Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) من كندا، والطيار ومنحة دراسة الجدوى من بانتنغ وأفضل السكري المركز (بدك)، "الصندوق بدء سيككيدس" إلى ح-ك. س.، "برنامج مركز البحوث الطبية" (2015R1A5A2009124) عبر الوطنية البحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، وتخطيط المستقبل إلى ي-ر. ك.

كافة البروتوكولات الحيوانات التجريبية أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان بمركز" فينوجينوميكس (TCP) تتفق مع معايير "المجلس الكندي للعناية بالحيوان". تم الإبقاء على دورات الضوء/الظلام 12-ح الفئران وتوفير حرية الوصول إلى المياه والغذاء. تجربة شهر 7 الفئران الذكور C57BL/6J قديمة استخدمت في تلطيخ كل جبل.
...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy.">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li><li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage.">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+(APC)+Populations.">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging.">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein &amp; Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li><li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity.">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>. iDISCO+ protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016)</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ.">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li><li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters.">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U&#776;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pra&#776;paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: U&#776;ber Knochenfa&#776;rbung. , (1914).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution:+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals.">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li></ol>

على الرغم من أن تعود بفوائد التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيون لمراقبة الهيكل داخل الخلايا، يلطخ كل-جبل يقدم وجهة نظر مختلفة في الأنسجة الدهنية للبحوث، التي تمكن 3D التصور الخلوي هندسة الأنسجة المجهزة الحد الأدنى.
من أجل نجاح أداء الجامعة-جبل تلطيخ، الاقتراحات ال?...

