Name: reproductive techniques for ovarian monitoring and control in amphibians
Uploaded: 2019-05-12T12:30:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians at JoVE.com

娜塔莉·卡拉塔尤德感谢芭芭拉·达兰特博士在超声波方面给予的培训和帮助,并感谢S.A.(EISA)的Exploradora de Immuebles,感谢她为我在SDZG的副研究员职位提供财政援助。感谢Kylie Cane博士对手稿的评论,以及官方评论者(无论他们是谁)。感谢乔纳森·戴因我们的2018年夏季研究员,圣地亚哥动物园保护研究所提供的照片(图1A,B)。莫妮卡·斯图普斯感谢动物园和水族馆保护捐赠基金协会和迪斯尼世界保护基金为建立圈养的Necturus种群提供财政支持。此外,还通过两栖动物倡导者Iris de la Motte女士的私人捐款获得支助。感谢克里斯托弗·德坎特先生和马克·坎贝尔博士对这项研究的重大贡献。

萨拉曼德程序由辛辛那提动物园和植物园 (CZBG) 机构护理和使用委员会 (IACUC) 协议 11-106、 13-110、 14-133 和 15-138 批准。所有青蛙和蛤类程序都通过了圣地亚哥动物园全球(SDZG),机构护理和使用委员会(IACUC)协议:15-001,16-005和18-003。
国家自然历史博物馆(巴黎)伦理委员会根据《国家自然史博物馆》和《植物保护》原则批准了动物的护理和治疗。(Génie Génétique委员会,《服务服务方向》,欧洲联盟第2010/63/欧盟指令,协议第20号决定。C75-05-01-2,用于实验和其他科学目的的脊椎动物欧洲公约。本研究中使用的所有协议均以参考号68-037获得批准。
1. 非侵入性卵巢监测技术
<ol><li>目视检查和触觉<ol>
<li>用下面描述的三种方式之一握住女性阿努兰。<ol>
<li>用戒指和小手指固定青蛙或蛤的腿,用食指和中指支撑青蛙身体的背侧(腹部),用拇指支撑腹腔侧(图1A)。</li>
			<li>用拇指在腹部抓住青蛙或蛤蛤,其余手指固定动物的背部。使用非主导手来触手可及动物的腹部,感觉是否有皮下凸起(图1B)。</li>
			<li>把青蛙或蛤的腹部放在手掌上,前臂覆盖在食指上,拇指放在上背部。</li>
		</ol>
</li>
		<li>由于牛科特在自然界中是完全水生的,因此通过下面描述的两种方法之一进行目视检查。<ol>
<li>将动物移到一个单独的 4 L 容器,其中包含水箱水。举起容器(盖固定),将手电筒照射在底面,以可视化鸡蛋的存在/不存在。</li>
			<li>在 MS222 中麻醉 (0.5 g/L;三甲甲甲酸酯,缓冲0.5M NaHCO3。感应后,将动物旋转到背部并检查腹部。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>形态评估<ol>
<li>阿努兰斯 注:无需麻醉。<ol>
<li>使用卡钳,测量动物从嘴尖,沿着身体的中心到尾巴的尖端,以获得SUL和SVL(图2A,B)。</li>
			<li>以数字精密尺度处理塑料容器。将动物放入柏油容器并称重(图2C)。</li>
			<li>对于较大的动物,如牛蛙,或在野外获得重量时,请使用悬挂秤(图2D)。</li>
			<li>与许多阿努兰物种一样,根据体型较大和手上缺乏婚礼(拇指)垫来区分R.Muscosa成年雌性(图3)。</li>
			<li>计算身体状况,作为对整体健康状况的基本评估,公式如下: 富尔顿的索引:K = 质量 = 长度3 注: 富尔顿索引使用与质量和长度相关的体积的维度平衡,其中3是以等轴测方式关联质量和长度的缩放指数。</li>
		</ol>
</li>
		<li>考蒂<ol>
<li>在将非麻醉动物放入内之前,用空袋子进行量表。注意不要引入多余的水(图2D),并迅速采取行动,因为动物分泌粘液作为被抑制的压力反应。</li>
