Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue at JoVE.com

خطوات التعامل مع الحيوانات من البروتوكول أقرتها جامعة بوسطن "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-اليوم الأول: تشريح وإعداد الخفافيش للونين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة)
<ol><li>Euthanize الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO2) دائرة، وإجراء التشريح فورا بعد ذلك. ...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+prepares+brown+adipose+tissue+for+acute+thermogenic+challenge.">Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge.</a> Nature. , (2017).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+binds+MED1+and+controls+chromatin+architecture+to+determine+a+brown+fat+transcriptional+program.">PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program.</a> Genes &amp; Development. , (2015).</li><li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex.">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes &amp; Development. , (2017).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Stromal+Vascular+Cells+to+Beige/Brite+Cells.">Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>. Genome Browser Gateway Available from: <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10</a> (2018)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. , 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+alignment/map+(SAM)+format+and+SAMtools.">The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+artifact+removal+on+ChIP+quality+metrics+in+ChIP-seq+and+ChIP-exo+data.">Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data.</a> Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+A+next+Generation+Web+Server+for+Deep-Sequencing+Data+Analysis.">deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, R137 (2008).</li><li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reproducibility+of+high-throughput+experiments.">Measuring reproducibility of high-throughput experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).</li><li>. Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nboley/idr">https://github.com/nboley/idr</a> (2018)</li><li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+Gene+Ontology+Knowledgebase+and+Resources.">Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources.</a> Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).</li><li>Boeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Genomic+Sequence+Motifs+for+Deciphering+Transcription+Factor+Binding+and+Transcriptional+Regulation+in+Eukaryotic+Cells.">Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells.</a> Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).</li></ol>

ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا هي أداة قيمة لأداء رقاقة من الأنسجة مورين، وعلى وجه التحديد الأمثل للنسيج الدهني البنى. واحدة من أكبر التحديات في أداء رقاقة من الأنسجة يتعافى بعدد كاف من الخلايا أثناء إعداد عينة. القص بات استخدام خلاط الخالطون أنسجة مقترنة بحبات الفولاذ المقاوم للصدأ بدلا?...

الأنسجة الدهنية براون (BAT) بينما الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) المتخصصة لتخزين الطاقة، تبدد الطاقة في شكل حرارة نظراً لقدرته على تحويل الكربوهيدرات والدهون إلى طاقة حرارية عن طريق يفصل المتقدرية1. بسبب هذه الوظيفة المتخصصة، ومستودع التقنيات المطلوبة للمحافظة على درجة حرارة الجسم في الظروف الفسيولوجية واستجابة للتعرض للبرد. في حين قد درست التغيرات التعبير الجيني أثناء تمايز الخفافيش وعند الإجهاد حرارة على نطاق واسع في الحية وفي المختبر، الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه التغيرات كانت معظمها تشريح في خطوط الخلايا مخلدة والابتدائي adipocytes المسبق، باستثناء عدة الدراسات المجراة في2،،،من34،5.
تنظيم برامج تعبير الجينات المحددة من خلال تنظيم النسخي يتحقق عن طريق التغييرات المنسقة في الكروماتين الهيكل عن طريق النسخ مختلف العوامل واشتركت عوامل الإجراءات. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج قيمة بيولوجيا الجزيئية للتحقيق في توظيف هذه العوامل للحمض النووي والتنميط يرتبط بها من التغيرات في المناظر الطبيعية الكروماتين. وتشمل العوامل الرئيسية لنجاح تجارب رقاقة أمثل الظروف crosslinking واتساق القص الكروماتين في أنحاء مختلفة من العينات، توافر انطلاق المادية، والكافية، وأبرزها نوعية الأجسام المضادة. عند أداء رقاقة من الأنسجة كاملة، من المهم أيضا النظر في عدم تجانس العينات وتحسين البروتوكول تحسين كفاءة العزل النوى، ومع هذا الأخير يجري خطوة حساسة بشكل خاص عند العمل مع الأنسجة الدهنية نظراً محتوى الدهون مرتفعة. في الواقع، التقنيات الجزيئية العزلة من مستودعات كله الدهنية تتعقد بسبب وجود مستويات عالية من الدهون الثلاثية، وبروتوكولات يجب أن يكون الأمثل لزيادة مقدار عزل الكروماتين. وأخيراً، عندما يتم إجراء تسلسل الفائق بعد عزلة رقاقة الحمض النووي، عمق التسلسل أمر حاسم لتحديد عدد القمم التي يتم الكشف عنها بثقة.
هنا، نود أن نشير إلى أن معايير العمل والمبادئ التوجيهية العامة للتجارب رقاقة seq الذي أوصت به ترميز ومودينكودي اتحادات6 لأفضل الممارسات، ونحن نركز على وصف خطوة بخطوة لبروتوكول الأمثل ل seq رقاقة من الخفافيش. يسمح البروتوكول وصف لكفاءة عزل الكروماتين من الأنسجة الدهنية لإجراء تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة للحمض النووي--ربط العوامل مع قمم محددة تحديداً جيدا، فضلا عن علامات هستون بإشارات أكثر انتشارا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

