644; RRID:AB_396761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional thymic culture system to generate murine induced pluripotent stem cell-derived tumor antigen-specific thymic emigrants

Наследование предварительно переставленных Т-клеточных рецепторов (ТКР) и их эпигенетическое омоложение делают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) т-клеток перспективным источником для приемной Т-клеточной терапии (ACT). Однако классические методы in vitro для производства регенерированных Т-клеток из iPSC приводят либо к врожденной, либо неизлечимо дифференцированным Т-клеткам, которые фенотипически и функционально отличаются от наивных Т-клеток. Недавно была разработана новая трехмерная (3D) система тимской культуры для создания однородного подмножества CD8-- антиген-специфических Т-клеток с наивным Т-клеточным функциональным фенотипом, включая способность к распространению, формированию памяти , и подавление опухоли в vivo. Этот протокол позволяет избежать аномальных урядов развития, что позволяет для генерации клинически значимых IPSC полученных Т-клеток, назначенных как iPSC полученных тима эмигрантов (iTE), а также предоставление мощного инструмента для выяснения последующих функций, необходимых для созревания Т-клеток после выбора тимии.

Co-культурные тимы плода были разделены для анализа ли iPSC полученных T линии клетки могут мигрировать в тимачных долей. Unseeded контрольные доли были ткани архитектуры характеризуется астроцитов, как тимский эпителиальной сети17, развернутые эндогенных КЛЕТОк CD3. С другой стороны, тимические доли, посеянные с immature T-клетками, полученными iPSC, были заселены моноядерными клетками CD3 и, что указывает на миграцию незрелых Т-клеток, полученных iPSC, в доли (рисунок2A).
Т-клетки, которые мигрировали и созрели в тимской микросреде, впоследствии выбыли как iTE. Чтобы проверить их фенотипической характеристики, поток цитометрического анализа C57BL6 тимоцитов, Pmel iPSC полученных незрелых Т-клеток (экстратимные), и клетки, которые выйти из тимических долей (iTE) было выполнено. Экстратимные Т-клетки на OP9/DLL1 показали CD4иCD8 (DP) Т-клетки и Т-клетки CD8'SP без выражения положительного маркера отбора MHC-I, в то время как iTE имела четкую популяцию CD8'SP MHC-Iи Т-клеток фенотипа, указывая на их успешный проход через положительный отбор до выхода из тимических долей. iTE последовательно выражают MHC-I и CD62L, которые являются маркерами, связанными с высокой пролиферативной компетентности, производством цитокинов, периферийным выживанием и лимфоидным самонаведением18,19,20. Этот фенотип согласуется с M2 SP тимоцитов, которые являются наиболее зрелой популяции одного положительных Т-клеток в тимуса20, что свидетельствует о том, что iTE перешли через нормальную тимическую программу развития (Рисунок 3). Для контроля эффективности генерации iTE были выделены клетки, выпавшие из отдельных тимических долей. На 7-й день, тимики доли генерируется в среднем 1 х 103 жить CD8SP CD45.1CD3 cd3iTE в день (рисунок3B). Аналогичный уровень производства iTE наблюдается со дня 6 до дня 12 3D тимской ко-культуры.
Антиген-зависимая активация и секреция цитокинов были проанализированы для наблюдения за функциональными свойствами тимически образованных незрелых Т-клеток, полученных от iPSC. При наличии нерелевантного пептида (нуклеопротеина) Пмель-иТЕ не высвобождавал значительное количество ТНФ-З, ИЛ-2 или ИФН-З. При стимуляции с коньячным пептидом для клеток Pmel T (hgp100), Пмель-iTE выпустила надежное количество ТНФ-Я и IL-2, а также производит небольшое количество IFN-Я (Рисунок 4), что свидетельствует о том, что тимически образованных iTE может распознать их коньяк пептид и секретный эффектор цитокинов с профилем, напоминающим профиль естественных недавних тимских эмигрантов (RTE).