			<li>通过在可重新密封的塑料袋底部或可以容纳膨胀卡钳的单独塑料容器中固定个人,获得成人测量。</li>
			<li>使用卡钳测量车身长度 (图 2E)。</li>
			<li>测量从鼻尖到尾端 (SVL) 的翘尾,以监测生长。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>行为观察<ol>
<li>实时物理观察动物或使用摄像机记录行为。</li>
		<li>记录动物观察对行为进行分类并构造一个内造图(图4)。</li>
		<li>对生殖行为进行分类 注:图4举例说明了在阿努伦观察到的一种生殖行为。</li>
	</ol></li>
	<li>超声 注:选择的超声传感器,在这种情况下,7.5 mHz线性或多频(10-6千赫)微凸,建议用于Necturus和10 MHz探头和水溶性,无盐凝胶R.mussa。 对蜥蜴进行超声波检查可能需要麻醉(有关说明,请参阅第 1.5 节)。<ol>
<li>阿努兰斯<ol>
<li>使用两个人对R.Muscosa执行超声波检查(图5A)。</li>
			<li>第一人称:用主导手握住动物,将水溶性、无盐凝胶涂在动物腹部。</li>
			<li>第二人称(超超声学家):将10 MHz探头放在主导手上,并将其涂抹在腹部,确保探头与凝胶之间保持良好的接触。</li>
			<li>从手臂坑下方向内滑动,朝动物腹部中线中心滑动,以可视化整个卵巢。</li>
			<li>超超声学家:使用非主导手冻结帧,并在超声波上捕捉所需的图像。</li>
			<li>根据为属4建立的分级系统对卵巢周期的阶段进行分类(表2,图5B-F)。</li>
			<li>在手术结束时冲洗动物的任何凝胶。</li>
		</ol>
</li>
		<li>考蒂<ol>
<li>将非麻醉的Necturus转移到4L矩形容器中,里面装满了2L的水箱水。</li>
			<li>通过关闭房间灯和/或将一只手托在动物头上,尽量减少动物运动。</li>
			<li>将传感器放置在距车身壁 1-2 厘米的距离处。</li>
			<li>找到心脏在腹腔中线水平到前肢,然后移动传感器出,并检查卵巢组织7。</li>
			<li>根据为属4建立的分级制度对女性进行分类(图6A、B、C)。</li>
			<li>当动物的身体与传感器成一定角度时(即,不是线性的,而是轻微的弧形的)时,通过捕捉图像,在中后期的重力阶段获得精确的卵子测量;图 6B.否则,重叠的卵泡使得很难区分单个卵子的大小。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>麻醉诱导和恢复<ol>
<li>阿努兰斯<ol>
<li>在 MS222 中麻醉 (0.5 g/L;如前所述,三氧化二甲酸酯缓冲(0.5M NaHCO3)。</li>
			<li>使用正确的反射作为动物麻醉程度的主要指标。完全反射损失表明深度麻醉状态。</li>
			<li>一旦正确的反射丢失,将动物从水浴-基于麻醉(MS-222)中取出。</li>
			<li>将动物放在湿毛巾上(用无麻醉剂脱氯水)。</li>
			<li>在整个外科手术过程中,确保保持动物的湿润。</li>
			<li>用红色橡胶导管、未铐住的管子或经典袖口内切管插入小型两栖动物,而不会使袖口膨胀。</li>
			<li>提供低流量的氧气(0.5-0.75 升/分钟),含0.5-1%的非氧。</li>
			<li>手术后停止共和体,但保持氧气流动1分钟。</li>
			<li>给动物排泄,用无麻醉的脱氯水彻底冲洗动物2分钟。</li>
			<li>将动物放入浅量的去氯化水中或湿毛巾上。</li>
			<li>通过轻轻拉动后肢以拉长,评估动物的恢复情况。肢体的任何反应收缩都表示戒断反射。</li>
			<li>监测其他恢复指标,如肺气囊呼吸(咽喉运动)和右反射。</li>
			<li>考虑当所有反射都恢复的两栖动物,心脏和呼吸速率已恢复到麻醉前值。</li>
		</ol>
</li>
		<li>考蒂<ol>
