Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
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Las medidas de manejo de animales del protocolo han sido aprobadas por institucional Animal Care y Comité uso (IACUC) de la Universidad de Boston.
1. día 1: Disección y preparación de BAT para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
<ol><li>Eutanasia a ratones utilizando una cámara de dióxido de carbono (CO2) y realizar la disección inmediatamente después. Rocío ratón piel con etanol al 70% antes de la incisión. Coloque el ratón con la espalda hacia arriba, luego c...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+prepares+brown+adipose+tissue+for+acute+thermogenic+challenge.">Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge.</a> Nature. , (2017).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+binds+MED1+and+controls+chromatin+architecture+to+determine+a+brown+fat+transcriptional+program.">PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program.</a> Genes &amp; Development. , (2015).</li><li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex.">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes &amp; Development. , (2017).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Stromal+Vascular+Cells+to+Beige/Brite+Cells.">Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>. Genome Browser Gateway Available from: <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10</a> (2018)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. , 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+alignment/map+(SAM)+format+and+SAMtools.">The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+artifact+removal+on+ChIP+quality+metrics+in+ChIP-seq+and+ChIP-exo+data.">Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data.</a> Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+A+next+Generation+Web+Server+for+Deep-Sequencing+Data+Analysis.">deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, R137 (2008).</li><li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reproducibility+of+high-throughput+experiments.">Measuring reproducibility of high-throughput experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).</li><li>. Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nboley/idr">https://github.com/nboley/idr</a> (2018)</li><li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+Gene+Ontology+Knowledgebase+and+Resources.">Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources.</a> Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).</li><li>Boeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Genomic+Sequence+Motifs+for+Deciphering+Transcription+Factor+Binding+and+Transcriptional+Regulation+in+Eukaryotic+Cells.">Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells.</a> Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).</li></ol>

El protocolo descrito aquí representa una herramienta valiosa para realizar ChIP de tejidos murinos, específicamente optimizados para el tejido adiposo marrón. Uno de los mayores desafíos en la realización de la viruta del tejido recupera una cantidad suficiente de células durante la preparación de la muestra. Corte el bate con una batidora de homogenizador de tejido juntada con granos de acero inoxidable en lugar de un mortero de vidrio canónico significativamente reduce el número de células perdidas debido al...

Mientras que el tejido adiposo blanco (WAT) es especializado para el almacenamiento de energía, el tejido adiposo marrón (BAT) se disipa energía en forma de calor debido a su capacidad de convertir energía térmica via mitocondrial desacoplar1hidratos de carbono y lípidos. Debido a esta función especializada, el depósito BAT es necesario para el mantenimiento de la temperatura corporal en condiciones fisiológicas y en respuesta a la exposición fría. Mientras que los cambios de expresión génica durante la diferenciación de BAT y sobre estrés termogénico han sido extensivamente estudiadas in vivo e in vitro, los mecanismos moleculares subyacentes a estos cambios han sido en su mayoría disecados en líneas celulares inmortalizadas y primaria pre-adipocitos, con la excepción de varios estudios in vivo2,3,4,5.
Reglamento de programas de expresión de genes específicos a través de la regulación transcripcional se logra por cambios coordinados en la cromatina estructura mediante transcripción de diversos factores y factores conjuntamente acciones. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un enfoque valioso biología molecular para investigar la contratación de estos factores al ADN y para perfilar los cambios asociados en el paisaje de la cromatina. Factores clave para el éxito de los experimentos de ChIP incluyen optimizaciones de reticulación condiciones y consistencia corte de cromatina a lo largo de las diferentes muestras, la disponibilidad del material de partida adecuado y, en particular, la calidad de los anticuerpos. Cuando se realiza el ChIP de tejidos todo, también es importante considerar la heterogeneidad de las muestras y optimizar el protocolo para mejorar la eficiencia del aislamiento de los núcleos, el último siendo un paso particularmente sensible cuando se trabaja con el tejido adiposo debido a el contenido de lípidos elevados. De hecho, técnicas de aislamiento molecular de depósitos conjunto adiposos son complicadas por la presencia de niveles altos de triglicéridos, y protocolos deben ser optimizados para aumentar la cantidad de aislamiento de la cromatina. Finalmente, cuando se realiza la secuenciación de alto rendimiento después de ChIP de ADN, la profundidad de la secuencia es fundamental para determinar el número de picos que se detectan con confianza.
Aquí, nos referimos a las normas de trabajo y lineamientos generales para los experimentos de ChIP-seq recomendados por el consorcio ENCODE y modENCODE6 para las mejores prácticas, y nos centramos en una descripción paso a paso de un protocolo optimizado para el ChIP-seq de palo. El protocolo descrito permite eficiente aislamiento de cromatina del tejido adiposo para realizar la secuenciación del genoma para factores de unión al ADN con picos bien definidos así como marcas de histonas con las señales más difusas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