Для изучения транскрипционных различий между iPSC-полученных T линейных клеток дифференцированных на OP9/DLL1 с или без тимического образования (т.е. iTE против экстратимных Т-клеток), РНК-сек анализ был выполнен на этих двух популяций и по сравнению к клеткам линии DP T, дифференцированным с помощью OP9/DLL1 (DP) и первичных наивных CD8и Pmel T-клеток. Выражение 102 генов, которые играют решающую роль в Т-клеток онтогена, тимоцитов активации, и формирование памяти были проанализированы15,20,21,22. Основной компонент анализа этих четырех изученных популяций показал, что экстратимически генерируемые DP и CD8SP T-клетки сгруппированы вместе, в то время как iTE сгруппированы ближе к наивным Т-клеткам(рисунок 5). В совокупности эти данные показывают, что iTE имеет фенотип ближе к наивным Т-клеткам, чем т-линии клеток, генерируемых экстратимическими методами.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg"> Рисунок 1 : Схематический обзор дифференциации iPSC к iTE с использованием OP9/DLL1 и 3D тимической культуры. Протокол включает в себя три отдельных шага дифференциации; (Слева) от клеток iPSC к гематопоитетической линии клеток на OP9/DLL1 (день от 0 до 6), (Средний) от гематопоиетических клеток линии до незрелых Т-клеток на OP9/DLL1 с цитокинов (день 6 до 16-21), и (справа)от незрелых Т-клеток (день 16-21) до iTE с использованием 3D тимической системы культуры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg"> Рисунок 2 : Иммуногистохимия тимических долей, посеянных с незрелыми Т-клетками, полученными iPSC. Вверху: H и E окрашивание тимической доли с и без посева iPSC полученных незрелых Т-клеток. От второго сверху вниз: конфокальные изображения разделенных долей, окрашенных DAPI (ядро), CD3 (T ячейка), и слияния. Шкала баров 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg"> Рисунок 3 : iTE показывает посттимичный фенотип Т-клеток. (A) АНАЛИЗы FACS тимоцитов, экстрагимических Т-клеток (система сокультуры OP9/DLL1) и Pmel-iTE. Клетки в живых клетках были закрыты на конгенивных CD45. Популяции CD8 SP были дополнительно проанализированы для выражения CD62L и MHC-I. (B) Среднее количество CD8SP CD45.1 iTE производится на ночь на доли 7 дней после предварительного посева. Данные были собраны в ходе 12 независимых экспериментов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg"> Рисунок 4 : iTE производят различные цитокины путем антиген-специфической стимуляции. FACS анализирует внутриклеточную выработку цитокинов iTE. iTE были совместно культивированы с БТР предварительно загружены нерелевантных (нуклеопротеин) или коньяк (hgp100) пептид в течение трех дней. Цифры, показанные в верхних правых квадрантах, указывают на проценты iTE, производящего цитокин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg"> Рисунок 5 : Анализ всего транскриптома показывает сдвиг в экспрессии гена iTE в сторону наивного CD8 + T-клеточная программа. Принцип анализа компонентов (PCA) данных РНК-сек из DP, экстратимических CD8 SP, iTE и наивных Т-клеток. (Анализ 102 генов, связанных с тимической дифференциацией с использованием общедоступной базы данных GSE105110) 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants at JoVE.com

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

В этой статье описывается новый метод для создания опухолевых антигенов-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных тимических эмигрантов (iTE) трехмерной (3D) тимской культуры системы. iTE - это однородное подмножество Т-клеток, тесно связанных с наивными Т-клетками с способностью к пролиферации, формированию памяти и подавлению опухолей.