<li>在MS222(0.5克/升三甲甲酸酯)中麻醉Necturus和Ambystoma,在4L矩形罐中用0.5M NaHCO3(MS222)缓冲。</li>
			<li>将空气石(1 英寸)和空气泵放入油箱,并将其打开至恒定的流量,以提供足够的氧合。</li>
			<li>当肢体功能和右反射丧失时,将动物从水浴-基于麻醉(MS-222)中取出,并将动物放在湿毛巾上(无麻醉脱氯水)。</li>
			<li>用一瓶罐水挤压保持皮肤和刺的水分。</li>
			<li>为了找回动物,小心地将其放在一个4L的塑料容器中,里面装满了2L的水箱水,里面装有空气石。 注:恢复从刺闪烁开始,然后是移动尾巴和向前推进,最后四肢功能运动的能力。</li>
			<li>在接下来的 24 小时内,将动物返回到其原始外壳水箱并密切监控。 注:两栖动物的其他麻醉方法存在,这些方法在赖特和惠特克8中描述。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 侵入性卵巢监测和控制技术
注:这个程序已经适应了Forzón等人10。
<ol><li>抓住青蛙在占主导地位的手,用无菌抹布或纱布擦干青蛙脸上的静脉穿刺侧。</li>
	<li>擦干面部,避免血液过多地分散在皮肤上。</li>
	<li>插入针头(26 G 1/2"和 27 G 1/2"),斜面朝上,穿过眼部周围凸起的皮肤和上颌脊相接的皮肤,形成三角形的点(黄色轮廓)(图7A),接近面额面部护理维纳轨道后。</li>
	<li>刺穿右眼下方和上颌脊上方的面部静脉,从眼睛中线回到1-2毫米之间(图7A)。 注:对于较小的青蛙(低于 20 g),将插入点移近于眼睛中线正下方的位置。</li>
	<li>将微造血球管向下倾斜,使重力帮助血液流入管中。穿刺后血液应立即流动(图7B,C)。</li>
	<li>在血流的第一个迹象,将微血球菌管的尖端放在穿刺部位,收集1-2个满的微血球管,并将管子放入适当的贮器中进行收集(图7B,C)。</li>
	<li>如果血液不能轻易流动,或体积非常低,则稍微移动插入针头或将针头插入面部的另一侧。</li>
	<li>将纱布牢固地压到穿刺部位至少 20 秒,从而停止出血。</li>
	<li>将青蛙从水中离开10分钟,以确认穿刺部位不重新开放。</li>
	<li>对取样的每个青蛙使用新的针头和新的微血红管。</li>
</ol>3. 激素诱导
<ol><li>激素制剂<ol>
<li>在使用前立即准备激素注射,以确保最大效果。</li>
		<li>从表1中列出的选择中选择一种激素。</li>
		<li>使用体重16的μL或mL/g确定要注射的激素的浓度。</li>
		<li>稀释激素在以下之一:水,磷酸盐缓冲盐水(PBS),盐水两栖环线溶液(SARS)或盐水。</li>
		<li>对于体重为 30-70 g 的青蛙,不要超过 200 μL 的注射体积,对于体重为 80-110 g 的青蛙,不要超过 200 μL 的注射体积(个人观察)16。</li>
		<li>为了在激素给养过程中正确持有10-100克的任何动物,请使用第1.1节所述的任何适当方法进行饲养。</li>
	</ol>
</li>
	<li>阿努兰斯<ol>
<li>使用每体重计算一克(g/体重),计算每人所需的浓度。</li>
		<li>就在管理之前,在无菌稀释物的选择中重新组织。</li>
		<li>在注射前,确保注射器中未留有气泡。</li>
		<li>将动物牢牢地握在非主导手上,用主导手进行注射。</li>
		<li>根据激素规格进行注射。最常见的注射在阿努兰是下皮,腹内或肌肉内(图8)。</li>
		<li>在腹部下部或靠近后腿的身体部位或下部进行IP注射(图9)。</li>
		<li>最好在后腿上进行肌肉内注射。</li>
	</ol>
</li>
	<li>考蒂斯 (内图斯)<ol>
<li>根据上述每个体重的克法,在无菌水中重组选择的激素。</li>
		<li>在Necturus的情况下,使用1.7-2.3 μg GnRH/g体重的剂量。</li>
		<li>从麻醉室中取出Necturus,放在45°表面上,上面覆盖着手术窗帘。</li>
