Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
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プロトコルの動物の処理手順は、ボストン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されています。
1. 1 日目: 郭清とクロマチン免疫沈降 (チップ) のバットの準備
<ol><li>二酸化炭素 (CO2) チャンバーを用いたマウスを安楽死させるし、すぐに解剖を行うその後。切開の前に 70% エタノール スプレー マウス毛皮。首に沿って皮膚をオープンしカッ...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. 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ここで説明されているプロトコルは、マウス組織、褐色脂肪組織用に最適化されたからチップを実行するための貴重なツールを表します。組織からチップを実行する大きな課題の 1 つはサンプル準備の間十分な細胞数を回復します。標準ガラス杵ではなくステンレス ビーズと相まって大幅組織ホモジナイザー ミキサーを使用してバットをせん断切れ目のない組織のため失われた細胞の数が?...

一方、白色脂肪組織 (WAT)、エネルギー貯蔵に特化して、褐色脂肪組織 (BAT) は熱エネルギーを介してミトコンドリア脱共役1炭水化物や脂質に変換されることにより熱の形でエネルギーを散らします。この専門にされた機能に応じて、バット デポは体温寒冷暴露、生理的条件でのメンテナンスが必要です。不死化細胞株で切り裂かれたと主なこれらの変更の基礎となる分子機構はほとんどされている遺伝子発現変動バット分化と熱応力は、生体内および生体外で広く研究されている、しながら前脂肪細胞は、いくつかの生体内研究2,3,4,5を除いて。
転写調節を介して特定の遺伝子発現プログラムの規制は、クロマチン構造を介して様々 な転写因子し、共同行動を要因に協調的な変更によって実現されます。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、DNA にこれらの要因の募集を調査するため、関連するクロマチン景観変化のプロファイリング貴重な分子生物学的アプローチです。チップの実験の成功の重要な要因には、架橋条件とクロマチン異なるサンプル全体にせん断の一貫性、適切な開始材料と、最も特に、抗体の品質の可用性の最適化が含まれます。チップを実行すると全体の組織から、また、サンプルの不均一性を考慮し、核分離の効率を改善するためにプロトコルを最適化することが重要だ、後者特に機密性の高いステップのために脂肪組織を操作するとき高脂質内容。実際には、全体脂肪デポから分子の分離技術は、トリグリセリドの高いレベルの存在によって複雑なし、クロマチン分離の量増やすにはプロトコルに最適化しなければなりません。最後に、チップ DNA の隔離後高スループット シーケンスを実行すると、シーケンス処理深さは自信を持って検出されたピークの数を決定する重要です。
ここでは、作業標準とベスト プラクティスについては、エンコードと modENCODE するためのコンソーシアム6推奨チップ seq 実験のための一般的なガイドラインを参照してください我々 と我々 はバットからチップ seq に最適化されるプロトコルの手順説明に焦点を当てます。記述されていたプロトコルは、脂肪組織からクロマチンの効率的な分離、拡散信号とヒストンと同様、明確に定義されたピークを持つ DNA 結合因子のゲノム シーケンスを実行するには

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

ほとんどの携帯電話のプロセスは、プログラム特定の遺伝子の転写調節によって規制されています。このような変調は、幅広い転写因子 (TFs) と転写活性化とクロマチン構造の変化を介して抑制を仲介する因子の結合されたアクションによって実現されます。クロマチン免疫沈降 (チップ) はヒストン修飾のマッピングと DNA 結合転写因子/補因子をプロファイリング、従って異なった時に発生する動的核変化のスナップショットを提供するための便利な分子生物学的アプローチ生物学的プロセス。
脂肪組織における転写制御を勉強するサンプルの培養細胞培養由来の不死化または一次電池線出発材料が豊富なのために、しばしばチップ試金で好まれている、生物学的変動を低減します。しかし、これらのモデルは、生物における実際のクロマチンの状態の限られたスナップショットを表します。従って、動物モデルから派生した脂肪組織サンプルでチップを実行する最適化されたプロトコルの重要な必要性があります。
ここでのヒストンの修正および褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離された非ヒストン蛋白質の効率的なチップ seq のプロトコルについて述べる。プロトコルは、ゲノムの関心と脂肪質のターミナルの間で形態学的および生理学的に明瞭な組織であるバットのエピジェネティックな遺伝子マーカー蛋白質のローカリゼーションを調査するために最適化されています。

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> 図 1: qPCR による検証をチップします。代表 GPS2 のチップ qPCR 解析ターゲット遺伝子NDUFV1 (左) TOMM20 (右) H3K9 メチル化と GPS2 と Pol2 のバインディングのレベルの相対的な変化を示す WT と GPS2 赤穂マウスのバット。バー グラフと 3 複製の標本平均を表す * p < 0.05 と * * p < 0.01 スチュー...