وينظم عمليات الخلوية الأكثر النسخي تحوير الجينات محددة البرامج. ويتحقق هذا التعديل من خلال الإجراءات المشتركة لمجموعة واسعة من عوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة في التوسط للتنشيط النسخي أو القمع عن طريق التغييرات في هيكل الكروماتين. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج مفيدة في مجال بيولوجيا الجزيئية لرسم الخرائط التعديلات هيستون والتنميط النسخ العوامل/العوامل المساعدة ملزمة للحمض النووي، وبالتالي توفير لقطة من التغيرات النووية الدينامية التي تحدث خلال مختلف العمليات البيولوجية.
دراسة تنظيم النسخي في الأنسجة الدهنية والعينات المستمدة من الثقافات الخلايا في المختبر لتخليد أو خطوط الخلايا الأولية هي غالباً ما يفضل في رقاقة فحوصات بسبب وفرة ابتداء من المواد وتقليل التنوع البيولوجي. ومع ذلك، تمثل هذه النماذج لقطة محدودة للدولة الكروماتين الفعلية في الكائنات الحية. ومن ثم، هناك حاجة ماسة للبروتوكولات الأمثل لأداء رقاقة على عينات الأنسجة الدهنية المستمدة من النماذج الحيوانية.
هنا يصف لنا بروتوكول ل seq رقاقة كفاءة التعديلات هيستون والبروتينات غير هستون في الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. البروتوكول هو الأمثل للتحقيق في التعريب على نطاق الجينوم من البروتينات للفائدة وعلامات جينية في الخفافيش، التي مستقلة شكلياً وفسيولوجيا أنسجة بين مستودعات الدهون.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> رقم 1: رقاقة التحقق من قبكر- تحليل الرقائق-قبكر GPS2 ممثل استهداف جينات NDUFV1 (يسار) و TOMM20 (يمين) في الخفافيش الفئران WT واكو GPS2، عرض التغيرات النسبية في مستوى مثلايشن H3K9 و GPS2 و Pol2 الملزمة. شريط الرسوم البيانية تمثل ...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

هنا يمكننا وصف بروتوكول لكفاءة الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها الفائق تسلسل الحمض النووي (الرقائق-seq) من الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. هذا البروتوكول مناسبة لكل رسم الخرائط هيستون التعديلات والتعريب على نطاق الجينوم من البروتينات غير هيستون لمصلحة فيفو فيالتحقيق.