		<li>用头朝下放置动物。</li>
		<li>以 15-20° 角度接近腹部的后象限(后腿的尾部)。小心不要将空气引入注射器。</li>
		<li>使用胰岛素注射器和 27-30 G 针头注射 (IP)。</li>
		<li>使用胰岛素注射器和27-30G针头注射激素。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 外科
<ol><li>一般手术准备和程序<ol>
<li>要维持无菌程序,请使用透明无菌塑料窗帘隔离手术部位。通过保持周围皮肤湿润来减少蒸发。</li>
		<li>用无菌水润湿任何会接触动物皮肤的材料。使用 15 号或 11 号手术刀进行皮肤切口。 注:冷钢、放射外科或二极管激光的组合。轻度出血手术中的止血可以通过电烧机或二极管激光来实现。</li>
		<li>使用棉尖矛或施用器,允许对小血管施加局部压力,以跟踪失血情况。</li>
		<li>使用棉尖长矛或施用器管理小密闭空间,而不是标准纱布方块。</li>
		<li>对体重小于1公斤的动物进行手术时,使用微型仪器,如眼科仪器,用细小的提示。</li>
		<li>使用塑料、自固定式缩回器(例如,孤星缩回器)来安装不同尺寸的切口。</li>
		<li>使用眼睑缩回器缩回眼缩切口。</li>
		<li>必要时使用放大仪器对小患者进行手术。 注:两栖动物的任何外科手术都需要麻醉。在手术期间未能给予适当的麻醉,与正常功能的延迟恢复有关。此外,麻醉剂可有效麻醉药物的作用(表3)34。</li>
	</ol></li>
	<li>阿努兰斯<ol>
<li>一旦X.laevis被麻醉,如步骤1.5.1所述,将动物置于背退性(图10A,C)。</li>
		<li>在手术现场用稀化波维酮碘溶液(1/10)在手术部位用10-15s或0.75%氯西丁溶液在手术现场至少10分钟进行无菌处理。</li>
		<li>在中圆锥体(肩部和氯卡之间)进行 3 mm 的副中位皮肤切口,用一条大胆的笔触留下一个干净的切口,使用 15 号或 11 号手术刀。 注:可以使用二极管激光也用于皮肤切口。</li>
		<li>抬起腹膜,制作和切口,并使用15号或11号手术刀仔细解剖。(图10B,D.</li>
		<li>用眼睑缩回器(或任何适当的设备)缩回眼缩切口。</li>
		<li>去除一部分蛋质量,而不沾上任何血管。</li>
		<li>对于完整的卵巢切除术,通过电烧或激光二极管烧灼周围血管(图11)。</li>
		<li>使用单丝缝合线,关闭切口与中断,不断缝合模式。</li>
	</ol></li>
	<li>考蒂<ol>
<li>一次墨西哥已经麻醉,把它放在右侧复位,左骨盆肢体简单地放在对尾基。</li>
		<li>将湿润无菌纱布与稀化的化比酮碘溶液(1:10)放在现场10-15秒,无菌地准备手术现场。 或者,使用浸泡在0.75%氯西丁溶液中的无菌纱布,并在手术现场放置至少10分钟手术前(图12A)36,37。</li>
		<li>在肩部和后肢之间画一条线,将身体分成三个相等的部分(图12B)。</li>
		<li>在第二和第三部分之间制作切口点。</li>
		<li>抓住底层肌肉,从神经质上提升。</li>
		<li>轻轻地用力通过粘膜将小血小气囊进入腔腔。</li>
		<li>用眼睑缩回器(或任何适当的材料)缩回眼缩切口(图12C)。</li>
		<li>对于完整的卵巢切除术,通过电烧或激光二极管烧灼周围血管(图12D)。</li>
		<li>使用单丝缝合线,关闭切口与中断,不断缝合模式。</li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

直接处理、目视观察和形态测量提供了非侵入性技术,是确定女性生殖阶段的首要评估标准。然而,这项研究表明,肉体卵巢并不总是通过触觉可靠地识别。根据物种的不同,重力卵巢有时可以通过动物腹侧半透明(图13A,B)或完全半透明的皮肤进行目视检测(图13C)。完成排卵的女性与肉体女性相比,其外观可能有明显变化(例如,皮肤松弛,身体质量损失高达30%,图13D)。在繁殖过程中,雄性和雌性将表现出某些行为,这些行为提供有关接近排卵和排卵的信息。在R.muscosa的情况下,表明女性接近排卵开始与女性进入手架。