Procesos más celulares son regulados por modulación transcripcional de programas gen específico. Dicha modulación se logra a través de la acción combinada de una amplia gama de factores de transcripción (TFs) y cofactores mediando la activación transcripcional o represión a través de cambios en la estructura de la cromatina. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método de biología molecular útiles para mapeo de modificaciones de las histonas y perfiles de transcripción factores/cofactores vinculante al ADN, proporcionando una instantánea de los cambios nucleares dinámicos que ocurren en diferentes procesos biológicos.
Para estudiar la regulación transcripcional en el tejido adiposo, muestras procedentes de cultivos en vitro de células de inmortalizaron o líneas de células primarias son favorecidas a menudo en los ensayos de ChIP debido a la abundancia de material de partida y reducción variabilidad biológica. Sin embargo, estos modelos representan una instantánea limitada del estado real de la cromatina en organismos vivos. Así, hay una necesidad crítica de protocolos optimizados realizar ChIP en muestras de tejido adiposo procedentes de modelos animales.
Aquí se describe un protocolo para eficiente ChIP-seq de modificaciones de las histonas y proteínas no histonas en el tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. El protocolo está optimizado para la investigación de genoma localización de proteínas de interés y marcadores epigenéticos en el murciélago, que es un tejido morfológicamente y fisiológicamente distinto entre los depósitos de grasa.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> Figura 1: validación de la viruta por qPCR. Análisis de qPCR chIP de representante GPS2 blanco genes NDUFV1 (izquierda) y TOMM20 (derecha) en el palo de los ratones WT y GPS2-AKO, mostrando los cambios relativos en el nivel de metilación de H3K9 y GPS2 y Pol2 vinculante. Los gráficos de barras representan la media de la muestra de 3 repeticiones con * p < 0.05 y ** p ...

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Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