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Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ) のためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、ヒストン修飾のマッピングとゲノムワイド興味の生体内の非ヒストン蛋白質のローカリゼーションを調査の両方に適しています。

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

メーターで計られたマウスから分離された褐色脂質組織のエステルおよび非エステルタンパク質の両方の効率的なChIPシーケンシングを行うために使用されます。この技術の主な利点は、プロトコルが脂質組織からのクロマチン関連複合体の効率的な免疫沈降のために最適化されたことである。切開前に、安楽死させたマウスに70%エタノールをスプレーします。背中を上に向けてマウスを置き、首に沿って切開します。次に、BATを肩の間の皮膚の真下に配置し、慎重に白い脂肪の薄い層を除去する。1%ホルムアルデヒドを15分間室温で15分間含有するPBSの10ミリリットルの各BATパッドをクロスリンクする。15分後、BATに2.5モルグリシンを加えて交差リンクをクエンチし、最終的に125ミリモル濃度を得た。シェーカーの上に5分間置き、室温で150 RPMで回転させます。その後、BATパッドを500マイクロリットルの低張性リシスバッファーに移し、BATパッドごとに2つのステンレスビーズを追加します。次いで、ビーズベースの組織ホモジナイザーを使用して、組織を細断する。最大電力で5分から始めます。必要に応じて、組織が均質化され、単一の細胞が分離されるまで時間を延長します。サンプルを新しいチューブに移し、16,000 Gで摂氏4度で遠心分離機を10分間転送します。10分後、上清を新しいチューブに移し、細胞ペレットを氷の上に置きます。浮動細胞の損失を防ぐために16,000 Gで摂氏4度で上澄み物を遠心分離します。次いで、最終的な上清を捨て、両方の細胞ペレットを1回プロテアーゼ阻害剤で300マイクロリットルのSDSライシスバッファーに一緒に再懸濁します。氷の上で10分間インキュベートします。次に、ライセートを超音波処理し、200〜500塩基対のDNA断片を長く生成する。超音波処理の後、摂氏4度で16,000 Gで10分間遠心分離によって破片を取り除きます。免疫沈降を行うために、Chromatin溶液の1%をChIP入力として脇に置き、一晩で4°Cに入力を保ちます。次に、ChIP抗体を1ミリリットルのクロマチン溶液に添加し、同じ種の対応する免疫前IgGまたは正常IgGとの並列免疫沈降を行う。あるいは、抗体コントロールを使用しないクロマチン溶液を1ミリリットル保存します。回転と摂氏4度で一晩インキュベート。免疫複合体を収集するには、50マイクロリットルのプロテインAアガロースを免疫複合体に50マイクロリットル加え、150RPMでの回転で摂氏4度で1時間インキュベートする。1時間後、摂氏4度で1000倍Gで1分間遠心分離によりビーズをペレット化する。低塩洗浄バッファーの500マイクロリットルで列にビーズを転送することにより、増加するストリンジェンシーのバッファーを持つ0.45マイクロメートルPVDF遠心フィルターカラム上のビーズの順次洗浄を実行します。次いで、2500Gで3分間列にビーズをペレットにし、フロースルーを破棄する。低塩洗浄手順に従って高塩洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。次に、塩化リチウムで手順を繰り返し、最後に1回のTEで繰り返します。この剤を焼き終えた後、カラム内のペレットビーズに300マイクロリットルの溶出バッファーを加えて免疫複合体を溶出させる。400 RPMのシェーカーで室温で30分間インキュベートします。続いて、2500Gでカラムを3分間回転させて、新鮮なチューブにエルテを回収する。一晩摂氏65度で収集されたエルテと入力をインキュベートして、クロスリンクを逆にします。DNAを回収するには、300マイクロリットルのフェノールクロロホルムIAAをエルトに加え、1対1の比率で入力し、渦を10秒間入力します。次に、摂氏4度で21,000Gで20分間スピンダウンします。ペレットを保持し、上清を捨てます。ペレットを冷たい70%エタノールの1ミリリットルで洗います。その後、摂氏4度で21,000Gで5分間スピンダウンします。上清を捨て、ペレットを空気乾燥させます。さらに手順を行うため、ペレットを70マイクロリットルのDNAseフリー水で再懸濁します。野生型またはGPS2-Aノックアウトマウスから分離されたBATを用いたChIP Q PCRの例を以下に示します。異なる細胞株における核コードミトコンドリア遺伝子の発現にGPS2が必要であることが判明したので、GPS2の募集は、2つの特定の核コードミトコンドリア遺伝子で試験された。ミトコンドリアで高富化した組織の例としてマウス由来のBATにおけるNDUFV1およびTOMM20。GPS2プロモーターの占有率は、GPS2-Aノックアウトマウスと野生型レターメイトで比較した。GPS2-AノックアウトマウスからBATの選択的標的遺伝子に対するGPS2結合の予想減少が認められた。ここで説明したプロトコルを用いて、RNAポリメラーゼ2と抑制ヒストンマークH3K9ME3との結合の増加を、野生型レターメイトと比較してGPS2-AノックアウトマウスからBATに記録した。これらの結果は、選択された核コードミトコンドリア遺伝子に対するGPS2の募集を確認し、H3K9ME3の蓄積を防止するためにGPS2が必要であり、したがって標的プロモーター上のポール2転写活性の失速に必要であることを示した。ここで説明するプロトコルは、褐色脂肪組織に対して特異的に最適化された場合であっても、他のマウスおよびヒト組織からChIPを行うための評価されたツールを表す。フェノクロロホルムでの作業は非常に危険な場合があることを忘れないでください。そのため、この試薬を使用している間、常にヒュームフードの下で動作することが非常に重要です。

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を用いたサルモネラバイオフィルムにおけるCsgD調節標的の発見

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...