超声波技术在阿努兰和考斯的影响下应用,可以诊断卵子是否存在,以及排卵是否与发育的卵子的完全或部分释放有关。因此,这种方法提供了更完整和准确的生殖状态评估,而不局限于通过可视化技术确定肉体/非肉体状态,这种可视化技术因腹部皮肤透明度或表皮一致性而变化。不同的两栖动物物种。超声波可以相对容易地进行,对动物几乎没有压力(图5和图13),并可用于描述生殖周期和确定生殖状态4。熟悉物种至关重要;然而,这项研究显示,Necturus和R.Muscosa在其生殖模式中有着共同的发育迹象,允许对生殖阶段进行类似的分类(图5)。通过这项技术,现在有证据表明,在圈养的Necturus和R.Muscosa中,卵子发育高度,而且这两种物种都遵循季节性模式。虽然这些现象的原因不明,需要进一步调查,如果不使用超声波,卵巢功能障碍的几个领域,如卵子保留和部分排卵,将不被发现。今后应用这项技术将用来确定是否应选择雌性在任何特定年份繁殖,以及是否完成排卵。
血液收集协议,如在R.Muscosa中提出的,它既有效,对动物造成最小的痛苦,是研究圈养和野生捕获的阿努兰人(Calatayud,未发表的)激素的最佳状态。迄今为止,没有关于圈养R.Mussa的年度激素概况的信息,因此,没有关于激素如何影响其健康和繁殖的知识。此外,随着证据表明,该物种的雌性可能不是年度育种者,荷尔蒙分析将是跟踪卵巢周期的另一种方法。与超声波一起, 激素分析可能导致更好的预测什么女性将准备排卵.此外,在过去一年里,有两例圈养的R.Mussa种群的两例性间病例记录在案。此外,拇指垫的发展已经注意到一些较老的创始女性。原因目前正在调查之中,但初步结果显示,这可能与睾丸激素水平的变化(卡拉塔尤德,未发表)。不同年龄的女性的荷尔蒙周期将帮助我们理解为什么女性可能发展男性相关的继发性特征,以及这是否是预期在老龄化人群中。
外源激素疗法已用于克服在圈养两栖动物中经常遇到的生殖功能障碍。然而,在这项研究中,对于R.mussa和Necturus种群,分别在2年和5年的时间里,在激素治疗和对照女性之间的排卵位没有显著差异。这可能表明激素给药协议, 剂量, 启动和激素组合使用是不够的物种.对个体女性生殖史的更仔细分析表明,R.Mussa可能没有每年繁殖,这也可能导致治疗女性缺乏荷尔蒙效应。因为每年有一定比例的雌性不断跳过繁殖,了解该物种的自然历史有助于确定是否需要外源性激素以及何时可能最有效。本文中概述的程序可适用于若干物种(表1),适用于5g至150g的阿努兰;较大的动物可能需要不同的注射器和针片。注射的位置因一些需要肌肉内、腹内、下皮或内皮注射的激素而异(图7)。
以卵巢切除术为目的的手术是各种两栖动物获取卵母细胞用于胚胎学研究的常用方法。卵子切除术也可能用于人口控制和医疗问题,如卵子保留。在部分卵巢切除术的情况下,为研究目的进行卵母细胞收获,手术必须确保动物保持繁殖。PGF2+的管理在解决女性R.Muscosa的卵子保留方面显示出一些希望。在几个个体中,PGF2=导致先前保留的卵子完全沉积,但在其他个体中,只有部分沉积需要手动剥离才能去除所有卵子。虽然PGF2+可以替代在R.Mussa中保留卵子的手术,但其治疗其他两栖动物类似病理条件的能力需要特定物种的验证。当手术干预被授权给阿努兰或考达病人时,有必要在切口之前确保适当的麻醉平面。需要敏锐的观察技能来评估和监测本研究对每个分类的规范诱导和恢复反应。一旦熟悉特定的解剖学,适当的手术方法,血相变,温和的组织操作和适当的术后管理,生殖手术不会构成压倒性的障碍。

长期以来,两栖动物被广泛的研究学科所认可为重要的生物学和医学模型。通过研究特定物种获得的数据,如Xenopus laevis和X.热带,豹蛙(原拉纳)和阿索洛特尔(墨西哥阿姆比托马)已应用于许多其他脊椎动物物种,包括人类。研究这些两栖动物和其他两栖动物后产生的兽医、畜牧业和辅助生殖技术,为那些负责成功照顾、维持和维持圈养中稀有种群的人提供援助1,2,3,4.