الأنسجة الدهنية جهازا أساسيا لتخزين الطاقة وتتميز بتجديد حيوية والتوسع غير محدود تقريبا1. بالإضافة إلى التوازن الطاقة، الأنسجة الدهنية أيضا دوراً أساسيا في إفراز هرمون أديبوكينيس ما يزيد على 50 تعدل وظيفة التمثيل الغذائي في الجسم كله2. وقد الأنسجة الدهنية الهندسة المعمارية المتنوعة وتضم مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك adipocytes ناضجة والليفية، وخلايا بطانية، الخلايا المناعية و الخلايا السلف adipocyte3. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن السمنة وغيرها الخلل الأيضي يمكن أن يغير كثيرا من وظيفة الأنسجة الدهنية ولها المكروية، التي تشمل ولكن لا تقتصر على توسيع adipocytes، تسلل الخلايا التحريضية (مثلاً، الضامة)، و3من خلل الأوعية الدموية.
التقنيات المورفولوجية التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيونينج تثبت العديد من القيود في دراسة البيولوجيا الدهنية مثل خطوات المعالجة الكيميائية الطويلة، التي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة انكماش وهيكل التشويه3، 4. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات 2D غير كافية لمراقبة التفاعلات بين الخلايا التي تمارسها أنواع الخلايا المختلفة، حيث أن المقاطع التي تم الحصول عليها محدودة إلى مناطق أصغر من الأنسجة كامل3. أساليب التصوير الفلورسنت مقارنة بالتقليدية، يلطخ كل جبل لا يتطلب خطوات إضافية الغازية، مثل التضمين وتمزيقها والجفاف؛ وهكذا، حتى تتجنب مشكلة تناقص خصوصية جسم. على هذا النحو، وطريقة بسيطة وفعالة لتصوير الأنسجة الدهنية، مع الحفاظ على أفضل مورفولوجيا adipocyte و هيكل الأنسجة الدهنية عموما5. ولذلك، كل جبل تلطيخ كما أنشئت تقنية إيمونولابيلينج سريعة وغير مكلفة للمحافظة على الأنسجة الدهنية البنية ثلاثية الأبعاد1،6،،من78.
ومع ذلك، على الرغم من المحافظة على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية مع استخدام تلوين كل جبل، هذا الأسلوب لا يزال غير قادر على تصور الهياكل الداخلية تحت سطح الأنسجة الدهنية. وقد أنشأت مؤخرا عدة دراسات9،10 الأنسجة تبادل التقنيات جنبا إلى جنب مع الجامعة-جبل إيمونولابيلينج1،6 للسماح للتصور 3D شاملة داخل الأنسجة الدهنية. على وجه الخصوص، كانت تصور الشبكات العصبية والمفرج كثيفة في الأخيرة دراسات9،10،،من1112 مع تصوير حجم ثلاثي الأبعاد. في الواقع، دراسة اللدونة العصبية والأوعية الدموية للأنسجة الدهنية تحت ظروف فسيولوجية مختلفة ضروري لدراسة عن علم الأحياء. تمكين إيمونولابيلينج تصوير ثلاثي الأبعاد لإزالة الأنسجة أجهزة مسح مذيب (إيديسكو +) عملية تتألف من الميثانول المعالجة المسبقة، إيمونولابيلينج، وإزالة الأنسجة التكتم مع الكواشف الكيميائية العضوية الميثان (DCM ) وخماسي البروم ثنائي الفينيل (قسم تعزيز الحدود) ديبينزيل13،14. بجعل الأنسجة الدهنية شفافة تماما، تمثيل أكثر دقة للتشريح داخل الأنسجة مثل الأوعية الدموية والألياف العصبية ويمكن الحصول على9،10. إيديسكو + مزايا في هذا ومتوافق مع مختلف الأجسام المضادة والصحفيين الفلورسنت11،14، وقد أثبت نجاحا في العديد من الأجهزة وامبريوس حتى14. غير أن القيد الرئيسي وقت حضانة طويلة، التي تحتاج إلى 18 إلى 20 يوما لإكمال هذه التجربة كاملة.
تطبيق هام آخر لتلطيخ كل جبل هو تصور مصير الخلية في تركيبة مع نظام تتبع نسب. تتبع النسب هو وسم الجينات/علامة معينة في خلية التي يمكن أن تنتقل إلى كافة الخلايا الوليدة، وهو يحافظ على مر الوقت15. على هذا النحو، هو أداة قوية يمكن استخدامها لتحديد مصير أي خلية ذرية15. منذ التسعينات، أصبح النظام المؤتلف Cre-لوكسب نهج قوية لتتبع النسب في معيشة الكائنات الحية15. عندما يتم عبرت خط ماوس تعرب لجنة المساواة العرقية، إنزيم الحمض النووي recombinase، مع آخر سطر الماوس معربا عن مراسل المجاورة لتسلسل لوكسب-توقف-لوكسب، هو بروتين مراسل أعرب15.
لتلوين كل جبل، استخدام الصحفيين متعدد الألوان الفلورية مناسبة للتصوير من الأنسجة الدهنية لأنه يسمح لتدخل الحد الأدنى مع الأنشطة داخل الخلايا من adipocyte16. إلا أن الصحفيين التقليدية عادة وصمة عار السيتوبلازم، مما يجعل من الصعب تتبع نسب adipocytes بيضاء، التي حدت من هيولى المحتوى17. للتغلب على هذه المشكلة، استخدام الغشاء زمنياً الفلورسنت تدتوماتو/غشاء اجفب (mT/mG) مراسل ماركر أداة مثالية. يتم التعبير عن تدتوماتو المستهدفة للغشاء في الخلايا Cre سالب18. عند ختان لجنة المساواة العرقية، ويحدث التحول إلى التعبير عن اجفب المستهدفة للغشاء، مما يجعل هذا المراسل مناسبة لتتبع نسب adipocyte المتكفل17،18 (تكميلية الشكل رقم 1).
والغرض من هذه الورقة هو تقديم بروتوكول مفصل لتلطيخ كل جبل، وإظهار كيف أنه يمكن دمجها مع تقنيات أخرى لدراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء من الأنسجة الدهنية. أمثلة اثنين من الطلبات المبينة في هذا البروتوكول يتم استخدامه مع خطوط الماوس مراسل 1) متعدد الألوان لتحديد أصول مختلفة adipocytes و 2) الأنسجة المقاصة لمزيد تصور أربوريزيشن العصبية في الأنسجة الدهنية البيضاء (وات).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