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

الاستنشاق انها تستخدم لأداء فعالية ChIP التسلسل من كل من استر وغير استر البروتينات في الأنسجة الدهنية البني معزولة عن الماوس. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البروتوكول قد تم تحسينه من أجل الاعتيمة الفعالة للمجمع المرتبط بالكروماتين من الأنسجة الدهنية. قبل شق، رش الماوس القتل الرحيم مع الإيثانول 70٪.وضع الماوس مع ظهره تواجه ما يصل، ثم جعل شق على طول الرقبة. بعد ذلك، تقع BAT مباشرة تحت الجلد بين الكتفين وإزالة بعناية طبقة رقيقة من الدهون البيضاء. عبر ربط كل لوحة BAT في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 1٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد 15 دقيقة، إرواء عبر ربط بإضافة 2.5 جليسين المولر إلى BAT، مما أدى إلى تركيز النهائي من 125 ملليمولار. ضعه على شاكر لمدة خمس دقائق، وتناوب على 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي وقت لاحق، نقل لوحة BAT إلى 500 ميكرولترات من العازلة التحلل تحلل lytonic وإضافة اثنين من الخرز الفولاذ المقاوم للصدأ لكل لوحة BAT.ثم، استخدام التجانس الأنسجة القائمة على حبة لتمزيق الأنسجة. تبدأ مع خمس دقائق في السلطة القصوى. إذا لزم الأمر، تمديد الوقت حتى يتم تجانس الأنسجة ويتم فصل الخلايا الفردية.نقل العينة إلى أنبوب جديد، والطرد المركزي في أربع درجات مئوية في 16،000 G لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق، نقل ناظر في أنبوب جديد والحفاظ على بيليه الخلية على الجليد. جهاز طرد مركزي في 4 درجات مئوية في 16، 000 G لمدة 10 دقائق لمنع فقدان الخلايا العائمة.ثم، والتخلص من عظمى النهائي وإعادة تعليق كل من الكريات الخلية معا في 300 ميكرولترات من المخزن المؤقت SDS تحلل مع مثبطات protease مرة واحدة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. المقبل، sonicate lysates لتوليد شظايا الحمض النووي 200 إلى 500 أزواج قاعدة طويلة.بعد صوتنة، وإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 16، 000 G في أربع درجات مئوية. لأداء المناعي، والحفاظ على 1٪ من حل كروماتين جانبا كمدخلات ChIP والحفاظ على المدخلات بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، إضافة الجسم المضاد ChIP إلى ملليلتر واحد من محلول الكروماتين وأداء المناعي الموازي مع IgG قبل المناعة المقابلة أو IgG العادية من نفس النوع.بدلا من ذلك، حفظ ملليلتر واحد من محلول الكروماتين لمراقبة أي الأجسام المضادة. احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التناوب. لجمع المجمعات المناعية، إضافة 50 ميكرولترات من البروتين أ agarose 50٪ الطين إلى المجمعات المناعية واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية مع دوران في 150 دورة في الدقيقة.بعد ساعة، بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 1000 مرات G في أربع درجات مئوية. تنفيذ عمليات غسل متتابعة من الخرز على 0.45 ميكرومتر PVDF أعمدة تصفية الطرد المركزي مع المخازن المؤقتة من زيادة الصرامة عن طريق نقل أولا الخرز في الأعمدة مع 500 ميكرولترات من انخفاض الملح غسل العازلة. ثم، بيليه الخرز في الأعمدة لمدة ثلاث دقائق في G.Discard 2500 تدفق من خلال.كرر الغسيل مع ارتفاع الملح غسل العازلة وفقا لإجراءات غسل الملح منخفضة. ثم، كرر الإجراءات مع كلوريد الليثيوم وأخيرا مع مرة واحدة TE. بعد الانتهاء من يغسل، elute المجمعات المناعية عن طريق إضافة 300 ميكرولترات من عازلة elution إلى الخرز بيليه في الأعمدة. احتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر في 400 دورة في الدقيقة.في وقت لاحق، وجمع elute عن طريق الغزل أسفل الأعمدة لمدة ثلاث دقائق في 2500 G في أنبوب جديد. عكس الروابط المتقاطعة عن طريق احتضان elute والمدخلات التي تم جمعها في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لاستعادة الحمض النووي، إضافة 300 ميكرولترات من الفينول الكلوروفورم IAA إلى elute والمدخلات بمعدل واحد إلى واحد ودوامة لمدة 10 ثوان.بعد ذلك، تدور أسفل في 21،000 G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. الحفاظ على بيليه وتجاهل افر. غسل بيليه مع ملليلتر واحد من الإيثانول البارد 70٪.ثم تدور أسفل في 21،000 G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا والهواء الجافة بيليه. إعادة تعليق بيليه في 70 ميكرولترات من المياه الخالية من DNAse لمزيد من الإجراءات.هنا مثال على ChIP Q PCR باستخدام BAT معزولة عن النمط البري أو فئران خروج المغلوب GPS2-A. وبما أن النظام العالمي لتحديد المواقع العالمي (GPS2) قد وجد أنه لازم للتعبير عن جينات الميتوكوندريا المشفرة نووياً في مختلف خطوط الخلايا، فقد تم اختبار توظيف نظام تحديد المواقع العالمي لتحديد المواقع (GPS2) على جينين محددين من جينات الميتوكوندريا المشفرة النووية. NDUFV1 و TOMM20 في BAT من الفئران كأمثلة على الأنسجة الغنية للغاية في الميتوكوندريا.تم مقارنة إشغال المروج GPS2 في فئران خروج المغلوب GPS2-A والاصحاب رسالة نوع البرية. ولوحظ انخفاض متوقع في نظام تحديد المواقع العالمي (GPS2) الملزم على جينات مستهدفة انتقائية في BAT من فئران خروج المغلوب GPS2-A. باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، تم تسجيل زيادة الربط من البوليميراز RNA اثنين وعلامة histone القمعية ، H3K9ME3 ، في BAT من فئران خروج المغلوب GPS2 -A مقارنة بالزملاء رسالة نوع البرية.وتؤكد هذه النتائج توظيف نظام تحديد المواقع العالمي (GPS2) على جينات ميتوكوندريا المشفرة النووية المختارة، وتبين أن النظام العالمي لتحديد المواقع (GPS2) مطلوب لمنع تراكم H3K9ME3، وبالتالي مطلوب لتعطيل النشاط النسخي للأعمدة اثنين على المروجين المستهدفين. البروتوكول الموصوف هنا، حتى لو كان الأمثل على وجه التحديد للأنسجة الدهنية البنية، يمثل أداة قيمة لأداء ChIP من مورين الأخرى والأنسجة البشرية. لا ننسى أن العمل مع الفينوكلوروفورم يمكن أن تكون خطرة للغاية.لذلك، من المهم للغاية أن تعمل دائما تحت غطاء محرك الدخان أثناء استخدام هذا الكاشف.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

اكتشاف الأهداف التنظيمية CsgD في السالمونيلا biofilm باستخدام كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن والتسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

رسم خرائط عالية الدقة للتفاعلات البروتينية-الحمض النووي في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس باستخدام Chromatin immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

عزل النوى الأنسجة الدهنية لتطبيقات الجينوم وحيد الخلية

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

تحليل على نطاق الجينوم لتوزيع تعديلات الهستون باستخدام طريقة تسلسل المناعة الكروماتين في ماغنابورتي أوريزاي

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...