兴趣正在增加,同时使用基于原地保护的方法,以扭转许多处于危险中的两栖物种1、2的灭绝潮。本文提供了目前可用于监测和控制阿努兰和考特斯模型物种中的两栖卵巢功能的方法。此外,还介绍了解决卵子保留常见生殖病理学的现有技术。
与许多分类组一样,两栖卵巢控制涉及环境和生理学之间的一系列紧密同步的相互作用。温度和光周期(称为近视信号)被眼睛和大脑解码,它们被迅速转换成遗传、荷尔蒙和昼夜过程(最终信号)3,4。本文介绍的监测和控制卵巢功能的方法包括侵入性和非侵入性技术。机构动物护理和使用委员会(IACUC)的研究和教学要求定义非侵入性技术,那些将造成最小至无身体疼痛或精神痛苦,不需要止痛药5。在这里,非侵入性技术包括目视检查和触觉、行为观察、形态测量和超声波。相反,采血、激素管理、手术(卵子切除术和取出保留的卵子)的技术被归类为侵入性,因为它们可能导致一些疼痛或不适,需要麻醉或手术后药物治疗。
非侵入性卵巢监测技术可以很容易地纳入大多数圈养两栖动物的日常护理程序。根据物种的不同,卵巢的重力通常可以通过简单的目视检查(玻璃青蛙)来确定。在其他情况下,触觉可能表明女性是否具有肉汁。各种身体状况指数(BCI),如体重,鼻孔型长度(SUL),鼻孔-通风长度(SVL)和标准质量指数(SMI)可用于预测卵子的存在或不存在4,6,7, 8,9.然而,应该注意解释结果,因为大多数人不考虑年龄,体形或组成(例如,水保留与卵巢质量或脂肪)6 。明确的生殖诊断可以通过超声波获得关于卵子发育和卵巢周期4,7的分期更深入的知识。超声波也提供了一种确认和监测生殖病理和相关生理状况的手段4,8。
除了提供有关健康状况的信息外,血液取样还可用于测量生殖激素。如果激素分析是最终目标, 重要的是要避免压力相关的影响, 可能会混淆系统类固醇数据.虽然一个潜在的强大的监测工具, 尚未有一项研究证明先天内分泌反应外源激素给任在任何两栖物种.血液可以从几个地点安全地取出;在青蛙中,这包括腹腔静脉、语言丛、股骨静脉和心脏9、10。在Caudates中,血液是从腹腔尾静脉采集的。在为两栖患者选择采集技术时,侵入性程度、所需的约束量、麻醉剂的需要、被攻击器官的美味度以及动物的大小都是需要考虑的因素。本文将介绍从青蛙的面部上颌或肌肉皮静脉采集血液的技术,如Forzan等人最初描述的。
卵巢控制是特定于物种的,因此,激素协议应进行测试和优化。除了季节性和相关循环激素环境,卵巢控制也可能与年龄、被囚禁时间以及反复服用激素密切相关,文献中的信息很少11,12,13.实施激素疗法,以引起生殖行为、药物产生、成熟和排卵已成为广泛报道的解决与圈养有关的常见生殖问题的方法4 8,14,15,16.由于控制脊椎动物繁殖的机制是高度保守的,有一些激素,神经肽和商用药物用于治疗其他分类组,也可以可靠地用于一些两栖动物物种(表1)。腺激素释放激素 (GnRH) 和人类胆囊性促性腺激素 (hCG) (或其变体, 即 PMSG 和 eCG)17,18,单独或组合, 已广泛用于两栖俘虏繁殖计划包括:南落基山(阿纳西鲁斯-罗塔斯)4、19、20;蛤, 杜斯基戈弗青蛙,拉纳塞沃萨(朗霍恩等人, 未出版)7;墨西哥湾沿岸水狗,内图鲁斯贝耶里20;怀俄明州蛤,阿纳西鲁斯巴克蒂18;牛蛙,拉娜卡茨比亚纳21;美国蛤,阿纳克斯鲁斯美国22;草蛙,林诺迪亚斯特塔斯马尼西斯23;科基,埃莱乌德·罗科伊图斯·科基24;异欧普,西诺普西莱维25;冈瑟的蛤蛤,普塞多夫林·甘特里26;北方豹青蛙,利托贝特皮皮恩;阿根廷角蛙,陶瓷华丽;克兰威尔的角蛙,C.克兰韦利;美国地面蛙,奥多托夫里努斯美国27;和火蜥蜴(萨拉曼德拉)228。类固醇激素,如孕酮(P4),是较少报道,但已表现出良好的疗效,在引排排和排卵在某些物种的阿努兰16,18,29.前列腺素(特别是前列腺素2-α(PGF2+)与皮质类固醇30、31、32、34一起参与排卵,并在排卵阶段31。
在体外研究中,PGF2+是排卵31的有力诱导剂,而在体内,它可以诱导拉纳肌肉4、30、32的保留卵子的排卵。纤维提取物也是排卵的有效诱导剂15,16,34;然而,在考虑这种方法时,对生物安全和疾病传播可能性的担忧往往对圈养繁殖地的阻碍。
本文的最后一节详细介绍了外科手术,并提供了其他方法来扩大卵巢研究或帮助解决生殖病理。在两栖动物中最常进行卵子切除术,以获得卵母细胞用于胚胎学研究。但是,当其他选项失败时,它还可以为保留的鸡蛋提供补救措施。虽然这个程序是侵入性的,需要完全麻醉和切口来暴露卵子质量,但它不需要安乐死。此外,在部分卵巢切除术后,动物可以完全恢复,并在手术后继续繁殖活跃。
下面描述的协议概述了在阿努兰和考斯进行卵巢控制和监测的侵入性和非侵入性方法。选择在阿努兰人中说明技术的特定物种包括粘胶和X.拉维瓦。Necturus maculosus、 N. Beyeri、 N. 阿拉巴门斯和A. 墨西哥构成用于类似描述考达特技术的物种.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems</td>
			<td>GE medical systems</td>
			<td>GE logiq Book XP</td>
			<td>Ultrasound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex</td>
			<td>GE medical systems</td>
			<td>8C-RS (10 MHz)</td>
			<td>Ultrasound probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle)</td>
			<td>Mettler Electronics Corp CA</td>
			<td>Sonigel</td>
			<td>Ultrasound gel (water soluble, salt-free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hormone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gonadotropin releasing hormone</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4012028</td>