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Поколение тимических эмигрантов, полученных iPSC, с помощью 3D-тимической культуры органов является первым методом in vivo, регенерирующим однородную популяцию опухолевых антиген-специфических наивных Т-клеток. Основными преимуществами являются iTE являются более физиологическими актуальными, и этот метод является более мощным, чем любой другой метод дифференциала in vivo для производства постоянно конкретных Т-клеток. iTE является однородным расстройство CD8 альфа-бета антигенных конкретных Т-клеток с наивным Т-клеток, как функциональный фенотип, в том числе способность к пролиферации, ремодиформации, и подавление опухоли in vivo.Демонстрация процедуры будет доктор Рафикул Ислам пост-док в моей лаборатории. Для начала культуры OP9/DLL1 клетки в OP9 СМИ при 37 градусах по Цельсию. Когда клетки достигают 80 до 95 процентов слияния, мыть их один раз с одним X магния, кальция и фенола красный свободный PBS.Добавить четыре миллилитров точки ноль пять процентов трипсина и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем добавьте четыре миллилитров средств массовой информации OP9 и пипетки, чтобы отмежеваться от клеточного слоя и сделать одноклеточную подвеску. Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через 100-метровый клеточный ситечко.Центрифуга при 300 Г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать суппурат и повторно приостановить клетки в 12 миллилитров OP9 средств массовой информации. Затем пластина два миллилитров OP9/DLL1 клеточной подвески в новый 10 сантиметров клеточной культуры Петри блюдо.Добавьте еще восемь миллилитров средств массовой информации OP9. Повторите этот отрывок каждые два-три дня. На нулевом дне урожая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в качестве одноклеточной суспензии путем трипсинизации.Соберите клетки и центрифугу при 300 Г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить IPC на плотность 100000 ячеек на 10 миллилитров OP9 средств массовой информации. Затем пластины 100000 клеток на слияние OP9/DLL1 10 сантиметров блюдо.Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентной двуокиси углерода. На третий день аспирировать старые средства массовой информации и заменить его на 10 миллилитров свежих средств массовой информации OP9. На шестой день мыть каждые 10 сантиметров confluent OP9 блюдо с 10 миллилитров PBS.Добавить три миллилитров точки ноль пять процентов трипсина к каждому блюду. И инкубировать в течение трех-пяти минут при комнатной температуре. Добавьте четыре миллилитров средств массовой информации OP9 и аккуратно пипетки для сбора ячеек.Пройдите клетки через 100-метровый клеточный ситечко и центрифугу при 300 Г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант. Повторно приостанавливать клетки в 10 миллилитров дифференциации средств массовой информации.Плита подвески клетки на новый 10 сантиметров OP9/DLL1 слияние блюдо. Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентной двуокиси углерода. На девятый день, аспирировать старые средства массовой информации и заменить его на 10 миллилитров свежих средств дифференциации.Продолжить инкубации клеток при 37 градусов по Цельсию и пять процентов CO2. На 11-й день, когда кардиомиоциты наблюдаются в колониях iPSC, используйте пипету для механического отсоединея неприлиптных клеток. Фильтровать клетки через 100-метровый клеточный ситечко и центрифугу при 300 G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.После этого аспирировать супернатант и повторно приостановить клетки в 24 миллилитров дифференциации средств массовой информации. Плита iPSC в слияние OP9/DLL1 шесть пластины хорошо. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с пяти процентов углекислого газа.На 15-й день соберите все неприязаемые клетки и отфильтруйте их через 40-метровый клеточный ситечко. Центрифуга при 300 Г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Продолжайте проходить через неприятательные клетки каждые три-четыре дня, как описано ранее.На седьмой день лечения DGWO, принять четыре новых 10 сантиметров блюд. Заполните каждое блюдо 20 миллилитров полных средств массовой информации. Перенесите все мембраны нитроцеллюлозы с тимическими долями в одно 10-сантиметровое блюдо.Используя типсы, отсоедините отдельные доли от мембраны, позволяя им погружаться в средства массовой информации. Инкубировать доли в течение одного часа при комнатной температуре. Затем перенесите тимические доли в новое 10-сантиметровое блюдо с полными средствами массовой информации.И инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. Повторите эту передачу и инкубацию еще два раза. Используя типсы, исправить тимические доли к блюду при использовании другой стороны, чтобы сделать 100 до 200 микрометров глубокий разрез в центре и расширение половины диаметра доли для облегчения миграции Т-клеток прародителя в долей.