الأنسجة الدهنية جهازا هاما ايضية مع اللدونة العالية والاستجابة للمحفزات البيئية والحالة الغذائية. على هذا النحو، تم وضع تقنيات مختلفة لدراسة مورفولوجية وبيولوجيا الأنسجة الدهنية. مع ذلك، تقتصر أساليب التصور التقليدي لدراسة الأنسجة في 2D المقاطع، الفشل في القبض على بنية ثلاثية الأبعاد للجهاز كله. نقدم هنا كل جبل تلطيخ، أسلوب إيمونوهيستوتشيميستري الذي يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية سليمة مع خطوات الحد الأدنى من المعالجة. ومن ثم، يتم الاحتفاظ بهياكل adipocytes والمكونات الخلوية الأخرى دون تشويه، تحقيق التصور 3D الأكثر تمثيلاً من الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الجامع-جبل تلطيخ مع النسب تتبع أساليب لتحديد الخلية مصير القرارات. ومع ذلك، هذه التقنية على بعض القيود لتوفير معلومات دقيقة فيما يتعلق بأجزاء أعمق من الأنسجة الدهنية. للتغلب على هذا التحديد، تلطيخ كل جبل يمكن أن تكون كذلك جنبا إلى جنب مع الأنسجة تبادل تقنيات إزالة التكتم الأنسجة والسماح للتصور الكامل لتشريح الأنسجة الدهنية كاملة باستخدام ورقة الضوء الفلورسنت الفحص المجهري. ولذلك، يمكن التقاط دقة أعلى وتمثيل أكثر دقة لهياكل الأنسجة الدهنية مع المزيج من هذه الأساليب.

بسبب هشاشة الأنسجة الدهنية، الأساليب التي تنطوي على عدة خطوات المعالجة وتمزيقها يمكن أن تؤدي إلى تشوهات في الأنسجة الدهنية مورفولوجيا3 (الشكل 1A). ومع ذلك، تلطيخ كل جبل يمكن الحفاظ على مورفولوجية adipocytes، ضمان التفسير الدقيق للنتائج (الشكل 1B).
<p...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

تركيز هذه الدراسة لإثبات هذه التقنية إيمونوستينينج والتصور الجامع-جبل كطريقة مثالية لتصوير ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البنية والخلوية المكون.

تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الدهنية، مثل كيفية تغير التفاعلات بين الخلايا وعلم وظائف الأعضاء في الأنسجة الدهنية عند ظروف التمثيل الغذائي المختلفة مثل الصيام والسمنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يحافظ على الهيكل الدهني 3D الأصلي ويتجنب خطوات المعالجة الطويلة التي عادة ما تكون مطلوبة للكيمياء المناعية التقليدية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في بنية الأنسجة الدهنية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أجهزة الجهاز الأخرى، مثل الجهاز العصبي، عن طريق تركيب كامل تلطيخ الدماغ.عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال بسبب الصعوبات في الحصول على مواقع الأنسجة الملكية، وإيجاد فترة التثبيت المناسبة، وتركيزات الأجسام المضادة الأمثل. بعد اكتمال التشريح، نقل الطبق الذي يحتوي على عينات الأنسجة في 1٪ شبهformaldehyde من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم نقل الأنسجة إما إلى 12 أو 24 جيدا خلية لوحة ثقافة لغسل أسرع.من المهم أن نتذكر أن إجراء تلوين كامل جبل يجب أن تبدأ مباشرة بعد تشريح وأنه لا توجد نقاط وقفة بين كل خطوة. اغسل الأنسجة باستخدام PBS-0.3T على شاكر مائل عند 22 درجة بسرعة تتراوح بين 20 و25 ميلًا في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذا غسل مرتين إضافيتين.بعد هذا، إضافة ما يقرب من 0.5 إلى ملليلتر واحد من العازلة حظر تحتوي على مصل الحيوانات 5٪. احتضان لوحة على شاكر باستخدام الشروط السابقة لمدة ساعة واحدة. التعرق حل الحجب، وإضافة على ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PBS-0.3T مع مصل الحيوانات 1٪ إلى كل بئر.احتضان لوحة بين عشية وضحاها على شاكر في أربع درجات مئوية مع ميل من 22 درجة وسرعة من 20 إلى 25 يميل في الدقيقة الواحدة. في اليوم التالي، استخدم PBS-0.3T لغسل الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذا غسل مرتين إضافيتين.ثم، إضافة بين 0.5 وميليلتر واحد من المناسب ومخففة حلول الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، اغسل الطبق مرتين مع PBS-0.3T في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسل.إذا كان هناك حاجة إلى تصور قطرات السائل أثناء وصمة عار الدهون محايدة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X مع كل غسل يدوم خمس دقائق. إضافة وصمة عار الدهون محايدة مخففة في برنامج تلفزيوني، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لبدء التصوير، استخدم ملقط لوضع الأنسجة المسطحة على زلة غطاء زجاجي 24 في 60 ملليمتر.إذا كان من المطلوب تلطيخ النوى مع DAPI، إضافة واحدة إلى 2 قطرات من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI لغمر الأنسجة تماما ومنعها من التجفيف. ثم، ضع الشريحة على نظام مجهر ليزر مقلوب. للحصول على صور للأنسجة الملوّقة كاملة التركيب في عدة طائرات محورية، قم بأداء رصّات Z من 100 إلى 150 ميكرومتر في العمق مع حجم الخطوة من أربعة إلى ستة ميكرومترات في التكبير المطلوب.في هذه الدراسة، يتم استخدام تلطيخ كامل للحفاظ على بنية الأنسجة الدهنية. على عكس الطرق التي تنطوي على خطوات معالجة متعددة والقسم ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تشويه مورفولوجيا الأنسجة الدهنية ، يمكن أن تحافظ طريقة تلطيخ التركيب بالكامل على مورفولوجيا الخلايا الشحمية ، مما يضمن الدقة عند تفسير النتائج. الإفراط في الأنسجة الدهنية يؤدي إلى الفلورسيات المثبتة التي تسبب، والتي يمكن الإشارة إليها من قبل المناطق متطابقة متداخلة، كما هو الحال في إشارات التيروزين هيدروكسيلاس و PECAM-1 ينظر هنا.غير أن عينات البقع المثبتة بشكل صحيح، والمركبة الكاملة، تظهر إشارات منفصلة ومتميزة، مما يشير إلى أن هذه الإشارات ليست تلقائية الفلوروس. التصوير كامل جبل الأنسجة الدهنية الملون يسمح لك quantism للتغيرات المورفولوجية تحت ظروف تجريبية مختلفة. على وجه الخصوص، هو الأنسجة الدهنية الأوعية الدموية للغاية، وهو أمر مهم في التوسط التوازن الأيضي على التغيرات السريعة في مستوى الطاقة.على سبيل المثال ، C57 الأسود 6J الفئران ، التي تمر 24 ساعة من الصيام ، وعرض أصغر بكثير من حجم adipocyte ، مما يدل على تحلل الدهون ، واتجاه في ارتفاع كثافة الأوعية الدموية بالمقارنة مع الفئران التي تتغذى باستمرار. إزالة الأنسجة الدهنية مع iDISCO + تمكن الأنسجة الدهنية لتصبح شفافة بصريا. يُظهر التميّز المناعي للأنسجة الدهنية التي مرت عبر إزالة الأنسجة الاربورية العصبية الأكثر كثافة مقارنة بتلك التي لوحظت في تلوين الماونت بالكامل دون إزالة الأنسجة في نفس التكبير.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر عدم الإفراط في وضع العينات الخاصة بك لأكثر من ساعة في درجة حرارة الغرفة في PFA ، وإلا ، فإن هذا سيزيد من الفلوروس الخلفية. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الفترة التثبيت طويلة إذا تم تثبيت العينات في أربع درجات مئوية. بعد هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل القياس الكمي باستخدام ImageJ ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية تغيير البنية الخلوية ، مثل مواقع الخلايا الدهنية وكثافة الأوعية الدموية ، استجابة للظروف الفسيولوجية المختلفة.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

الالتصنت المناعي من الخصيتين Drosophila جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

استكشاف بنية الأنسجة الدهنية من ميثيل ساليسيلات المقاصة والتصوير ثلاثي الأبعاد

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...