			<td>synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate 
			abbreviation: GnRH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lutenizing hormone releasing hormone</td>
			<td>BACHEM, Sigma-Aldrich</td>
			<td>4033013;&#160;&#160;&#160;&#160; L1898</td>
			<td>synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; 
			[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate 
			abbreviation: LHRH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>BACHEM, Sigma-Aldrich</td>
			<td>4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10</td>
			<td>synonym: Chorionic gonadotropin-&#946; (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) 
			abbreviation: hCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin 2&#945;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P40424;</td>
			<td>synonym: (5Z,9&#945;,11&#945;,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2&#945;&#8722;Tris; 
			abbreviation: PGF2&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4021, F8174</td>
			<td>synonym: porcine, sheep 
			abbreviation: FSH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46665;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P7556</td>
			<td>synonym: Vetranal; P4 water soluble 
			abbreviation: P4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>na</td>
			<td></td>
			<td>synonym: Check papers for amphibian species derivation 
			abbreviation: PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td>
			<td>Prospec;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich</td>
			<td>HOR-272;&#160;&#160;&#160; 493-10; 9002-70-4</td>
			<td>synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin 
			abbreviation: PMSG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaclopromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0763</td>
			<td>synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide 
			abbreviation: MET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucrin</td>
			<td>BACHEM; Sigma-Aldrich</td>
			<td>4033014;&#160;&#160; L0399</td>
			<td>synonym: Leuprorelin acetate 
			abbreviation: Lucrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lutalyse</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td>synonym: PGF2&#945; - Dinoprost tromethamine 
			abbreviation: Lut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pimozide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1793</td>
			<td>synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one 
			abbreviation: PZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphiplex</td>
			<td>see above</td>
			<td></td>
			<td>synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide 
			abbreviation: GnRH + MET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovopel</td>
			<td>Ovopel</td>