Перенесите тимические доли в новое 10-сантиметровое блюдо, наполненное полными средствами дифференциации. При использовании пластин 3D культуры с сетками нижнего и верхнего уровня, заполнить обе сетки стерильными PPS для предотвращения испарения и сушки висячих капель. Следующая передача 30 микролитров полных средств массовой информации, содержащих один DGWO лечение тимической доли в каждом колодец 3D пластины культуры.Со-культуры OP9/DLL1 со-клетки линии T. И повторно приостановить клетки при плотности от 2000 до 5000 Т-клеток линии клеток на 20 микролитров средств массовой информации. Добавьте 20 микролитров подвески клеток линии T к каждой тимической доле в пластине 3D культуры.Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентным углекислым газом. На следующий день установите трубу P200 до 30 микролитров. Pipet средств массовой информации в каждом хорошо вверх и вниз несколько раз, чтобы удалить все клетки, окружающие тимические доли.Затем аспирировать средства массовой информации из каждой хорошо и заменить его 30 микролитров полного средства массовой информации. Повторите этот процесс, трубы, удаление, и замена средств массовой информации пять-семь раз, чтобы удалить любые дополнительные незрелые Т-клетки, которые не мигрируют в доли. Продолжить инкубации долей, убедившись, что изменить от 25 до 30 микролитров средств массовой информации в день.На четвертый-пятый день используйте световую микроскопию, чтобы подтвердить образование ореола тимических эмигрантов, полученных iPSC, вокруг долей. Соберите iTE ежедневно путем трубопроводов средств массовой информации без нарушения доли. Меняем средства массовой информации каждый день и продолжаем сбор примерно до 12 дней.Собранные iTE готовы к использованию для молекулярного анализа или экспериментов по трансплантации in vivo. В этом исследовании, совместно культурных фетальных тимусов разделиться для анализа ли iPSC производных Т-клеток линии клетки могут мигрировать в тимические доли. Un-seeded доли управления имеют архитектуру ткани, характеризующуюся астроцитов, как тимическая эпителиальная паутина развернуты эндогенных CD3 положительных клеток.Однако тимические доли, посеянные с iPSC производных незрелых Т-клеток перенаселены CD3 положительные моноядерные клетки, указывающие на миграцию iPSC производных незрелых Т-клеток в доли. Т-клетки, которые мигрируют в, и зрелые, в рамках тимической микроокнимации впоследствии выход как iTE. Цитометрический анализ потока затем используется для проверки фенотипической характеристики различных клеток.Дополнительные тимические Т-клетки показывают CD4, CD8 двойные положительные Т-клетки и CD8 альфа-одиночные положительные Т-клетки без выражения положительного маркера отбора, MHC Class One, в то время как iTE являются однородной популяцией CD8 альфа-одного положительного MHC Class One положительного фенотипа Т-клеток, указывающего на их успешный проход через положительный отбор до выхода из тимической доли. iTE имеют антиген-специфичность против пептида cognate. iTE совместно с антигеном, представляя клетки, предварительно загруженные с нерелевантным пептидом, как нуклеопротеин, не проявляются в клеточном производстве цитокинов.Однако iTE со-культуры антигена представления клеток предварительно импульсных с cognate пептид GP100, производить внутриклеточно TNF альфа интерлеукин ii и интерферон гамма. Пожалуйста, помните, что культура открытых ячеев линии сильно зависит от слота ABS. Сгенерированный iTE может быть использован в любом другом анализе, работающем с обычными Т-ячейками.Например, анализ Т-клеток, анализ производства цитокинов, регрессионные испытания опухоли in vivo, исследование дифференциации Т-клеток и так далее. Эта технология может быть применена ко многим иммунологическим или таким проектом. В том числе дифференциации Т-клеток, импульс времени созревания Т-клеток, и генерации антиген-специфических Т-клеток из гематокрита прародителя или стволовых клеток.После просмотра этого видео зритель должен понять, как генерировать индуцированные плюрипотентные, стволовые клетки, полученные, опухолевый антиген специфических тимических эмигрантов с помощью 3D тимической системы культуры органов.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Опухоль Модель и опухолевой мышиной цистопластики Система обнаружения

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Мышь Модель усталости, индуцированный Peripheral Облучение

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Продольные морфологических и физиологических мониторинг сфероидов трехмерной опухоли с помощью оптическая когерентная томография

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Трехмерная модель сфероидов для изучения стволовых клеток рака толстой кишки

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...