El medido que se utiliza para realizar la secuenciación eficiente de ChIP de proteínas ésteres y no éster en el tejido lípido marrón aislado de ratón. La principal ventaja de la técnica es que el protocolo se ha optimizado para la inmunoprecipitación eficiente del complejo asociado a la cromatina desde el tejido lipídico. Antes de la incisión, rocíe el ratón eutanizado con 70%etanol.Coloque el ratón con la espalda hacia arriba, luego haga una incisión a lo largo del cuello. A continuación, se encuentra BAT directamente debajo de la piel entre los hombros y eliminar cuidadosamente la fina capa de grasa blanca. Enlace cruzado de cada almohadilla BAT en 10 mililitros de PBS que contiene 1%formaldehído durante 15 minutos a 150 RPM a temperatura ambiente.Después de 15 minutos, aprieta la reticulación mediante la adición de 2,5 glicina molar al BAT, lo que resulta en una concentración final de 125 milimolar. Colóquelo en una coctelera durante cinco minutos, girando a 150 RPM a temperatura ambiente. Posteriormente, transfiera la almohadilla BAT a 500 microlitros de tampón de lysis hipotónica y agregue dos perlas de acero inoxidable para cada almohadilla BAT.Luego, usa un homogeneizador de tejido a base de cuentas para triturar el tejido. Comience con cinco minutos a máxima potencia. Si es necesario, extienda el tiempo hasta que el tejido se homogeneice y se separen las células individuales.Transfiera la muestra a un tubo nuevo y centrifugar a cuatro grados centígrados a 16.000 G durante 10 minutos. Después de 10 minutos, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y mantenga el pellet celular sobre hielo. Centrifugar el sobrenadante a cuatro grados centígrados a 16.000 G durante 10 minutos para evitar la pérdida de células flotantes.Luego, deseche el sobrenadante final y vuelva a suspender ambos pellets celulares juntos en 300 microlitros de tampón de lelisis SDS con un inhibidor de la proteasa una vez. Incubar sobre hielo durante 10 minutos. A continuación, sonicar los lysates para generar fragmentos de ADN de 200 a 500 pares base de largo.Después de la sonicación, retire los escombros por centrifugación durante 10 minutos a 16.000 G a cuatro grados centígrados. Para realizar la inmunoprecipitación, mantenga el 1% de la solución de cromatina a un lado como la entrada ChIP y mantenga las entradas durante la noche en cuatro grados centígrados. A continuación, añada el anticuerpo ChIP a un mililitro de solución de cromatina y realice inmunoprecipitación paralela con el Correspondiente IgG preinmune o IgG normal de la misma especie.Alternativamente, guarde un mililitro de solución de cromatina para un control sin anticuerpos. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación. Para recoger los complejos inmunológicos, añadir 50 microlitros de proteína A agarosa 50% lodo a los complejos inmunológicos e incubar durante una hora a cuatro grados Celsius con rotación a 150 RPM.Después de una hora, peleciar las perlas por centrifugación durante un minuto a 1000 veces G a cuatro grados centígrados. Realice lavados secuenciales de las perlas en columnas de filtro centrífugo PVDF de 0,45 micrómetros con tampones de creciente rigurosidad transfiriendo primero las perlas en las columnas con 500 microlitros de tampón de lavado con bajo contenido de sal. A continuación, pelete las perlas en las columnas durante tres minutos a 2500 G.Deseche el flujo a través.Repita el lavado con tampón de lavado con alto contenido de sal de acuerdo con los procedimientos de lavado con bajo contenido de sal. A continuación, repita los procedimientos con cloruro de litio y finalmente con una de las DOS. Una vez completados los lavados, eluía los complejos inmunes añadiendo 300 microlitros de tampón de elución a las perlas peletadas en las columnas. Incubarlos a temperatura ambiente durante 30 minutos en una coctelera a 400 RPM.Posteriormente, recoger el elute girando hacia abajo las columnas durante tres minutos a 2500 G en un tubo fresco. Invierta los enlaces cruzados incubando el eluido y los insumos recogidos a 65 grados centígrados durante la noche. Para recuperar el ADN, agregue 300 microlitros de fenol cloroformo IAA al eluido y entradas en una relación uno a uno y vórtice durante 10 segundos.A continuación, gire a 21.000 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Conservar el pellet y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet con un mililitro de etanol frío al 70%.Luego gira a 21.000 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet. Vuelva a suspender el pellet en 70 microlitros de agua libre de DNAse para procedimientos adicionales.Aquí está un ejemplo de ChIP Q PCR usando BAT aislado de ratón wildtype o GPS2-A knockout. Dado que se ha descubierto que el GPS2 es necesario para la expresión de genes mitocondriales codificados nuclearmente en diferentes líneas celulares, el reclutamiento de GPS2 se probó en dos genes mitocondriales codificados nuclearmente específicos. NDUFV1 y TOMM20 en BAT de ratones como los ejemplos de un tejido altamente enriquecido en las mitocondrias.La ocupación del promotor gps2 se comparó en ratones nocaut GPS2-A y compañeros de letras de tipo salvaje. Se observó una disminución esperada en la unión GPS2 a genes selectivos en el BAT de ratones noqueados GPS2-A. Usando el protocolo descrito aquí, una mayor unión de ARN polimerasa dos y la marca de histona represiva, H3K9ME3, se registró en el BAT GPS2-A knockout ratones en comparación con las compañeras de letras de tipo salvaje.Estos resultados confirman el reclutamiento de GPS2 en determinados genes mitocondriales codificados nuclearmente y muestran que el GPS2 es necesario para prevenir la acumulación de H3K9ME3 y, por lo tanto, se requiere para detener la actividad de la transcripción del polo dos en los promotores objetivo. El protocolo descrito aquí, incluso si está específicamente optimizado para el tejido adiposo marrón, representa una herramienta valorada para realizar ChIP de otro tejido murino y humano. No olvide que trabajar con fenocloroformo puede ser extremadamente peligroso.Por lo tanto, es extremadamente importante operar siempre bajo la campana de humos mientras se utiliza este reactivo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigación

Genética

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...