			<td>na</td>
			<td>synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) 
			abbreviation: Ovo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Pentair aquatic eco-systems</td>
			<td>Ova10</td>
			<td>synonym: Salmon gonadotropin + domperidone 
			abbreviation: Ova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domperidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D122</td>
			<td>synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine 
			abbreviation: DOM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reproductive techniques for ovarian monitoring and control in amphibians

两栖动物的卵巢控制和监测需要多方面的方法。有几个应用,可以成功地诱导生殖行为和获取配子和胚胎的生理或分子研究。两栖动物对脊椎动物研究的贡献占四分之一,在这方面,他们感兴趣的是它们对科学界生殖过程和胚胎发育知识的贡献。然而,这些知识大多来自少数物种。近来,全球两栖动物的灭绝需要环保人士加大干预力度。因面临灭绝风险而继续出现的圈养恢复和保证殖民地,使得现有的研究和临床应用对于人类护理下两栖动物的生存和繁殖具有宝贵价值。任何圈养种群的成功都取决于其健康和繁殖能力,以及培育能够延续其物种最多样化的遗传表现的可行后代的能力。因此,对于研究人员和兽医来说,监测和控制卵巢发育和健康的能力势在必行。本文的重点是强调可用于监测并酌情控制两栖动物卵巢功能的不同辅助生殖技术。理想的情况是,任何生殖健康和健康问题都应通过适当的圈养减少,但与任何动物一样,健康和生殖病理问题是不可避免的。非侵入性技术包括行为评估、目视检查和触觉以及用于计算身体状况指数和超声波的形态测量。侵入性技术包括激素注射、血液采样和手术。卵巢控制可以通过多种方式执行,具体取决于所需的应用和感兴趣的种类。

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Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

两栖生物的研究为驱动许多类群生物体的生殖、生理、胚胎和发育过程提供了宝贵的信息。在这里,我们提出了一个全面的指导,不同的方法,可用于研究卵巢控制和监测在两栖动物。

两栖动物卵巢监测和控制的生殖技术

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

这种卵巢切除术采用可回收的外科手术获得两栖卵母细胞，用于我们的医学研究或克服保留卵子的病理状况的另一种应用。它不需要安乐死获得两栖卵母细胞的研究目的。事实上，在部分切除后，两栖动物的体子在恢复后可以生殖活跃。在确认对骨盆肢体挤压缺乏反应后，将麻醉性雌性肛门放在背背卧位，并使用湿润的无菌纱布用波维酮碘溶液擦拭手术场 10 至 15 秒。在手术区放置一个透明、无菌的塑料窗帘，通过保持周围皮肤湿润来减少蒸发，然后使用编号为 15 或 11 的手术刀刀片在肩部和氯卡之间的中科洛姆中切开 3 毫米围梅迪安皮肤切口。必要时，使用棉尖施用器对切口周围的任何小容器施加局部压力，并提升腹膜以进行连续膜切口。使用眼睑缩回器收回卵切板，并切除部分卵质量，而不连接任何血管。要进行完整的切除手术，将周围的血管烧灼，并使用单丝缝合线关闭与中断的常体缝合图案的胸围切口。不同的两栖动物物种，如这些Neturus和玻璃青蛙，表现出不同程度的皮肤透明度，影响其繁殖状态的转面可视化能力。在某些物种中，可以检测到雌性动物与最近被入侵的动物之间的形态差异。在这个例子中，最近被吸收的女性Rana Muscosa可以因皮肤的松弛和皮肤的瘦弱而与一个格拉尼的女性区分开来。在拉纳莫斯科萨的卵巢行为阶段包括求赛，其中男性积极追求女性和丰满的，在此期间，Rana muscosa雄性坐骑和牢牢地扣在女性的背上。在充分期间，雄性以柔和的抽水方式挤压雌性。雌性 Rana Muscosa 四处走动，表现出间歇性的手架行为，最终靠在鸡蛋可以粘在表面上，而雄性则大力抽她的腹部。卵巢发生后立即，女性卵巢返回到第一阶段。在此期间，在进行超声波检查时，毛囊很难可视化。第二阶段由分散在卵巢中的回声点的出现表示。第三阶段是由更大、更圆的回声点与暗中心的存在决定的，表明蛋黄的成熟卵泡。在这个代表性的四年评估圈养女性Necturus，卵子发育是高，但卵巢没有保证。一些女性与保留的卵子同时与液体增益在体腔，显示过度的周长和肿胀，以及一些爆发血管的迹象，如这些受影响的拉纳和内图鲁斯显示。虽然手术方法可用于管理卵巢病理学，但该技术也可能参与游戏和脐带研究。手术后，医生可以回到本手稿中概述的第一个方案，以监测两栖动物主体正在进行的整体健康状况。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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技术成像钙 2 +信号在人类精子

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致命的甲壳类动物长期毒性试验卤虫franciscana</em

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It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

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近植入阶段人类胚胎中特罗福细胞的单细胞集合

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...